表達乳鐵蛋白的基因工程重組菌株及其應用的製作方法
2023-08-03 14:09:11
專利名稱：表達乳鐵蛋白的基因工程重組菌株及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種全新的產品，它能在體內傳遞有活性的乳鐵蛋白多肽，並用於預防和治療多種疾病。本發明的方法是將乳鐵蛋白基因克隆到益生菌，通常是乳酸菌如乳球菌和乳桿菌的表達載體上，用電轉化方法獲得轉乳鐵蛋白基因的重組菌株。通過蛋白雜交及生物活性測定，證明得到的重組菌株確實能夠產生有生物活性的乳鐵蛋白多肽。然後用一種或多種重組益生菌菌株製成不同的製劑如口服液、凍乾粉壓片、膠囊或噴霧劑，提供給患者，使其在消化道和陰道或其它黏膜處及體表能表達乳鐵蛋白，由於所使用的益生菌不僅不生產任何對人體有害的毒素，而且對人體健康還有不同程度的促進作用，益生菌在人體內能夠不斷地繁殖，因而我們能夠利用這種重組的益生菌成為在體內製造這種生物活性蛋白的「工廠」，這也是在體內傳遞有生物活性的乳鐵蛋白的一種全新的方法，從而達到預防和治療多種疾病的目的。
乳鐵蛋白是一種天然的非血紅素鐵結合糖蛋白，屬於轉鐵蛋白家族的一員。上個世紀六十年代首次在牛初乳中發現的。其分布很廣，主要存在於母乳中，尤其於初乳中含量最高。它是母乳中含量第二多的蛋白質，佔普通母乳蛋白質的10-20％。除乳汁外，其他的消化、呼吸和生殖系統的外分泌液中也含有一定量的乳鐵蛋白，如淚液、精液、唾液、滑液等。血液中也能檢測到乳鐵蛋白的存在。血液中的乳鐵蛋白來自於噬中性粒細胞，噬中性粒細胞在炎症處被激活後會合成並釋放出乳鐵蛋白。
人乳鐵蛋白是分子量為78kDa的單體糖蛋白，其在不同的種屬中分別含1-4個多聚糖。牛與人的乳鐵蛋白分別含689和691個胺基酸，其同源性為69％。兩者的三維結構非常相似。每個乳鐵蛋白由兩個相同的葉組成，分別命名為N-和C-葉。每個葉又可分為兩個亞葉，亞葉之間形成一個裂縫。此裂縫通過一個雙碳酸根離子與Fe3+的協同作用牢固結合Fe3+，每分子可結合兩個Fe3+。乳鐵蛋白具有促鐵吸收、免疫調節、抑菌、殺菌、抗病毒、阻斷氧自由基、調節骨隨細胞的生長和促進腸道內益生菌生長等功能。最新研究顯示乳鐵蛋白還有預防和抑制大腸癌發生和擴散的作用。此外，它還能抑制C型肝炎病毒的增殖，而且沒有副作用。現已發現去糖基化蛋白保留了天然乳鐵蛋白的所有生物功能。乳鐵蛋白的穩定性是隨PH、鹽離子濃度和環境其它因素而改變。在酸性條件下，乳鐵蛋白非常穩定，對體內一些蛋白酶不敏感。大量試驗證明被蛋白酶水解的一些乳鐵蛋白多肽仍具有抗菌活性，如lactoferricin H(包含N端1-47胺基酸)，其抑菌和殺菌活性比完整的乳鐵蛋白還高。乳鐵蛋白的N1端參與與LPS的結合，乳鐵蛋白還與溶菌酶，肝素、和DNA結合。
由於乳鐵蛋白的重要生理功能，自其發現的近四十年來，吸引了眾多科學家的興趣，目前已對其結構特徵和生理功能有相當的了解，對其進行商業化開發的時機已經成熟。由於乳鐵蛋白具有以上的生理功能，所以其在國外得到廣泛的應用。多年來乳鐵蛋白主要用作乳製品添加劑和嬰幼兒食品添加劑，模仿母乳，提高抗病菌能力。在乳製品中乳鐵蛋白與益生菌混用，作為運動員營養的一部分。生產片劑或速溶飼料，用作寵物食品，抗病毒。作為功能食品，增加鐵的可溶性和幫助對鐵的吸收，用於兒童和孕婦的補鐵製品。添加到化妝品中，用於抗氧化，抗衰老，甚至用於口腔保護劑和口香糖，改善口腔衛口等。市售多種奶粉、鮮奶，多不含乳鐵蛋白，這是因為其產品製造過程中，加熱、殺菌等程序，破壞了乳鐵蛋白。目前商業化的乳鐵蛋白來源主要有兩種1)從牛奶中直接提取，用作保健品、飲料、嬰兒食品、口腔護理以及化妝品等。2)基因工程表達的重組人乳鐵蛋白。表達系統有用麴黴菌表達和轉基因牛，表達後經提純為蛋白質純品，用作臨床藥物的開發。
目前臨床實驗表明，大劑量的乳鐵蛋白才有較好的預防和治療效果，由於以上兩種方法產量低，生產成本高，不能滿足人們對乳鐵蛋白的需求。因而，需要發展一種更有效和更經濟的方法生產乳鐵蛋白。我們發明的用表達乳鐵蛋白多肽的基因工程重組益生菌菌株在體內傳遞乳鐵蛋白的方法，具有生產工藝簡單、成本低、療效好的巨大優勢，將取代其它幾種方法。
本發明提供了獲得表達乳鐵蛋白多肽的重組益生菌的方法，並提供了生產這種重組益生菌菌株的方法和其在動物和人體內的應用。本發明也提供了新的益生菌表達載體的構建，特別是乳酸菌中乳球菌和乳桿菌質粒的構建，它使乳鐵蛋白多肽能夠表達，並具有一定的生物學活性。
本發明方法包括以下步驟1.本發明構建了帶有乳鐵蛋白基因的各種不同的益生菌表達載體。
益生菌主要包括原核革蘭氏陽性細菌和真核酵母菌，而原核革蘭氏陽性細菌主要是指一些有利於人和畜牧身體健康的乳酸菌，如雙歧桿菌、乳桿菌、乳球菌和鏈球菌。基因工程乳酸菌的研究起步較晚，由於乳酸菌自身遺傳特性比較複雜性，其技術難點主要集中在質粒的構建和蛋白的表達。真核蛋白表達的難度大，與大腸桿菌相比，表達量極低。不同質粒、不同啟動子及不同信號肽都對外源蛋白的表達影響很大。
本發明採用幾種乳酸菌能識別的強啟動子及信號肽等元件，構建了多種誘導和非誘導型胞內和胞外表達的乳酸菌表達質粒，這些質粒可游離地存在於乳酸菌中。
另外，將這些質粒中包括乳鐵蛋白基因在內的表達元件部分通過酶切、連接等方法克隆到乳酸菌整合質粒，如pG+host、pJIM2481或Tn916、Tn917、Tn919等轉座子上，從而整合到乳酸菌染色體中，構建了可持續、穩定表達乳鐵蛋白基因的重組乳酸菌菌株。
酵母表達體系最大的優點在於它屬於真核生物表達系統，能夠進行蛋白質修飾作用，而且酵母為單細胞生物，生長速度快，便於進行分子生物學操作。
在酵母中表達外源基因和分泌外源蛋白必須具備下列條件酵母識別的強啟動子，信號肽序列，轉錄終止信號，翻譯終止密碼子，合適的表達框架等。本發明採用帶有酵母磷酸甘油酸激酶(Phosphoglycerate Kinase，PGK)基因啟動子和轉錄終止信號的表達載體，在啟動子後插入酵母天然信號肽——MFα1信號肽編碼序列和乳鐵蛋白基因序列，從而構建了可在酵母菌中分泌表達重組乳鐵蛋白或多肽片段的表達質粒。
2.本發明構建了能穩定表達具有生物學活性的乳鐵蛋白多肽的益生菌菌株。
上述含有乳鐵蛋白基因或基因片段的相應表達載體，通過電轉化的方法，分別轉入酵母菌、雙歧桿菌、乳桿菌、乳球菌、鏈球菌、腸球菌、明串珠菌、利斯特氏菌、和芽胞桿菌中，游離存在或整合到染色體上，得到能穩定表達具有生物學活性的乳鐵蛋白多肽的重組益生菌菌株。
重組菌株經發酵誘導後，提純所表達的乳鐵蛋白，用標準品作對照，用已建立好的乳鐵蛋白生物活性的檢測方法證明重組益生菌分泌出的乳鐵蛋白本身具有生物活性。
3.提供了利用上述重組益生菌在動物或人體內生產和傳遞乳鐵蛋白多肽的方法及應用。
重組菌株分別用適宜培養基培養，得到的發酵液可製備成各種劑型，如口服液噴霧劑、膠囊、或片劑，施用於消化道、陰道或其它黏膜處，用於治療或預防病毒或細菌引起的傳染病，抑制腫瘤細胞生長、緩解腫瘤病人經放化療後引起的消化道功能紊亂、促進患者胃腸道內益菌群如雙歧桿菌的生長和提高機體免疫能力。
本發明具有以下優點1.採用益生菌自身表達載體，可以穩定高效表達外源基因。
2.所用的益生菌本身對人和畜牧是安全的，不產生內外毒素，同時對人和畜牧的身體健康還有促進作用，如某些益生菌能夠維持人體腸道內固有菌群的平衡，對腸道致病菌有拮抗和抑制作用，對調整腸道菌群失調和治療急慢性腹瀉有良好的效果，同時能降低血內毒素水平，提高人體免疫力。
3.直接使用能夠表達人乳鐵蛋白基因的重組益生菌，不需經過蛋白純化，此產品生產工藝簡單，成本低。
4.重組益生菌可以在人和動物體內不斷繁殖，在一定時期內持續表達並提供給機體乳鐵蛋白，具有很好的特異性和有效性。
以下通過實施例和附圖對本發明作進一步詳細說明。這些實施例和
本發明優選的實施方案，因此不被認為限制其範圍。此發明應包括其它等效的實施方案。
圖1表示乳酸菌表達載體pLA311的構建過程。其中，PnisA為啟動子，SPusp為信號肽序列。
圖2表示乳酸菌表達載體pLA313的構建過程。其中，PslpA為啟動子，SPslpA為信號肽序列。
圖3表示乳酸菌表達載體pLA315的構建過程。其中，P59為啟動子，SPusp為信號肽序列。
圖4表示乳酸菌表達載體pLA317的構建過程。其中，P32為啟動子，SPusp為信號肽序列。
實施例1乳酸菌表達載體pLA311和pLA319的構建質粒pLA141來源於乳酸菌質粒pGK，有colE1和pWV01複製子，可以在大腸桿菌和乳酸菌中複製，帶有乳球菌NisA啟動子和乳球菌Usp45信號肽，在Nisin誘導下可啟動其後外源基因的表達，表達的重組蛋白在信號肽的牽引下分泌至胞外。
根據已發表的人乳鐵蛋白cDNA序列，設計合成兩段引物上遊agcgatgcatcaggccgtaggagaaggagtgtt下遊agcgactagtttacttcctgaggaattcacaggcttc在兩段引物中分別引入NsiI位點和SpeI位點，以人乳鐵蛋白cDNA為模板，PCR擴增人乳鐵蛋白基因。
反應條件為94℃變性5分鐘，以下循環94℃變性30秒，65℃退火30秒，72℃延伸3分鐘，共30個循環。
將PCR產物用限制性內切酶NsiI和SpeI消化，將得到的人乳鐵蛋白基因連接到pLA141質粒的NsiI-SpeI位點，電轉化乳酸乳球菌NZ9000，篩選氯黴素抗性的轉化子，提取質粒，經酶切鑑定，PCR擴增及測序，證明人乳鐵蛋白基因已插入pLA141，序列正確，重組質粒命名為pLA311。
具體過程見圖1將重組質粒pLA311用限制性內切酶BamHI和NsiI消化，切除質粒上的usp45信號肽序列，再加入klenow片段補平酶切後的粘性末端，質粒白連後轉化乳酸乳球菌NZ9000，篩選氯黴素抗性的轉化子，提取質粒，經酶切鑑定，PCR擴增及測序，證明序列正確，得到的重組質粒命名為pLA319實施例2乳酸菌表達載體pLA313和pLA321的構建質粒pLA178來源於乳酸菌質粒pGK，有colE1和pWV01複製子，可以在大腸桿菌和乳酸菌中複製，帶有乳球菌slpA啟動子和slpA信號肽，可高效啟動外源基因的表達。將PCR得到的人乳鐵蛋白基因用限制性內切酶NsiI和SpeI消化，得到的片段連接到pLA178質粒啟動子和信號肽後的的NsiI-SpeI位點，構建出可在乳酸菌中持續高效表達乳鐵蛋白基因的重組表達載體，電轉化乳酸乳球菌MG1363，篩選氯黴素抗性的轉化子，提取質粒，經酶切鑑定，PCR擴增及測序，證明人乳鐵蛋白基因已插入pLA178，序列正確，重組質粒命名為pLA313。pLA313在乳酸菌中表達的乳鐵蛋白可分泌至胞外。
具體過程見圖2將重組質粒pLA313用限制性內切酶BamHI和NsiI消化，切除質粒上的slpA信號肽序列，再加入klenow片段補平酶切後的粘性末端，質粒自連後轉化乳酸乳球菌MG1363，篩選氯黴素抗性的轉化子，提取質粒，經酶切鑑定，PCR擴增及測序，證明序列正確，得到的重組質粒命名為pLA321實施例3乳酸菌表達載體pLA315和pLA323的構建質粒pLA136來源於乳酸菌質粒pIL252，有colE1和p AMβ1複製子，在大腸桿菌和乳酸菌中都能複製，帶有乳球菌P59啟動子和乳球菌Usp45信號肽，將PCR得到的人乳鐵蛋白基因用限制性內切酶NsiI和SpeI消化，得到的片段接入啟動子和信號肽後的NsiI-SpeI位點，構建帶有乳鐵蛋白基因的重組表達載體，電轉化乳酸乳球菌MG1363，篩選氯黴素抗性的轉化子，提取質粒，經酶切鑑定，PCR擴增及測序，證明人乳鐵蛋白基因已插入pLA136，序列正確，重組質粒命名為pLA315。。該載體在乳酸菌中可持續表達乳鐵蛋白，生成的乳鐵蛋白能夠分泌到胞外。
具體過程見圖3將重組質粒用限制性內切酶BamHI和NsiI消化，切除質粒上的Usp45信號肽序列，再加入klenow片段補平酶切後的粘性末端，質粒自連後轉化乳酸乳球菌MG1363，篩選氯黴素抗性的轉化子，提取質粒，經酶切鑑定，PCR擴增及測序，證明序列正確，得到的重組質粒命名為pLA323實施例4乳酸菌表達載體pLA317和pLA325的構建質粒pLA176來源於乳酸菌質粒pGK，有colE1和pWV01複製子，可以在大腸桿菌和乳酸菌中複製，帶有乳球菌P32啟動子和乳球菌Usp45信號肽，可啟動外源基因的表達。將PCR得到的人乳鐵蛋白基因用限制性內切酶NsiI和SpeI消化，得到的片段接入該質粒啟動子和信號肽後的NsiI-SpeI位點，構建帶有乳鐵蛋白基因的重組表達載體，電轉化乳酸乳球菌MG1363，篩選氯黴素抗性的轉化子，提取質粒，經酶切鑑定，PCR擴增及測序，證明人乳鐵蛋白基因已插入pLA176，序列正確，重組質粒命名為pLA317。該載體在乳酸菌中可持續表達乳鐵蛋白基因，生成的乳鐵蛋白能夠分泌到胞外。
具體過程見圖4將重組質粒用限制性內切酶BamHI和NsiI消化，切除質粒上的Usp45信號肽序列，再加入klenow片段補平酶切後的粘性末端，質粒自連後轉化乳酸乳球菌MG1363，篩選氯黴素抗性的轉化子，提取質粒，經酶切鑑定，PCR擴增及測序，證明序列正確，得到的重組質粒命名為pLA325實施例5重組表達載體pLA312和pLA320的構建根據已發表的人乳鐵蛋白cDNA序列，設計合成兩段引物上遊agcgatgcatcaggccgtaggagaaggagtgtt下遊agcgaggttcttagatacactggatgggggagtctct在兩段引物中分別引入NsiI位點和EcoRI位點，以人乳鐵蛋白cDNA為模板，PCR擴增人乳鐵蛋白基因編碼前47個胺基酸的基因片段。
反應條件為94℃變性5分鐘，以下循環94℃變性30秒，65℃退火30秒，72℃延伸30秒，共30個循環。
將PCR產物用限制性內切酶NsiI和EcoRI消化，將得到的基因片段連接到pLA141質粒的NsiI-EcoRI位點，電轉化乳酸乳球菌NZ9000，篩選氯黴素抗性的轉化子，提取質粒，經酶切鑑定，PCR擴增及測序，證明人乳鐵蛋白基因片段已插入pLA141，序列正確，重組質粒命名為pLA312。
將重組質粒用限制性內切酶BamHI和NsiI消化，切除質粒上的信號肽序列，再加入klenow片段補平酶切後的粘性末端，質粒自連後轉化乳酸乳球菌NZ9000，篩選氯黴素抗性的轉化子，提取質粒，經酶切鑑定，PCR擴增及測序，證明序列正確，得到的重組質粒命名為pLA320。
實施例6重組表達載體pLA314和pLA322的構建將PCR得到的人乳鐵蛋白前47個胺基酸的基因片段用限制性內切酶NsiI和EcoRI消化，得到的片段連接到pLA178質粒的NsiI-EcoRI位點，電轉化乳酸乳球菌MG1363，篩選氯黴素抗性的轉化子，提取質粒，經酶切鑑定，PCR擴增及測序，證明基因片段已插入pLA178，序列正確，重組質粒命名為pLA314。
將重組質粒用限制性內切酶BamHI和NsiI消化，切除質粒上的信號肽序列，再加入klenow片段補平酶切後的粘性末端，質粒自連後轉化乳酸乳球菌MG1363，篩選氯黴素抗性的轉化子，提取質粒，經酶切鑑定，PCR擴增及測序，證明序列正確，得到的重組質粒命名為pLA322。
實施例7採用電轉化法，將上述幾種重組質粒分別轉入乳球菌中。
將重組表達載體pLA313、pLA314、pLA315、pLA317、pLA321、pLA322、pLA323、pLA325分別與乳酸乳球菌MG1363感受態細胞在電轉杯中混勻，電擊，塗到含氯黴素的培養基上，篩選轉入重組質粒的菌株。
乳酸乳球菌NZ9000是將Nisin抗性基因轉入MG1363染色體中得到的工程菌，可在Nisin存在的條件下正常生長，將帶有PnisA啟動子的重組質粒轉入NZ9000中，可加入Nisin誘導質粒表達外源基因。將重組表達載體pLA311、pLA312、pLA319、pLA320與乳酸乳球菌NZ9000感受態細胞在電轉杯中混勻，電擊，塗到含氯黴素的培養基上，篩選轉入重組質粒的菌株。
實施例8採用電轉化法，將上述幾種重組質粒分別轉入乳桿菌中。
將重組表達載體pLA313、pLA314、pLA315、pLA317、pLA321、pLA322、pLA323、pLA325分別與乾酪乳桿菌感受態細胞在電轉杯中混勻，電擊，塗到含氯黴素的MRS培養基上，在厭氧箱中培養，篩選轉入重組質粒的菌株。
乾酪乳桿菌NY1000是將Nisin抗性基因轉入乾酪乳桿菌染色體中得到的工程菌，可在Nisin存在的條件下正常生長，將帶有PnisA啟動子的重組質粒轉入NY1000中，可加入Nisin誘導質粒表達外源基因。將重組表達載體pLA311、pLA312、pLA319、pLA320與乾酪乳桿菌NY1000感受態細胞在電轉杯中混勻，電擊，塗到含氯黴素的培養基上，在厭氧箱中培養，篩選轉入重組質粒的菌株。
實施例9重組菌株表達乳鐵蛋白將得到的重組乳球菌、乳桿菌分別在含有對應抗生素的GM17和MRS培養基中靜置培養過夜，對帶有NisA啟動子的重組菌株，待其達到生長對數期O.D.值為0.5左右時，加入誘導劑Nisin，誘導2-3個小時，收穫菌體。對非誘導的重組菌株，待其生長到達平臺期時收穫。收穫的菌株經常規處理後，進行Western雜交驗證蛋白表達首先進行SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳，然後轉膜，與兔抗人乳鐵蛋白抗體雜交。
結果證明，在轉入分泌型重組質粒pLA311、pLA313、pLA315、pLA317、pLA312、pLA314的菌株培養液上清中有重組乳鐵蛋白，蛋白大小與從Sigma購買的人乳鐵蛋白標準品大小相同。在轉入非分泌型重組質粒pLA319、pLA321、pLA323、pLA325、pLA320、pLA322的菌株細胞內有重組乳鐵蛋白，蛋白大小與從Sigma購買的人乳鐵蛋白標準品大小相同。
實施例10重組益生菌菌株表達的乳鐵蛋白多肽的生物活性測定採用從Sigma購買的人乳鐵蛋白作為標準品，通過體外分析測定標準品及重組乳鐵蛋白對大腸桿菌及弗氏志賀菌的抗微生物作用。
將大腸桿菌和弗氏志賀菌在適宜培養基上培養至對數生長期，分別加入不同濃度的標準品及重組乳鐵蛋白，37℃震蕩培養，在各個時間段等份取出，連續稀釋並鋪板培養過夜用於計數。結果發現重組乳鐵蛋白和標準品的抗微生物作用基本相同。
實施例11重組菌株的應用。
重組乳球菌、乳桿菌分別用GM17和MRS培養基靜置培養，口服液、或將菌體凍幹製成膠囊和片劑。得到的發酵液可直接製備成口服液、噴霧劑、或加入保護劑製成凍乾粉，然後製成膠囊或片劑，施用於消化道、陰道或其它黏膜處，用於治療或預防病毒或細菌引起的傳染病，抑制腫瘤細胞生長、緩解腫瘤病人經放化療後引起的消化道功能紊亂、促進患者胃腸道內益菌群如雙歧桿菌的生長和提高機體免疫能力。
權利要求
1.一種新的表達乳鐵蛋白多肽的基因工程重組益生菌菌株，其特徵為帶有乳鐵蛋白基因的表達元件整合到其染色體上或存在於游離質粒中。
2.權利要求1中所述的乳鐵蛋白來自人、牛或豬的乳鐵蛋白，包括天然的全長的乳鐵蛋白、乳鐵蛋白多肽片段。
3.權利要求1中所述的益生菌為原核革蘭氏陽性細菌和真核酵母菌。
4.權利要求3中所述的原核革蘭氏陽性細菌為乳酸菌，包括雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、乳球菌屬(Lactococcus)、鏈球菌屬(Streptococcus)、腸球菌屬(Enterococcus)、明串珠菌屬(Leuconostoc)、利斯特氏菌屬(Listeria)、或芽胞桿菌屬(Bacillus)。
5.權利要求4中所述的雙歧桿菌為青春雙歧桿菌(B.adolescentis)或長雙歧桿菌(B.longum)。
6.權利要求4中所述的乳桿菌為乾酪乳桿菌(L.casei)或米酒乳桿菌(L.sake)或植物乳桿菌(L.plantarum)。
7.權利要求4中所述的乳球菌為乳酸乳球菌(L.lactis)。
8.權利要求4中所述的鏈球菌為格氏鏈球菌(S.gordoni)。
9.權利要求4中所述的腸球菌為糞腸球菌(E.faecalis)。
10.權利要求4中所述的利斯特氏菌為無害利斯特氏菌(L.innocua)。
11.權利要求4中所述的芽胞桿菌為枯草芽孢桿菌(B.subtilis)或蠟樣芽孢桿菌(B.cereus)。
12.權利要求4中所述的真核酵母菌為釀酒酵母(Saccharomyces serevisiae)。
13.一種用於轉化益生菌的質粒，其特徵在於含有下列從5』到3』連接的調控因子啟動子、編碼乳鐵蛋白基因序列、轉錄終止子。
14.權利要求13中所述啟動子，是適用於相應重組益生菌菌株的啟動子，包括選自乳球菌NisA基因、短乳桿菌SlpA基因、乳球菌P59、乳球菌P32啟動子、乳球菌P23啟動子或酵母磷酸甘油酸激酶(Phosphoglycerate Kinase，PGK)基因啟動子。
15.權利要求13中所述轉錄終止子，是適用於相應重組益生菌菌株的轉錄終止子，包括選自人乳頭瘤病毒E7基因、乳球菌Usp45基因、短乳桿菌SlpA基因或酵母磷酸甘油酸激酶(Phosphoglycerate Kinase，PGK)基因轉錄終止信號。
16.權利要求13中所述的質粒，可進一步包含分泌信號肽。
17.權利要求16中所述分泌信號肽，是適用於相應重組益生菌菌株的分泌信號肽，包括選自短乳桿菌SlpA基因、乳球菌Usp45基因或酵母MFα1信號肽編碼序列。
18.權利要求13中所述的質粒，可進一步包含適用於相應重組益生菌菌株的複製起始子，包括選自乳酸菌pWV01、pAMβ1複製子或大腸桿菌colE1複製子。
19.含有權利要求13所述的重組質粒的益生菌菌株，包括重組乳酸乳球菌CGMCC-0622、CGMCC-0623。
20.一種新的傳遞乳鐵蛋白多肽的方法，其特徵是利用可接受藥用載體在消化道、女性生殖道、或其它黏膜處及體表施用權利要求1或權利要求19所述的表達乳鐵蛋白多肽的重組益生菌菌株。
21.權利要求1中所述重組益生菌菌株經發酵後，一種或多種菌株混合製成口服液、噴霧劑、膠囊、或片劑，用於治療或預防病毒或細菌引起的傳染病，抑制腫瘤細胞生長、緩解腫瘤病人經放化療後引起的消化道功能紊亂、促進患者胃腸道內益生菌群的生長和提高機體免疫能力；並可用於食品、保健品。
全文摘要
本發明闡述用分子生物學技術構建含有乳鐵蛋白基因的表達載體，並通過電轉化法轉入益生菌中，得到穩定表達人內皮細胞抑制素基因的重組益生菌菌株。一種或多種重組菌株經發酵處理後作為口服製劑，通過口服，在體內表達有活性的乳鐵蛋白及其多肽片段。所表達的乳鐵蛋白及其多肽片段能夠治療和預防病毒引起的傳染病，抑制腫瘤細胞的生長，緩解腫瘤病人經放化療後引起的消化道功能紊亂、促進患者胃腸道內益生菌群的生長和提高機體免疫能力；並可用於食品、保健品。
文檔編號C12P21/00GK1407108SQ0114200
公開日2003年4月2日 申請日期2001年9月6日 優先權日2001年9月6日
發明者胡放, 王春香 申請人:胡放, 王春香