篩選治療劑的方法

2023-08-04 04:14:26

專利名稱：篩選治療劑的方法
技術領域：
本發明涉及核苷酸序列，特別是授予TGFβ和活化素和結合Smad蛋白的轉錄調控序列，涉及該序列在例如篩選用於治療與Smad-介導的TGFβ-誘導的基因不正常表達相關的疾病的藥劑中的用途。
β轉化生長因子(TGFβ)屬於細胞因子家族，包括活化素和骨形態發生蛋白，其由很多細胞類型合成並且具有多種細胞和生物作用，包括控制增殖，分化，遷移，免疫性和調節胞外基質的更新。其中很多涉及TGFβ，以TGFβ-1為例，作為轉錄激活因子而起作用。已知幾種啟動子由TGFβ誘導，包括1型纖溶酶原激活物抑制劑(PAl-1)，α2(Ⅰ)前膠原，TGFβ-1本身，種系Ⅰgα恆定區，依賴於細胞周期蛋白的激酶(CDK)抑制劑p21和p15。
蛋白質Smad家族成員在通過沒有完全闡明的機理介導TGFβ和活化素轉錄活化中起著必不可少的作用。已經證明果蠅屬MAD定向進化同源蛋白的氨基末端部分結合對於轉錄調控是重要的退化基因的增強子(Kim等，自然，1997，388，304-308)。非洲爪蟾屬Smad2和Smad4蛋白是稱之為活化素-應答因子(ARF)也包含FAST-1轉錄因子的蛋白質複合體的成分。ARF結合誘導活化素的非洲爪蟾屬Mix.2啟動子的能力是FAST-1賦與的並且提出Smad2/Smad4作為輔激活物起作用(Chen等，自然，1996，383，691-696；Chen等，自然，1997，389，85-89)。在涉及TGFβ信號的那些Smad蛋白中，已知Smad6和7作為TGFβ信號途徑的抑制劑而起作用，已知Smad2和3介導TGFβ信號途徑，並且已知Smad4形成包含至少Smad2和3的異型寡聚物(Heldin等，自然，1997，390，465-471)。已經證明Smad4結合製備的構建物的DNA序列，但是這種結合活性不帶來依賴TGFβ的轉錄活性作用(Yingling等，分子細胞生物學(Mol.Cell.Biol.)，1997，17，7019-7028)。
現在我們證明了包括兩種蛋白質Smad3和Smad4和DNA的複合體的存在，並且證明Smad3，Smad4是DNA結合蛋白。我們還證明在外顯子中剪接的Smad2是一種DNA結合蛋白。此外，我們鑑定了TGFβ響應啟動子中的Smad3/4-結合序列並且證明Smad3/4的結合對於TGFβ誘導的轉錄作用是必須的。
已知很多疾病狀態與TGFβ控制的基因表達的變異有關，包括纖維變性疾病，異常的傷口癒合，異常的骨生成，癌發生，造血，神經保護和免疫和炎症疾病。研究最多的是PAL-1基因，其是TGFβ激活的基因之一。由幾種細胞類型產生PAL-1蛋白質，包括內皮細胞，成纖維細胞，上皮細胞和肝實質細胞。其依靠其對各自催化從纖溶酶原生成纖溶酶的尿激酶(U-PA)和組織纖溶酶原激活劑(t-PA)的抑制作用間接控制絲氨酸蛋白酶纖溶酶的活性。
纖溶酶直接地通過消化基質成分和間接地通過其激活基質降解酶的潛伏形式而在胞外基質的生成和保持中起著重要的作用。纖溶酶的主要作用是去除血纖蛋白凝塊。因此纖溶酶對於維管結構(即血纖蛋白)和基質具有雙重特異性。因為纖溶酶的水平是由PAL-1控制的，因此PAL-1在影響纖溶性平衡和控制纖維病變的量中起著重要作用。調節基質沉積的能力對多種指徵在治療上是重要的，所述指徵包括傷口癒合，肥大傷疤，瘢痕瘤，scleroclerma，肝和膽囊纖維化，肺纖維化，腎纖維化，血管纖維化和術後粘連(Franklin,Int.J.Biochem.CellBiol.,1997,29,78-89)。當前沒有對於纖維變性的治療方法。
我們發現Smad3，Smad4和在外顯子3中剪接的Smad2是DNA結合蛋白，其結合TGFβ激活的啟動子，例如PAL-1，這一發現為開發出治療與通過調節Smad3或Smad4或外顯子3中剪接的Smad2(或者事實上任何包含Smad3或Smad4的蛋白質複合體)與其識別序列的結合或轉錄活性而完成的Smad-介導的TGFβ基因調節相關的疾病的新的方法鋪平道路，從而影響篩選能調節TGFβ-調控基因表達，通過影響包含Smad的複合體(即Smad3和Smad4和在外顯子3中剪接的Smad2)結合其識別序列的程度，或結合於其基因啟動子中的識別序列的Smad的複合體(即Smad3和Smad4和在外顯子3中剪接的Smad2)的轉錄能力而用於治療的基因藥劑的方法。
因此，根據一個方面，本發明提供篩選用於治療與通過Smad和TGFβ或活化素進行的基因調控相關的疾病的試劑的方法，所述方法包括檢測或分析在所述試劑存在下Smad蛋白或其DNA結合片段和包括5'WXYCAGACZ3'或其功能等價物的雙鏈寡核苷酸之間的轉錄活性或結合的程度和結果，其中在所述核苷酸序列中，W代表A或G，X代表G或T，Y代表C，A，G或T且Z代表A或C。
我們將該序列稱之為CAGA盒。如這裡所使用的，術語CAGA盒用來不只是指我們在PAL-1啟動子中鑑定的該序列而且指功能上與這樣一個序列相同的任何序列，即指能各個地或者作為Smad蛋白複合體的一部分結合Smad蛋白，從而使這樣的結合對於這樣的功能等價序列控制下的基因的TGFβ和活化素調節是必須的步驟的任何核苷酸序列。
如這裡所使用的，術語「篩選」包括研究能調節，改變，影響或幹涉Smad蛋白和CAGA盒之間的結合或者與CAGA盒結合的Smad蛋白的轉錄能力的製劑的作用的任何方法或測試，包括其中研究單一試劑或化合物的結合測定法，以及其中測定一種以上化合物，例如一批化合物或一組化合物的測定法.在測試一種以上試劑的情況下，這些測試可以同時或依次進行。這樣的試劑的作用可以是或者幹涉Smad蛋白例如Smad3或Smad4或在外顯子3中剪接的Smad2與CAGA盒序列的結合，或者它們可以增強Smad蛋白和CAGA盒之間的結合。這樣的試劑的作用還可以是調節與CAGA盒序列例如Smad3或Smad4在外顯子3中剪接的或Smad2結合的Smad蛋白的轉錄活性，即降低與CAGA盒結合的包含Smad的複合體的轉錄活性，或者它們增強與CAGA盒結合的包含Smad的複合體的轉錄活性。檢測和測定方法包括是否存在任何結合或轉錄活性，和受試試劑的作用的任何定量，定性或半定量測試。對於篩選治療與Smad3/Smad4/在外顯子3中剪接的Smad2/TGFβ/活化素調控相關的疾病中有治療意義的試劑，其優選是篩選試驗所研究的對Smad3/Smad4/在外顯子3中剪接的Smad2/DNA複合體形成或者轉錄活性有調節作用的化合物。
這裡所使用的術語「Smad蛋白」指具有結合其受體序列(CAGA盒)的或者單獨或者作為蛋白複合體的例如Smad3或Smad4或在外顯子3中剪接的Smad2的Smad蛋白結合特徵的蛋白質或蛋白複合體，並且包括這些蛋白的DNA結合片段，包含這些蛋白的融合蛋白和修飾物，以及指Smad3和Smad4和在外顯子3中剪接的Smad2的蛋白本身。
在一個優選的方面，雙鏈寡核苷酸包括序列AG(C/A)CAGACA，其是我們在PAL-1啟動子中鑑定的序列。我們已經鑑定序列AG(C/A)CAGACA存在於已知介導TGFβ轉錄誘導的區中人PAl-1啟動子中的三個拷貝中。在已知TGFβ可誘導的其它啟動子和增強子包括α2(Ⅰ)前膠原，種系Igα恆定區和TGFβ-1啟動子本身中也已經鑑定出了該序列和與該序列非常相似的包括-CAGA-基序的序列。這些序列在表1中列出並且包括在術語CAGA盒中。
表1
在一個方面，用於本發明篩選試驗的寡核苷酸包括CAGA盒本身。但是，CAGA盒可以包括位於一端或兩端的側翼序列。這樣的序列可以將CAGA盒的一個鏈的長度延長例如3個核苷酸至總共12個核苷酸，或者在一端延長3個核苷酸，或者在一端延長2個核苷酸，而在另一端延長1個核苷酸，或者它們可以將該序列延長6個核苷酸至總共15個核苷酸，所增加的鹼基位於CAGA盒自身的一個終端或分布在其兩端，或者側翼序列可以將CAGA盒的一條鏈進一步延長至總共20個核苷酸或者更多，例如最多30，40或50個核苷酸。在本發明中使用的寡核苷酸可以包括CAGA盒本身，或者延長10個核苷酸，優選延長最多20個核苷酸和優選延長最多50個核苷酸的CAGA盒。任選地帶有側翼序列的CAGA盒可以在本發明中使用的寡核苷酸中重複例如最多50次，優選最多20次，例如最多10次。這裡所使用的術語試驗寡核苷酸包括CAGA盒和以CAGA盒為基礎的所有這些寡核苷酸。優選地，該序列與AP-1結合位點不同。
在一個優選方面，Y代表C，A或G。
對於在本發明方法中的應用，試驗寡核苷酸可以是化學合成的或者它們可以是基因組的或者cDNA片段或者插入到重組載體中的，例如以質粒或噬菌體為基礎的載體。
在一個方面，本發明涉及比較存在試驗試劑下和不存在所述試劑的條件下，Smad蛋白和試驗寡核苷酸之間的結合或者與試驗寡核苷酸結合的包含Smad的蛋白複合體的轉錄活性。
我們證明了在Smad介導的TGFβ誘導中，特別涉及TGFβ誘導的CAGA盒。因此，當克隆在TK啟動子上遊多個拷貝中時，發現CAGA盒序列具有在HepG2細胞中產生TGFβ介導的轉錄誘導的性能，但是該序列的突變形式，AGCTACATA，即包含3個位點突變的序列不具有TGFβ誘導的性能。我們證明了在從缺乏Smad4的乳腺癌衍生的人上皮細胞MDA-MB4648細胞中，在TGFβ介導的誘導中Smad4是必需的，其中TGFβ對於CAGA報導基因結構的表達沒有作用，但是當用編碼Smad4的表達結構共轉染該細胞系時，發現了TGFβ的誘導作用。我們使用HepG2核抽提物的電泳遷移率變動分析(EMSA)，證明了TGFβ和對於不同的Smad蛋白的抗體存在下，CAGA序列的結合性能，表明Smad3和4存在於TGFβ-依賴性CAGA盒結合複合體中，並在表達Smad蛋白的大腸桿菌的存在下，使用EMSA，我們證明Smad3和Smad4具有直接的和特異性DNA-結合活性。此外，我們證明了密切相關的Smad2蛋白不能激活CAGA-介導的轉錄。我們證明了Smad2基因中外顯子3編碼的結構域阻止Smad2結合CAGA序列，而不存在相應於外顯子3的結構域的Smad2形式不能結合併激活自CAGA盒的轉錄。
在TGFβ調節的啟動子的其它TGFβ誘導區，例如α2(Ⅰ)前膠原基因，種系Ⅰgα恆定區基因和TGFβ-1啟動子中鑑定了類似於我們的CAGA盒的序列。這些序列在表1中列出。
用於篩選以單獨或複合體形式調節轉錄能力或一種或幾種Smad蛋白的結合的潛在的有用的藥劑的篩選方法。該複合物位於含有CAGA盒的序列或功能等同序列之上，最終改進Smad-TGFβ誘導調控的基團的表達。
在直接類型的方法中，分析了一種蛋白質(即Smad或者其CAGA結合片段)和一種試驗寡核苷酸或者包含CAGA的核苷酸序列之間的結合複合體的生成。為此可以使用本領域公知的各種各樣的技術，使用具有與CAGA相關的識別序列形成複合體的Smad蛋白作為蛋白質元件，例如哺乳動物Smad3和/或Smad4或在外顯子3中剪接的Smad2蛋白或者其CAGA盒結合片段單獨地或者作為重組多肽的一部分，其可以從本領域公知的細胞或者從表達系統中純化，包括使用細菌例如大腸桿菌的原核表達系統或者真核表達系統例如酵母或杆狀病毒，或者在體外表達系統中，例如以網織紅細胞裂解物為基礎的那些。這樣的技術描述於例如Sambrook等，分子克隆實驗室手冊1989中。特異結合複合體的DNA部分可以包括包含CAGA盒的識別序列的試驗寡核苷酸的寡核苷酸，這些寡核苷酸可以或者化學合成或者是基因組或cDNA片段，或者是例如以質粒或噬菌體為基礎的那些重組載體的一部分。
篩選根據本發明的DNA和蛋白質之間的相互作用的方法是本領域公知的。這樣，可以混合已知量的蛋白質和DNA，並且複合體生成後，可以測定沒有複合的DNA或蛋白質的量。一旦分離了複合體，可以通過各種各樣的技術測定沒有複合的蛋白質，包括例如通過酶聯免疫吸附測定(ELISA)的抗體檢測和標準蛋白質測定技術，例如勞裡測定，雙縮脲測定或Bradford測定。也可以通過本領域公知的各種各樣的技術測定沒有複合的DNA，例如通過用檢測標記探針例如生物素或放射性標記雜交，其中探針可以是固定的或者是存在於溶液中的。多肽和DNA之間的複合體自身也可以使用本身已知的技術測定，包括足跡法，EMSA，閃爍親近測定法(SPA)，biacore或生物晶片/DNA晶片技術。
或者，可以根據其對轉錄的作用測定多肽-DNA複合體生成的程度或者多肽-DNA複合體的轉錄能力。在已知為轉錄篩選的方法中，本發明可以用來篩選激活或抑制自細胞膜至細胞核的TGFβ或活化素轉導途徑的試劑，其最後導致CAGA盒介導的轉錄調控。在這樣的一種方法中，包含CAGA盒的寡核苷酸序列可以在一種載體例如報導基因載體中例如與一種啟動子和/或控制表達可檢測蛋白的核苷酸序列的增強子操作連接的質粒中克隆，所述可檢測蛋白質是例如螢光素酶，鹼性磷酸酶，氯黴素乙醯基轉移酶，β-半乳糖苷酶，其中，在這樣一種結構中，這樣一種報導基因的表達水平可以在報導基因結構瞬時或穩定轉染到真核細胞中後檢測。在這樣一種轉錄篩選中，包含CAGA盒的寡核苷酸序列整合到一種基因的調控區內，其產物可以在體外系統中檢測到，並比較在試驗試劑存在下(和在存在或不存在TGFβ或活化素下)培養的轉染細胞中表達的產物的水平與試驗試劑不存在下(和在存在或不存在TGFβ或活化素下)培養的轉染細胞中表達的產物的水平。
優選地，在該方法的這方面使用的報導基因載體中，將提供合適的表達控制序列，例如除了啟動子/增強子區例如多腺苷酸化信號等等之外的翻譯，例如終止密碼子，起始密碼子和控制因子。
在一個優選的方面，本發明方法可以用來篩選在疾病治療中有潛在應用的試劑，已知TGFβ控制的基因的未調控表達涉及例如纖維變性，異常傷口癒合，癌症，造血或免疫性或炎症疾病。特別是，通過幹涉TGFβ或活化素介導的Smad與DNA的結合或者通過幹涉結合於DNA的Smad的轉錄能力，該試劑將調節1型纖溶酶原激活物抑制劑的合成，從而影響纖溶酶的水平，從而調控基質生成和/或血纖蛋白溶解作用。
從另外一方面看，本發明提供用於篩選適合治療與Smad介導的TGFβ或活化素激活相關的疾病的試劑的試劑盒，所述試劑盒包括-一種如上定義的Smad蛋白-TGFβ或活化素-如上定義的包括序列5'WXYCAGACZ3'的雙鏈DNA分子，所述序列任選地與啟動子序列和其產物是可檢測的基因的編碼區操作連接。
為TGFβ或活化素轉錄調控所必需的，藉助於Smad而完成的本發明的CAGA相關序列的識別提供了治療疾病的新的遺傳學方法，所述疾病是纖維變性，異常傷口癒合，造血或免疫性或炎症疾病和癌症，其與某些基因的TGFβ調控相關。
從另一方面來看，本發明包括與由一種或幾種Smad蛋白和TGFβ或活化素調控的基因調控相關的疾病的治療方法，所述方法包括施用包括如上定義的5'WXYCAGACZ3'序列的雙鏈寡核苷酸。
在這樣一種方法中，通過外源施用的DNA螯合Smad蛋白，從而防止TGFβ介導的內源基團誘導。
從另一方面來看，本發明提供包括如上定義的5'WXYCAGACZ3'序列的分離的雙鏈DNA分子。優選地，該序列是AG(C/A)CAGACA。本發明還提供包括如上定義的試驗寡核苷酸的分離的DNA分子。
從又一方面來看，本發明提供上述篩選鑑定的所有試劑，和它們在治療與Smad/TGFβ基因激活相關的疾病中的用途。
作為又一方面，本發明提供抑制或激活一種或多種Smad蛋白與TGFβ或活化素基因調控中涉及的啟動子或增強子的轉錄活性或結合的任何試劑，所述啟動子包括核苷酸序列5'WXYCAGACZ3'或者其功能等價物，其中在所述核苷酸序列中，W代表A或G，X代表G或T，Y代表C，A或G且Z代表A或C。
這樣的試劑可以是任何類型的分子，包括小的有機分子，蛋白質或多肽，或核酸分子。鑑定為具有期望作用的試劑可以在纖維變性，異常傷口癒合，癌症，造血或免疫性或炎症疾病的合適的模型中進一步試驗。
實施例在已知為轉錄篩選的方法中，本發明可以用來篩選激活或抑制最後導致CAGA盒介導的轉錄調控的自細胞膜至細胞核的TGFβ或活化素轉導途徑的試劑。
可以通過在包含報導基因，例如螢火蟲螢光素酶的質粒中克隆帶有CAGA盒的轉錄區來產生報導基因載體，使得該包含CAGA的轉錄區控制該報導基因的轉錄。特別是，PAl-1啟動子可以克隆在螢火蟲螢光素酶基因的上遊。
或者，可以合成人工結構，其中化學產生的含有CAGA序列的寡核苷酸克隆在一個啟動子或增強子結構中，使得它們控制螢火蟲螢光素酶基因的轉錄。

圖1中描述了這樣的結構，其中CAGA寡核苷酸克隆在TK或MLP啟動子的上遊。這種含有TGFβ誘導的CAGA序列的報導基因載體必定通過各種各樣的和常規的方法轉染到真核細胞中，優選轉染到哺乳動物細胞系中，例如HepG2細胞系，所述方法是例如磷酸鈣沉澱法，DEAE-葡聚糖法，脂質體介導的方法或者電穿孔方法。
優選地，轉染產生穩定表達包含CAGA盒的報導轉基因的克隆細胞系。這一目的可以通過編碼對藥物，例如新黴素或潮黴素的抗性基因的抗性質粒的共轉染，篩選通過抗提到的藥物的抗性質粒的穩定整合獲得的轉染細胞而實現。
優選地，穩定的細胞系穩定整合了另一種轉基因，例如renilla螢光素酶，其表達產物具有可檢測活性。該轉基因的表達應該不受TGFβ或活化素調控，即在其調控區中不包含CAGA序列。例如renilla螢光素酶基因可以從RSV(勞斯肉瘤病毒)啟動子或SV(猿猴病毒40)啟動子轉錄。當篩選改變螢火蟲螢光素酶轉基因的表達的藥劑時，即具有通過CAGA序列所起的作用，renilla螢光素酶轉基因的表達用作特異性對照。這意味著通過CAGA盒-介導的轉錄的特異性作用試劑會對螢火蟲螢光素酶活性具有影響，而對於renilla螢光素酶活性則沒有。特別是，當篩選CAGA盒-介導的轉錄的抑制劑時，renilla螢光素酶活性在特異性抑制CAGA盒-介導的轉錄的試劑和有毒性的那些之間有區別。
測試混合物包括在合適的細胞培養基中培養的轉染細胞和一種或幾種候選藥劑。在篩選抑制劑情況下，為了激活CAGA序列-介導的轉錄，細胞培養基中含有TGFβ或活化素(優選0.1ng/ml至50ng/ml的濃度)。在篩選激活劑的情況下TGFβ或活化素的存在是可有可無的。存在一種或幾種候選藥劑的混合物和沒有所述候選試劑的混合物之間螢火蟲螢光素酶活性的差異表明，這種或這些試劑能調節通過Smad蛋白結合該CAGA序列而介導的轉錄活性。
候選試劑包括多種化合物類型，但是典型地是有機化合物，優選是分子量常常在50和2500之間，更優選小於大約1000的小的有機化合物。候選試劑還包括肽類，糖類，脂肪酸類，甾類，嘌呤，嘧啶，它們的衍生物，結構類似物或組合物在內的生物分子。候選試劑從多種多樣的來源獲得，包括隨機和定向合成，組合化學和合成的或天然的化合物的文庫。
這裡所描述的方法特別適合高產率篩選。為了使該方法自動化，在96孔或384孔微量培養板中接種轉染細胞並培養。對由計算機控制的包括一個軸向可轉動臂的電動機械自動裝置進行編程，以便執行該項試驗的不同步驟細胞接種，用存在或不存在TGFβ或活化素培養基培養，用試驗藥物培養，細胞衝洗和螢光素酶活性揭示。使用商售試劑盒，用常規方法揭示螢光素酶活性，優選使用與電動機械自動裝置連接並且能對微量培養板讀數的雙注射器發光計。
本發明現在將參照下面非限制性實施例描述，其中圖1CAGA盒是TGFβ-可誘導的DNA因子。
圖1A在人PAl-1啟動子中，描述了用粗線框表示相應於人TGFβ的兩個區。給出了在該啟動子中發現的三個CAGA盒的序列。
圖1B用包含HSV1-胸苷激酶啟動子(TK)上遊克隆的CAGA序列的9個拷貝的不同載體轉染HepG2細胞。AGCCAGACA是在PAl-1啟動子中-730位置發現的序列，AGACAGACA是在PAl-1啟動子的另外兩個CAGA盒的序列(位置-580和-280)。最後的構建物包含突變的CAGA盒，如所指出的有三個核苷酸不同。證明了螢光素酶活性並指出了TGFβ誘導的倍數。
圖1C用p3TP-Lux或者包含最小腺病毒主要晚期啟動子(MLP)上遊CAGA盒的9個或12個拷貝的載體轉染HepG2和Mv1Lu細胞。對於HepG2細胞給出了TGFβ誘導的倍數。對於Mv1Lu轉染細胞給出了基礎的和TGFβ誘導的螢光素酶水平。
圖2人PAl-1啟動子的CAGA盒對於TGFβ誘導作用是必需的。通過定點誘變引入PAl-1啟動子中CAGA盒的突變。用突變的AG(C/A)TACATA序列取代野生型AG(C/A)CAGACA位點。畫叉的矩形代表突變的盒。給出了轉染的HepG2細胞在不存在TGFβ的條件下的基礎水平和存在TGFβ的誘導倍數。
圖3對應於TGFβ和活化素信號但是不對應於BMPs途徑的CAGA盒。
圖3A用(CAGA)12-MLP-Luc報導基因結構和編碼TGFβ，活化素或BMPs信號特異性絲氨酸/蘇氨酸激酶受體的組成型激活形式的表達載體共轉染的MvlLu細胞。Alk-2是ActR-1受體，Alk-3是BMPR-1A受體，Alk-4是ActR-1B受體，Alk-2是TGFβR-1受體和Alk-6是BMPR-1B受體。
圖3B用(CAGA)12-MLP-Luc報導基因結構轉染HepG2細胞，並且用BMP-7，活化素或TGFβ(分別為100ng/ml，20ng/ml和10ng/ml)誘導。
圖4CAGA盒介導的TGFβ誘導的轉錄中所涉及的Smad蛋白質。
圖4A用(CAGA)9-MLP-Luc報導基因結構和遞增量的(0，10，15，20，30和40ng)編碼Smad7抑制劑蛋白質的表達載體共轉染的HepG2細胞。
圖4B用(CAGA)9-MLP-Luc報導基因結構編碼Smad4蛋白質的表達載體轉染的MDA-MB468細胞並且和遞增量的(0，250，500，750ng)。如圖所示，用250ng Smad7表達載體和500ng Smad4表達載體共轉染。
圖5Smad3和Smad4直接結合TGFβ誘導的CAGA盒。
圖5A使用包含CAGA序列的33p-標記的探針進行EMSA，並且使用被TGFβ誘導30分鐘或者沒有誘導的HepG2細胞的細胞核抽提物。指明了相應於特異性TGFβ誘導的複合體的帶。加入50或100摩爾過量的各種冷寡核苷酸作為競爭劑，包括野生型和突變的CAGA序列。
圖5B特異性抗-Smad抗血清在與CAGA探針混合之前與TGFβ誘導的HepG2細胞核抽提物培養。指明了超級移動的複合體。在第7和9泳道中加入用來產生反應性抗血清的抗原肽來證明抗-Smad3和抗-Smad4抗血清的特異性。
圖5C表達GST-Smad1，2，3和4蛋白質並且缺失保守的羧基末端MH2區的大腸桿菌與33P-標記的CAGA探針培養。當指示時加入50摩爾過量的冷寡核苷酸競爭劑。向泳道2中的探針加入TGFβ處理過的HepG2細胞的細胞核抽提物以便對細胞核DNA結合的複合體定位。
圖5D圖示了類似的試驗，其中使用了在細菌中產生的與GST區融合的全長Smad蛋白質。
圖6Smad3超表達能模擬TGFβ激活報導基因載體，而Smad2超表達不能。用(CAGA)9-MLP-Luc報導基因載體瞬時轉染HepG2細胞。如圖所示，用Smad表達載體共轉染的細胞被斷絕血清並且不用TGFβ處理。
圖7對決定轉錄失活的Smad2結構域作圖。
圖7A人Smad2和Smad3蛋白質序列。黑框表示兩種蛋白質的序列之間的不同。MH1和MH2分別用直線和虛線在下面劃出。也指明了GAG和TID結構域。
圖7BSmad2和Smad3結構域交換嵌合體圖示。
圖7CHepG2細胞中Smad2和Smad3突變體對(CAGA)9-MLP-Luc報導基因載體的誘導。用(CAGA)9-MLP報導基因載體和等濃度標明的空變結構轉染細胞，並測定沒有TGFβ存在下螢光素酶活性。
圖7D表達Smad2或Smad3突變體的HepG2細胞抽提物的蛋白質印跡分析。轉染後，用Dual-螢光素酶分析試劑盒(Promega)提供的溶胞緩衝液溶解細胞，蛋白質在8.5％SDS-PAGE上分離後用抗Smad2/Smad3多克隆抗體(sc-6032，Santa Cruz)印跡。也用抗-β-肌動蛋白多克隆抗體(sc-1615，Santa Cruz)對溶胞產物免疫印跡，以測定相等的蛋白質負載量。通過化學發光法用與馬過氧化物酶偶聯的二次抗體指明初次抗體。
圖8抑制Smad2結合CAGA序列的TID結構域。
圖8A體外翻譯的Smad2和Smad3突變體的SDS-PAGE分析(上一組)和使用這些體外翻譯的蛋白質對CAGA寡核苷酸的凝膠移位試驗(下一組)。
圖8B使用Smad突變體對突變的CAGA探針的凝膠移位試驗。
實驗方法質粒結構使用pGL3基礎質粒(Promega)產生CAGA報導基因載體。對TK或MLP啟動子進行PCR擴增並且插入到Bgl和HindⅢ位點之間。將包含CAGA盒的寡核苷酸克隆到XhoⅠ位點。克隆的寡核苷酸的序列是包含CAGA盒的寡核苷酸
5＇TCGAGAGCCAGACAAAAAGCCAGACATTTAGCCAGACAC 3＇3＇CTCGGTCTGTTTTTCGGTCTGTAAATCGGTCTGTGAGCT 5＇5＇TCGAGAGACAGACAAAAAGACAGACATTTAGACAGACAC 3＇3＇CTCTGTCTGTTTTTCTGTCTGTAAATCTGTCTGTGAGCT 5＇CAGA突變體寡核苷酸5＇TCGAGAGCTACATAAAAAGCTACATATTTAGCTACATAC 3＇3＇CTCGATGTATTTTTCGATGTATAAATCGATGTATGAGCT 5＇通過將人PAl-1啟動子的PCR擴增的806+72片段插入到pGL3-基礎載體(Promega)的SacⅠ/BgⅢ位點產生PAl-1-Luc載體。使用QuickChange定點誘變試劑盒(Stratagene)根據說明書進行人PAl-1啟動子的定點誘變。為了產生包含或不包含GAG和TID結構域的Smad2和Smad3突變體，通過編碼Smad2和Smad3的表達載體中的定點誘變(QuickChange定點誘變試劑盒，Stratagene)插入AgeⅠ限制位點。類似地將BsmBⅠ限制位點插入Smad3表達載體中。限制位點的插入不改變該蛋白質的胺基酸序列。對所有的結構測序。
細胞培養物從美國典型培養物保藏中心購得人肝癌細胞系HepG2(HB8065)，人乳腺癌細胞系MDA-MB468(HTB132)和Mv1Lu水貂肺上皮細胞系(CCL64)。HepG2和Mv1Lu細胞分別在補充有10％胎牛血清，10mM丙酮酸鈉，100IU/ml青黴素，100μg/ml鏈黴素和2mML-穀氨醯胺的BME或MEM培養基(Life Technologies，Inc.)(完全培養基)中，在5％CO2-95％空氣中生長。MDA-MB468細胞在補充有10％胎牛血清，100IU/ml青黴素，100μg/ml鏈黴素和2mM L-穀氨醯胺的DMEM/F12(1∶1)培養基(Life Technologies，Inc.)(完全培養基)中，在7.5％CO2-92.5％空氣中生長。
轉染和螢光素酶測定使用磷酸鈣共沉澱方法用指明的結構和內控制pRL-TK載體瞬時轉染HepG2和MDA-MB468細胞。當轉染增加量的表達載體時，通過加入pCMV5保持總DNA不變。在用7ng/ml人重組TGFβ1(RD)刺激之前對細胞斷絕血清8小時並且14小時後使用Dual螢光素酶試驗(Promega)定量測定螢光素酶活性。對於活化素和BMP-7(CreativeBiomolecules)誘導，分別使用20ng/ml和100ng/ml。用從pRL-TK表達的renilla螢光素酶活性校正所得值。使用DEAE-葡聚糖方法轉染Mv1Lu細胞。圖中給出的螢光素酶的值代表進行至少三次轉染實驗的結果。
細胞核抽提物從對照和TGFβ-處理的HepG2細胞製備細胞核抽提物。處理後30分鐘收集細胞並且根據Sadowski和Gilman方法加工(Sadowski和Gilman，1993)。簡單地講，用磷酸緩衝鹽水衝洗來自8個10mm皿的融合細胞並刮取。又一次衝洗後，細胞懸浮於2ml冷的緩衝液A(20mM HEPES pH7.9，20mM NaF，1mM Na3VO4，1mM Na4P2O7，0.13μM岡田酸acid，1mM EDTA，1mM EGTA，0.4mM鉬酸銨，1mM DTT，0.5mM PMSF和各為1μg/ml的亮抑酶肽，抑蛋白酶肽和抑胃酶肽)中。使細胞在冰上膨脹15分鐘後通過30次衝程的Dounce全玻璃勻漿器溶解。離心細胞核成丸狀並且再次懸浮於600μl冷的緩衝液C(緩衝液A，420mM氯化鈉和20％甘油)中。通過15次衝程的Dounce全玻璃勻漿器溶解細胞核膜。得到的懸浮液在4℃下攪拌30分鐘。將上清液分成等份並在-80℃下冷凍。
電泳遷移率變動分析使用DNA聚合酶的Klenow片段，用[α-33P]dCTP和[α-33P]dATP末端標記寡核苷酸。包括10μg細胞核抽提物或400ngGST-Smad蛋白或16μl體外翻譯的Smad蛋白和2ng標記的寡核苷酸的結合反應在37℃下在18μl結合緩衝液(20mM HEPES pH7.9，30mM氯化鉀，4mM氯化鎂，0.1mM EDTA，0.8mM NaPi，20％甘油，4mM亞精胺，3μg聚dl-dC)中進行20分鐘。在含有0.5xTBE的5％聚丙烯醯胺凝膠中分離蛋白質-DNA複合體。用作探針的雙鏈寡核苷酸的序列是
5＇TCGAGAGCCAGACAAGGAGCCAGACAAGGAGCCAGACACCTCGGTCTGTTCCTCGGTCTGTTCCTCGGTCTGTGAGCTC 5＇競爭劑CAGA突變體寡核苷酸的序列是5＇TCGAGAGCTACATAAAAAGCTACATATTTAGCTACATAC 3＇3 CTCGATGTATTTTTCGATGTATAAATCGATGTATGAGCT 5＇包含其它轉錄結合位點的競爭劑寡核苷酸是Fast-1位點5 ＇TCGAGGCTGCCCTAAAATGTGTATTCCATGGAAATGTCTGCCCTTCTCTC 3 ＇3 ＇CCGACGGGATTTTACACATAAGGTACCTTTACAGACGGGAAGAGAGAGCT 5 ＇AP-1位點5＇CCGGGATGACTCAGC 3 ＇3 ＇ CTACTGAGTCGGGCC 5＇NF-1位點5＇CCGGTTTGGATTGAAGCCAATATG3＇3＇AAACCTAACTTCGGTTATACGGCC5＇Sp1位點5＇TCGAGGACAGGGGGCGGAGCCTC 3＇3＇CCTGTCCCCCGCCTCGGAGAGCT 5＇在使用體外翻譯的蛋白質實現的凝膠移動實驗中，使用TNT T7Quick偶聯轉錄/翻譯系統(Promega)根據廠商說明製備Smad蛋白。在EMSA使用之前對用[35S]甲硫氨酸標記的體外合成的蛋白質進行SDS-PAGE和放射自顯影。
Smad融合蛋白的產生和純化在大腸桿菌中表達全長Smad蛋白和與GST融合的MH2-缺失的突變體，並且使用Pharmacia's方法通過柱色譜部分純化。簡單地講，細菌在2xYTA培養基中生長，並且用0.1mM IPTG誘導。超聲處理後，使用穀胱甘肽瓊脂糖4B分離GST-融合體，衝洗三次，洗脫，然後對補充有2mM DTT和0.5mM PMSF的PBS透析。
實驗結果CAGA盒是TGFβ可誘導的DNA元件我們提出了共同序列基序可能存在於對人PAl-1啟動子已經鑑定的TGFβ-應答區的可能性。為了證明這個問題，我們找到一個短的DNA同源性因子並且注意到在已經證明介導TGFβ-轉錄誘導的區中的人PAl-1啟動子中位點-730，-580和-280處的三個拷貝中存在序列AG(C/A)CAGACA(圖1A)。我們將該序列稱為CAGA盒並且在轉錄報導基因系統中克隆以確定其涉及TGFβ-誘導的轉錄。當在胸苷激酶(TK)啟動子上遊多個拷貝中克隆時，該DNA序列賦與HepG2細胞中TGFβ-誘導的轉錄性能(圖1B)，而不影響該載體的基礎活性。在MvlLu細胞(圖1C)或者在NIH3T3細胞(數據沒有給出)中觀察到相同的結果。當在由TATA盒和腺病毒主要晚期啟動子(MLP)起始密碼子序列組成的最小啟動子上遊克隆多個CAGA盒時，HepG2細胞中獲得數百個TGFβ-介導的摺疊誘導(圖1C)。使用廣泛使用的TGFβ-誘導的p3TP-Lux質粒，則該誘導較低。值得注意的是p3TP-Lux包含帶有-730CAGA盒的PAl-1啟動子的-740/-636區。作為特異性對照，含有相對於源序列的三個突變點的突變序列AGCTACATA，不能賦與TGFβ對TK啟動子的誘導性能(圖1C)。
人PAl-1啟動子中CAGA盒的突變取消了TGFβ反應性野生型人PAl-1啟動子包含三個CAGA盒。為了解釋在該啟動子的TGFβ介導的誘導中這些盒的生物意義，我們通過引入非TGFβ誘導的突變體序列而誘變了三個天然序列的每一個(圖2)。與野生型啟動子相比，三個位點之一的突變導致TGFβ誘導45％的降低(圖2，參見Δb1，Δb2和Δb3突變體)。兩個位點的突變，降低得更多一些(圖2，參見Db1+Db2，Δb1+Δb3和Δb2+Δb3突變體)，當所有三個位點都突變了時，PAl-1啟動子幾乎不能對TGFβ作出反應(圖2，參見Δb1+Δb2+Δb3突變體)。這些CAGA盒顯示不明顯控制該啟動子的基礎活性，因為在沒有TGFβ存在下，突變體啟動子的轉錄和野生型PAl-1啟動子的轉錄的速度是相當的。
CAGA盒響應TGFB和活化素。而不響應BMP特異性絲氨酸/蘇氨酸激酶Ⅰ型受體轉導TGFβ家族成員的細胞內信號BMPR-ⅠA(ALK-3)，BMPR-ⅠB(ALK-6)和ActR-Ⅰ(ALK-2)是Ⅰ型BMP受體，而TGFβ和活化素分別通過TβR-Ⅰ(ALK-5)和ActR-ⅠB(ALK-4)發出信號。為了試驗CAGA盒相對於TGFβ超家庭成員的特異性，我們用編碼Ⅰ型受體的組成型激活形式的表達載體轉染對TGFβ，活化素和BMP-7有反應的MvlLu細胞。如圖3A所示，ALK-4/T206D和ALK-5/T204D的表達導致CAGA盒報導基因載體的轉錄激活。相反，ALK-2/Q207D，ALK-3/Q233D和ALK-6/Q204D的表達沒有表現出任何作用，證明在MvlLu細胞中，TGFβ和活化素激活CAGA序列，但是BMP-誘導的信號不能激活。在用Ⅰ型受體的組成型激活形式轉染的HepG2細胞中獲得類似的結果(沒有給出數據)。為了試驗更多的生理條件，我們用CAGA盒報導基因載體轉染了對活化素和BMP-7有反應的HepG2細胞，並且用活化素和BMP-7培養細胞(OP-1)。如圖3B所示，包含CAGA盒的報導基因在活化素和TGFβ存在下分別被誘導25和200倍，而BMP-7沒有表現出任何明顯作用(2倍誘導)。因此，CAGA盒特異性響應活化素和TGFβ但是不響應BMP信號。
Smad蛋白參與CAGA盒介導的TGFB-誘導的轉錄為了檢查Smad蛋白是否涉及用CAGA盒發現的TGFβ誘導的轉錄激活，我們用CAGA報導基因結構和已知編碼抑制TGFβ/Smad-介導的轉錄作用的Smad7蛋白的表達載體共轉染HepG2細胞。如圖4A所示，Smad7的超表達導致CAGA盒報導基因結構TGFβ誘導的轉錄的50％抑制。來自乳腺癌的MDA-MB468細胞是內源Smad4表達缺陷的人上皮細胞。在這些細胞中，TGFβ對CAGA盒報導基因結構沒有作用(圖4B)。但是，編碼Smad4的表達載體的共轉染恢復包含CAGA盒的載體的TGFβ轉錄誘導，證明Smad4對於該序列介導的TGFβ轉錄作用是必需的。
Smad3和Smad4存在於結合CAGA盒的轉錄因子核複合體中在下一個步驟中，我們使用HepG2細胞核抽提物進行電泳遷移率變動分析(EMSA)，試圖鑑定對TGFβ-反應CAGA序列的DNA-結合活性。我們只有用來自TGFβ誘導的細胞的細胞核抽提物才可以鑑定結合複合體的存在(圖5A，比較泳道2和3)。最大結合需要30分鐘的TGFβ誘導時間，而在10分鐘誘導之後可以清楚地觀察到該複合體(沒有給出數據)。這提示從頭蛋白質合成不是必須的，而且已經存在的因子被快速地和翻譯後修飾或者易位到細胞核中。該DNA-結合複合體是特異性的，因為是過量的冷CAGA寡核苷酸而不是突變的盒代替了相應的泳帶(圖5A，泳道4和5)。此外，該複合體不包含曾被建議為是TGFβ/活化素信號潛在中介體的轉錄因子，例如Sp1，AP-1，NF-1或FAST-1，因為其沒有被相應的這些轉錄因子所結合的DNA序列置換(圖5A，泳道6-10)。為了檢查Smad蛋白是否存在於CAGA結合複合體中，將細胞核抽提物與特異性抗Smad1至Smad5抗血清培養。我們可以測定與抗-Smad3和抗-Smad4抗血清的TGFβ依賴性結合複合體的超移動(圖5B，泳道6和8)。通過加入用來產生抗血清的免疫原性肽來競爭這些超移動，證明抗體識別的特異性(圖5B，泳道7和9)。因為加入抗-Smad1，抗-Smad2和抗-Smad5抗血清沒有作用(圖5B，泳道4，5和10)，我們得出結論，CAGA盒DNA-結合核複合體包含TGFβ/活化素信號Smad3和Smad4蛋白質，但是不包含Smad蛋白也不包含BMP信號Smad1和Smad5蛋白質。這與證明CAGA報導基因結構由激活Smad3的TGFβ和活化素受體激活，而不由其信號通過Smad1和Smad5傳導的BMP受體激活的轉染實驗相吻合(參見圖3A和3B)。
Smad3和Smad4直接結合TGFB-誘導的CAGA盒我們前面描述凝膠移動實驗證明細胞核CAGA序列-結合複合體中存在Smad3和Smad4，但是不能確定Smad3和Smad4與DNA的結合是否是直接的。為了證實這一點，我們在EMSA中使用了大腸桿菌表達的GST-Smad融合蛋白。如圖5C所示，Smad3和Smad4缺失MH2區，直接並且特異性地結合包含CAGA盒的探針。在用超移動實驗的系列裡，Smad1ΔMH2和Smad2ΔMH2蛋白不結合DNA。此外，與果蠅Mad蛋白的實施例相反，細菌中產生的全長Smad4蛋白質對CAGA序列確實具有直接並且特異性的DNA-結合活性，而全長GST-Smad1，GST-Smad2和GST-Smad3不能結合DNA。
Smad2不激活CAGA-介導的轉錄如圖6所示，TGFβ對CAGA報導基因的激活可以通過將Smad3表達載體的轉染到HepG2細胞中模擬。但是，和Smad3具有92％相同性的Smad2蛋白的轉染對CAGA-介導的轉錄沒有作用，表明Smad2和Smad3不是功能等價的。Smad3的MH1結構域對於DNA特異性結合CAGA序列是足夠的(參見圖5C)。Smad2和Smad3 MH1區之間的比較表明，主要差別是Smad2中存在的兩個胺基酸片段在Smad3中則沒有(圖7A)。我們將在Ser21和Gly30之間包含10個殘基(主要是甘氨酸和絲氨酸)的短N-末端胺基酸序列稱為GAG。從胺基酸Ser79至Thr108的30個殘基長並且富含絲氨酸和蘇氨酸的較大的序列稱之為TID。為了確定這些序列是否涉及Smad2轉錄活性的缺失，我們製備了缺失兩種序列的Smad2蛋白(圖7B)。轉染到HepG2細胞中的該突變體將CAGA報導基因激活到和野生型Smad3相當的水平(圖7C)。Smad2ΔGAGΔTID突變體顯示GAG或TID結構域涉及Smad2和Smad3之間觀察到的功能差異。在下面步驟中，我們試圖測定該轉錄差別是否歸因於單一結構域。為了解決這個問題，我們缺失了Smad2中的GAG(Smad2ΔGAG)或TID(Smad2ΔTID)序列，並且測定了突變體對CAGA報導基因載體的作用。如圖7C所示，Smad2ΔTID突變體明顯地能激活CAGA報導基因，表明TID結構域與Smad2轉錄能力缺乏相關。我們未發現Smad2ΔGAG對CAGA報導基因有任何激活作用。不過，我們不能從該實驗得出這樣的結論，即GAG結構域與轉錄激活的缺乏無關，因為我們不能通過蛋白質印跡測定該突變體的表達(圖7D，沒有給出數據)。
為了補充用Smad2缺失突變體獲得的結果，我們在Smad3中引入了GAG結構域或TID結構域。與先前數據一致，包含TID序列的Smad3突變體(即Smad3+GAG+TID和Smad3+TID)不能激活CAGA報導基因，再次表明涉及該序列。值得注意的是，這些轉錄失活突變體在所述細胞中表達，因為它們在蛋白質印跡測定中測定到(圖7D)。將單一GAG結構域引入Smad3不改變其轉錄能力(參見Smad3+GAG，圖7C)。這些結果清楚地表明Smad2和Smad3之間所觀察到的轉錄差異歸因於單一TID結構域而不是GAG序列。
相應於外顯子3的TID區抑制Smad2結合CAGA序列
Smad3和Smad2之間的激活轉錄的能力的差異可以通過不同的DNA-結合能力來解釋。事實上，因為TID結構域是Smad2和Smad3之間的轉錄差異的原因，有可能是該結構域抑制Smad2結合DNA。為了證實這種假設，我們使用體外轉錄/翻譯系統製備了Smad突變體蛋白並且在凝膠移動測試中測定了它們的DNA-結合能力。如圖8A所示，與Smad2不同，全長野生型Smad3結合CAGA寡核苷酸。值得注意的是，在該實驗中，Smad3不與GST結構域融合，表明GST結構域在一定程度上改變了Smad3的DNA-結合能力(參見圖5D)。該結合是特異性的，因為Smad3不能結合包含3個核苷酸突變形式的CAGA序列的寡核苷酸探針(圖8B)。與轉染實驗相吻合，缺失兩個序列的Smad2(Smad2ΔGAGΔTID)和Smad2ΔTID能結合CAGA探針而Smad2ΔGAG不能。在與先前所觀察的轉錄活性總的相關性中，Smad3+GAG結合CAGA寡核苷酸，而且在Smad3中引入TID結構域(即Smad3+TID和Smad3+GAG+TID)阻止Smad3結合DNA。因此，該TID序列通過阻止其對CAGA盒的DNA-結合而防止Smad2激活轉錄。
明顯地，Smad2中存在的TID序列確實相應於外顯子3(Takenoshita等，Genomics,1998,48,1-11)。此外，在人胎盤中檢測到在外顯子3中剪接的Smad2形式(Takenoshita等，Genomics，1998，48，1-11)。可能地，該剪接可以調控和對於某些細胞類型和條件是特異性的。因為與全長Smad2不同，該較短形式不包含TID結構域，其類似於Smad3激活轉錄，並且用Smad3在其結合和激活自CAGA序列的轉錄能力上豐餘至少一定程度。
CAGA-介導的轉錄篩選的具體實施例CAGA-報導基因細胞克隆產生包含穩定整合TGFβ-反應性CAGA盒的報導基因的兩個細胞系，以進行高效率轉錄篩選。通過在HepG2細胞中穩定共轉染(CAGA)9MLP-Luc載體(最小MLP啟動子上遊克隆的9個CAGA盒的控制下的螢火蟲螢光素酶；如圖1所示)和pRc/Renilla載體而獲得第一個克隆細胞系，克隆F89。pRc/Renilla載體含有SV40啟動子控制下的新黴素/遺傳黴素基因抗性，而renilla螢光素酶基因由RSV LTR啟動。通過將包含螢光素酶renilla基因的pRL-SV40(Promega)的HindⅢ/Xbal片段克隆到pRc-RSV載體的HindⅢ/Xbal位點中而獲得pRc/Renilla載體(Invitrogen)。通過在HepG2細胞中穩定共轉染野生型人PAl-1-Luc報導基因載體(人PAl-1啟動子控制下的螢火蟲螢光素酶；如圖2所示)和pRc/Renilla質粒而獲得第二個克隆細胞系，克隆1613。在這兩種情況下，使用磷酸鈣共沉澱方法穩定轉染HepG2細胞。為了分離遺傳黴素抗性克隆，使轉染的細胞在1mg/ml遺傳黴素(Gibco)存在下生長。然後分離F89和1613克隆並且在0.5mg/ml遺傳黴素存在下擴增，以獲得足夠量的細胞用於循環的高產出篩選。
由於控制螢火蟲螢光素酶轉基因表達的轉錄調控區(即啟動子)中存在CAGA盒，兩種克隆在TGFβ存在下以劑量依賴方式存在高激活螢火蟲螢光素酶活性。renilla螢光素酶的活性在TGFβ存在下幾乎沒有改變。因此，renilla螢光素酶活性可以用作內毒性對照。
表2表明在克隆F89和1613中在不存在或存在增加量的TGFβ下發現的相對螢火蟲螢光素酶活性(誘導倍數)(數值1相應於沒有TGFβ存在下獲得的相對螢火蟲螢光素酶活性)表2
表3表明在克隆F89和1613中在不存在或存在增加量的TGFβ下發現的相對renilla螢光素酶活性(誘導倍數)(數值1相應於沒有TGFβ存在下獲得的相對renilla螢光素酶活性)表3
自動控制的高產率轉錄篩選為了進行高產率篩選，在96孔微量培養板規格中自動進行細胞測試。整個過程由能進行平行操作並且控制周圍設備(即軸轉動臂，傳送帶，細胞清洗器，移液臺站，細胞培養箱，發光計)並且優化該程序的時間進程的計算機系統(CLARA，Scitec)控制。用於該高產率篩選的一般程序如下第一天→第二天→ 第三天→接種細胞 去血清 螢光素酶定量 數據分析候選試劑培養加入TGFβ在第一天，使用多滴儀器，以每孔200μl含血清培養基中35000個細胞的濃度用CAGA-報導基因細胞(即F89或1613)接種40個(96孔)微量培養板。將這些培養板放置在自動線上的細胞培養箱中。對該培養箱設計一個門，使軸轉動臂，可以進入操作細胞微量培養板。
18-24小時後(第2天)在100％DMSO中稀釋的含有要測試的化合物的微量培養板被放置在傳送帶中，開始細胞培養程序。然後，由計算機系統協調各種周圍的設備的動作，在存在TGFβ和要測試的化合物下培養細胞。
由軸轉動臂將細胞和化合物微量培養板在自動控制線上移動到適當範圍。衝洗細胞並且在無血清培養基中培養。由移液臺的站實現不同操作，包括為了用TGFβ和要測試的化合物培養細胞而進行的初步稀釋。該項試驗中使用的TGFβ(購自RD的rhTGFβ-1)的最終濃度是1ng/ml，在1％終濃度DMSO中的最終濃度是10μM下測定化合物。在加入TGFβ之前，用要測試的化合物培養細胞15-30分鐘。試驗反應的最終體積是150μl。A1孔至H10孔是試驗孔並且含有要在TGFβ存在下用測試的化合物培養的細胞。每一個孔只含有單一一種化合物並且測定其對CAGA-介導的轉錄的影響。用第11和12欄作為對照。第11欄包括8個孔，其中在TGFβ存在下沒有化合物培養細胞。第11欄測定將比較試驗孔中測定的值以鑑定潛在的抑制劑或活化劑化合物的『參照TGFβ-誘導的螢火蟲螢光素酶值'。在孔A12至D12中，細胞在沒有TGFβ的培養基中生長。用這些點獲得的螢火蟲螢光素酶值代表『基礎螢火蟲螢光素酶活性』，並且經對照TGFβ誘導是正確的。在孔E12至H12中，在TGFβ存在下用細胞毒性化合物500μM CPO(環戊酮，Sigma)培養細胞。降低的螢火蟲和renilla螢光素酶活性顯示毒性(大約是第11欄中獲得的活性的50％)。對照這些點，該試驗對毒性化合物敏感。
12-18小時後(第3天)，開始定量測定螢光素酶程序。使用購自Promega的雙螢光素酶測定試劑盒的試劑進行下面的反應。衝洗細胞並且加入10μl被動溶解緩衝液(Promega)溶解。攪拌15-30分鐘後，在雙注射器發光計(BMGlumistar)中讀出培養板的螢光素酶活性。為了該目的，依次注入10μl螢光素酶測定試劑和50μl StopGlo緩衝液以定量測定兩種螢光素酶的活性。然後用適當的軟體處理和分析數據。
CAGA-介導的轉錄的抑制劑的描述在上述自動控制高產率轉錄篩選中測試了上千種化合物。發現α-氰基-4-羥基-3-乙氧基-5-苯基硫基甲基肉桂醯胺化合物(下文稱之為化合物A)對兩種克隆F89和1613的TGFβ-誘導的螢火蟲螢光素酶活性具有抑制作用(IC50在5和10μM之間)，但是對renllia螢光素酶活性沒有影響，並且給出了下面的結構式作為實例。 化合物A(α-氰基-4-羥基-3-乙氧基-5-苯基硫基甲基肉桂醯胺)表4證明增加濃度的化合物A在1ng/ml TGFβ存在下對克隆F89和1613的螢火蟲螢光素酶活性的作用(數值100相應於沒有化合物A存在下和1ng/ml TGFβ存在下所觀察到的螢火蟲螢光素酶活性)。
表4化合物A
權利要求
1．篩選用於治療與由一種或幾種Smad蛋白和TGFβ或活化素調控的基因調控相關的疾病的治療劑的方法，所述方法包括檢測或分析在所述試劑存在下，Smad蛋白或其DNA結合片段和包括序列5'WXYCAGACZ3'或其功能等價物的雙鏈寡核苷酸之間的轉錄活性或結合的程度和結果，其中在所述核苷酸序列中，W代表A或G，X代表G或T，Y代表C，A，G或T且Z代表A或C。
2．權利要求1的方法，其中雙鏈寡核苷酸包括序列5'WXYCAGACZ3'或其功能等價物，其中在所述核苷酸序列中，W代表A或G，X代表G或T，Y代表C，A或G且Z代表A或C。
3．權利要求1或2的方法，其中雙鏈寡核苷酸包括序列5'AG(C/A)CAGACA3'或其功能等價物。
4．權利要求1或2的方法，其中雙鏈寡核苷酸包括序列5'ATGCAGACA3'或5'GGCCAGACA3'，或其功能等價物。
5．權利要求1-3任一項的方法在治療纖維變性疾病，異常傷口癒合，異常骨生成，癌症，造血，神經保護和免疫和炎症疾病中的用途。
6．篩選適合治療與由一種或幾種Smad蛋白和TGFβ或活化素調控的基因調控相關的疾病的藥劑的試劑盒，所述試劑盒包括-一種如上定義的Smad蛋白-TGFβ或活化素-包括序列5'WXYCAGACZ3'或者其功能等價物的雙鏈DNA分子，其中在所述核苷酸序列中，W代表A或G，X代表G或T，Y代表C，A或G且Z代表A或C，所述序列任選地與啟動子或增強子序列和其產物是可檢測的基因的編碼區操作連接。
7．治療與由一種或幾種Smad蛋白和TGFβ或活化素調控的基因調控相關的疾病的方法，所述方法對包括人的哺乳動物施用包括序列5'WXYCAGACZ3'或其功能等價物的雙鏈寡核苷酸，其中在所述核苷酸序列中，W代表A或G，X代表G或T，Y代表C，A或G且Z代表A或C。
8．包括序列5'WXYCAGACZ3'或其功能等價物的雙鏈寡核苷酸在治療與由一種或幾種Smad蛋白和TGFβ或活化素調控的基因調控相關的疾病中的用途，其中在所述核苷酸序列中，W代表A或G，X代表G或T，Y代表C，A或G且Z代表A或C。
9．包括序列5'WXYCAGACZ3'或其功能等價物的雙鏈寡核苷酸在製備用於治療與由一種或幾種Smad蛋白和TGFβ或活化素調控的基因調控相關的疾病的藥物中的用途，其中在所述核苷酸序列中，W代表A或G，X代表G或T，Y代表C，A或G且Z代表A或C。
10．治療與由一種或幾種Smad蛋白和TGFβ或活化素調控的基因調控相關的疾病的方法，所述方法包括對包括人的哺乳動物施用治療量的一種藥劑，其抑制或激活所述Smad蛋白與由TGFβ或活化素調控的基因調控中涉及的啟動子或增強子的轉錄活性或結合，所述啟動子或增強子包括核苷酸序列5'WXYCAGACZ3'或其功能等價物，其中在所述核苷酸序列中，W代表A或G，X代表G或T，Y代表C，A或G且Z代表A或C。
11．治療量的一種藥劑在治療與由一種或幾種Smad蛋白和TGFβ或活化素調控的基因調控相關的疾病中的用途，所述藥劑抑制或激活一種或幾種Smad蛋白與由TGFβ或活化素調控的基因調控中涉及的啟動子或增強子的轉錄活性或結合，所述啟動子或增強子包括核苷酸序列5'WXYCAGACZ3'或其功能等價物，其中在所述核苷酸序列中，W代表A或G，X代表G或T，Y代表C，A和G且Z代表A或C。
12．抑制或激活一種或幾種Smad蛋白與由TGFβ或活化素調控的基因調控中涉及的啟動子或增強子的轉錄活性或結合的治療量的一種藥劑在製備用於治療與由一種或幾種Smad蛋白和TGFβ或活化素調控的基因調控相關的疾病的藥物的用途，其中所述啟動子或增強子包括核苷酸序列5'WXYCAGACZ3'或其功能等價物，其中在所述核苷酸序列中，W代表A或G，X代表G或T，Y代表C，A或G且Z代表A或C。
13．治療與由一種或幾種Smad蛋白和TGFβ或活化素調控的基因調控相關的疾病的方法，包括對包括人的哺乳動物施用治療量的權利要求1-4任一項的方法中定義的一種藥劑。
14．治療量的權利要求1-4任一項的方法中定義的一種藥劑在治療與由一種或幾種Smad蛋白和TGFβ或活化素調控的基因調控相關的疾病中的用途。
15．治療量的權利要求1-4任一項的方法中定義的一種藥劑在製備用於治療與由一種或幾種Smad蛋白和TGFβ或活化素調控的基因調控相關的疾病的藥物中的用途。
16．包括序列5'WXYCAGACZ3'或其功能等價物的分離的雙鏈DNA分子，其中在所述核苷酸序列中，W代表A或G，X代表G或T，Y代表C，A，G或T且Z代表A或C。
17．權利要求16的包括序列5'AG(C/A)CAGACA3'的分離的雙鏈DNA分子。
18．權利要求16的包括序列5'ATGCAGACA3'的分離的雙鏈DNA分子。
19．權利要求16的包括序列5'GGCCAGACA3'的分離的雙鏈DNA分子。
20．抑制或激活由一種或幾種Smad蛋白與由TGFβ或活化素調控的基因調控中涉及的啟動子或增強子的轉錄活性或結合的一種治療藥劑，所述啟動子或增強子包括核苷酸序列5'WXYCAGACZ3'或其功能等價物，其中在所述核苷酸序列中，W代表A或G，X代表G或T，Y代表C，A或G且Z代表A或C。
21.權利要求1-4任一項的方法中定義的治療藥劑。
全文摘要
本發明涉及一種篩選用於治療與由一種或幾種Smad蛋白和TGFβ或活化素調控的基因調控相關的疾病的治療劑的方法,所述方法包括檢測或分析在所述試劑存在下Smad蛋白或其DNA結合片段和包括序列5』WXYCAGACZ3』或其功能等價物的雙鏈寡核苷酸之間的轉錄活性或結合的程度和結果,其中在所述核苷酸序列中,W代表A或G,X代表G或T,Y代表C,A,G或T且Z代表A或C。還要求了用這樣一種方法鑑定的治療藥劑,以及它們在治療與Smad－介導的TGFβ誘導的基因異常表達相關的疾病中的用途。
文檔編號A61P7/00GK1296529SQ99804857
公開日2001年5月23日 申請日期1999年2月4日 優先權日1998年2月6日
發明者J·M·戈蒂爾, S·赫特, S·G·登勒 申請人:葛蘭素集團有限公司