一種用於篩選抗腫瘤藥物的微生物篩選模型的製作方法

2023-08-03 11:04:26

專利名稱：一種用於篩選抗腫瘤藥物的微生物篩選模型的製作方法
技術領域：
本發明屬於藥物領域，涉及一種抑制腫瘤細胞DNA複製藥物篩選的微生物篩選模 型的建立及其應用，本模型非常適合從成分複雜的微生物發酵液中或其他產物中篩選抗腫 瘤藥物或抗腫瘤抗生素。
背景技術：
1、篩選有效抗腫瘤藥物的意義腫瘤是當今世界危及人類生命的一種最常見、最嚴重的疾病。據世界衛生組織 (WHO)統計數字顯示，全世界每年新增700萬腫瘤患者，因癌症死亡達600萬，佔總死亡人數 的12%。在我國，腫瘤在前十名疾病排名中列第二位，死亡率8. 58/10萬，佔死亡總人數的 21.58%。化療一直都是腫瘤治療的主要手段。因此，特異性強的有效抗腫瘤藥物在腫瘤治 療中具有重要作用。2、常用篩選抗腫瘤藥物的模型和方法及存在的缺陷(I)MTT-細胞生長抑制法基本原理是根據活的增殖細胞能代謝MTT，形成一種與 細胞增殖程度成正比例關係的藍紫色的化合物，針對這種化合物而建立的MTT比色分析法 具有所用試劑少，儀器簡單，耗時少，出結果快等優點。但這種方法必須建立在培養腫瘤細 胞的基礎上，並且細胞數量、MTT濃度、殘留培養液均可影響實驗結果。(2)滷蟲(Artemia Sailina)模型和MTT模型組合利用藥物對滷蟲的毒性即殺 蟲作用進行初篩，利用MTT-細胞生長抑制法對具有殺滷蟲活性的藥物進行復篩，通過測定 ID50得到較高活性後選藥物。這種方法是通過候選藥物對一定數量的滷蟲的殺蟲率進行初 步篩選的，如果滷蟲數量少，就會影響實驗結果。(3) 3H-TdR摻入法細胞DNA合成使得3H-TdR的摻入會隨之增加，通過對細胞中3H 的液體閃爍測定可了解細胞增殖的程度，比較標準對照，判斷藥物對細胞DNA合成的影響。 該法能客觀反映多種化療藥物或藥物組合對腫瘤細胞生長的不同抑制效果，但由於使用的 3H-TdR帶有放射性，其使用受到一定限制。(4)針對蛋白激酶和蛋白磷酸酯酶進行篩選近年對腫瘤的發生和發展有了深入 的了解，細胞內蛋白磷酸化是細胞信息傳遞和胞內調控過程的關鍵反應，針對這些蛋白激 酶和蛋白磷酸酯酶開展研究是抗腫瘤藥物研究的一個熱點，但進行抗腫瘤藥物篩選還不成熟。(5)端粒酶的篩選近年來另一個重要進展是發現了端粒酶在維持腫瘤細胞的增 殖中起著重要作用，因而端粒酶被認為是惡性腫瘤診斷和治療的新靶標。但這種篩選模型 只能篩選到通過抑制端粒酶而起作用的抗腫瘤藥物，具有有一定的局限性。傳統的抗癌藥物篩選靶點多是檢驗藥物對腫瘤細胞的直接毒性，除了殺死腫瘤細 胞外，對機體正常組織系統也有很大的毒副作用。另外，傳統的抗腫瘤藥物篩選模型缺乏特 異性，篩選過程複雜，有的需要用同位素，不容易操作。而近年來針對與腫瘤細胞發生有關 的蛋白激酶和蛋白磷酸酯酶進行的篩選還不能立刻應用，針對端粒酶而設計的篩選模型的篩選過程比較複雜，其特異性和靈敏性也不是很高，並且選出的侯選藥物不能反映藥物的 結構和作用機制信息。因此，建立新的快速而靈敏的篩選方法，篩選對腫瘤細胞具有特異性 的抗腫瘤藥物具有非常重要的實際意義。2、微生物是篩選有效抗腫瘤藥物的資源庫微生物具有種類多樣、代謝類型多樣、產物多樣的特點，是篩選新的抗腫瘤藥物的 重要來源。在當前使用的抗腫瘤藥物中，抑制腫瘤細胞DNA複製的藥物是其中最重要的一 大類，這類藥物在腫瘤治療中具有重要的地位。如何才能從大量豐富的微生物代謝產物庫 中快速找到有效的抑制腫瘤細胞DNA複製的藥物至關重要，迫切需要建立一種簡潔方便 的，容易操作的，快速準確的容易實現高通量篩選的篩選模型，以便從多樣的微生物代謝產 物中有目的地篩選有效抑制腫瘤細胞DNA複製的藥物或抗生素。

發明內容
1、基本原理以本實驗室選育的菌株Y作為指示菌株，菌株Y是對作用於腫瘤細胞 DNA複製的抗腫瘤藥物的敏感菌株，如果某種微生物的發酵液能抑制菌株Y的生長繁殖，那 麼這種微生物的發酵液中就含有抑制腫瘤細胞DNA複製的抗腫瘤物質或抗腫瘤抗生素。本 模型快速、簡便和準確，可實現高通量篩選，特別適合從複雜的各類微生物的代謝產物中篩 選抗腫瘤藥物或抗腫瘤抗生素，也適合從單一化合物中篩選抗腫瘤藥物。2、應用本模型進行抗腫瘤藥物篩選的基本方法本模型適合從細菌、放線菌、酵母 菌或黴菌等微生物中分離篩選抑制腫瘤細胞DNA複製的抗腫瘤藥物或抗腫瘤抗生素，主要 步驟如下(1)微生物無菌發酵液上清的製備將待測定的微生物接種到馬鈴薯液體培養基 中，於適合該微生物生長的溫度條件下培養3-5天，培養結束後將發酵液離心(lOOOOrpm， 10min,4°C )後過濾除菌，獲得含有活性成分的無菌發酵液上清。(2)抑菌試驗(應用濾紙片法針對指示菌株Y做抑菌試驗)取菌株Y的菌懸液 200 μ 1 (IO7-IO8個細菌/ml)塗布接種到PDA平板的表面，靜置10-30min，將無菌小濾紙片 貼到PDA平板表面，取(1)中製備的無菌發酵液上清20-30 μ 1加到濾紙片上，然後將平板 於 30-35°C培養 12-16h。(3)結果觀察與分析在濾紙片周圍出現抑菌圈者為陽性，否則為陰性。陽性樣品 中含有抑制指示菌株Y生長繁殖的活性成分，即此樣品中可能含有抑制腫瘤細胞DNA複製 的潛在抗腫瘤物質，可利用微生物發酵方法大量獲得這種微生物的發酵液，從中分離純化 抗腫瘤活性物質，並可進行結構、特性及抗腫瘤機制研究。我們從土壤中分離純化了 35種不同特徵的細菌菌株，應用這個模型分析發現其 中有5種細菌的發酵液能抑制指示菌株的生長繁殖(圖1)，這5種細菌的發酵液中含有潛 在的抗腫瘤物質。3、模型的驗證將陽性樣品的無菌發酵液上清作用於培養的腫瘤細胞，看其是否 能抑制腫瘤細胞的生長繁殖。具體方法取一瓶處於對數生長期的人子宮頸癌細胞(HeLa)進行細胞計數。根據 細胞計數結果，用完全培養基把細胞稀釋到2 X 104/ml，200 μ L細胞懸液/孔，即按4X IO3/ 孔做傳代培養接種於96孔板。24h後開始加待測樣品，即無菌發酵液上清。24h後加入501^的肌1~(511^/1111)，371孵育。4h後將培養基小心吸出，再加入裂解液(10% SDS+0. 1% NH4Cl) 200 μ L，37°C孵育過夜。第二天在酶標儀上於570nm處讀取OD值。每個發酵液樣品 的無菌發酵液上清檢測3個時間點24h、48h、72h。結果培養結束後以培養時間為橫坐標，測定的光吸收值(OD)為縱坐標繪製HeLa 細胞生長曲線。應用這種方法，將上述5種細菌的無菌發酵液上清通過MTT法進行驗證，發 現都能夠抑制腫瘤細胞的生長繁殖(圖2)，與預期結果一致，證明此模型用於篩選抗腫瘤 藥物及抗腫瘤抗生素是可行的。4、本模型的特色和創新1)可真正實現高通量篩選通過抑菌實驗進行抗腫瘤藥 物篩選，方法簡便，可在短時間內處理大量樣品；2)對待測樣品的純度要求不高，微生物發 酵液中成分複雜，但只要含有能抑制腫瘤細胞DNA複製的成分就可用此模型進行篩選，並 能得到陽性結果，保證此模型具有廣泛的應用；3)對待測定的物質的濃度要求不高，微生 物發酵液不經過濃縮就可以用此模型進行篩選；4)快速準確，抑菌實驗12-16h就可以出結 果，結果的準確性高；5)簡便快捷，容易操作，費用低，本模型描述的方法在普通的實驗室 就可完成，不需要苛刻及嚴格的條件，只需要普通培養基及培養條件就可完成；6)具有很 高的特異性和靈敏度，還能初步判斷侯選藥物的作用機制。本模型非常適合從各類微生物 的複雜的代謝產物中篩選抑制腫瘤細胞DNA複製的抗腫瘤藥物。


圖1微生物發酵液對指示菌株Y的抑制作用，1為無菌培養基對照，2-6為來自不 同微生物的無菌發酵液上清樣品圖2MTT比色法檢驗2-6號樣品對人子宮頸癌細胞(HeLa)的體外抗腫瘤活性
具體實施例方式以下通過實施實例對本發明作進一步闡述實施例1 微生物發酵液的製備1、按照微生物學實驗指導或微生物學手冊配製馬鈴薯液體培養基，分裝到試管中 (5ml/每管)，高壓蒸汽滅菌(115°C，20分鐘)後分別接種待測定的微生物。2、將接種後的試管於30-35°C培養3-5天。3、將上述微生物發酵液離心(lOOOOrpm，10min,4°C )後過濾除菌，獲得無菌發酵
液上清(待測樣品)。實施例2微生物無菌發酵液對指示菌株的抑制作用1、指示菌株Y的培養將指示菌株Y接種於液體菌種活化培養基中，於35°C培養 12-16h，使其到達對數期，菌懸液中細菌的濃度達到IO7-IO8個細菌/ml，備用。2、將PDA融化後倒入無菌平皿中，凝固後製成PDA平板。4、取1中培養的指示菌懸液200 μ 1到每個PDA平板表面，用無菌塗布器將菌懸液 均勻塗布到培養基的表面，靜置10-30min。5、將無菌小濾紙片貼到PDA平板表面，然後分別取實例1中製備的無菌發酵液上 清樣品20-30 μ 1，分別加到每張小濾紙片上。6、將上述PDA平板於30_35°C恆溫培養12_16h，觀察結果，記錄小濾紙片周圍出現抑菌圈及其直徑大小情況，具有抑菌圈的發酵液中含有抑制腫瘤細胞DNA複製的抗腫瘤活 性物質，對其發酵液進行分離純化，可能會得到新的抗腫瘤活性物質。7、我們應用本模型從分離自土壤的35種細菌的發酵液進行篩選，發現了其中的5 種細菌的發酵液對指示菌株Y具有明顯的抑制作用(圖1)。實施例3MTT比色法檢驗待測樣品對人子宮頸癌細胞(HeLa)的體外抗腫瘤活性 (檢測從35種細菌中篩選出的5株細菌的發酵液中是否含有抑制腫瘤細胞生長的活性物 質)基本原理活的增殖細胞能代謝MTT，形成一種與細胞增殖程度成正比例關係的藍紫色的化 合物，針對這種化合物而建立的MTT比色分析法。MTT比色法能測定細胞相對數和相對活 力，即可間接反映活細胞數量。在一定細胞數範圍內，MTT結晶形成的量與活細胞的量成正 比，即光吸收值(OD)與活細胞數量呈線性關係，可以通過測量OD值間接測量活細胞數量。 以測定的光吸收值(OD)對與發酵液樣品作用的時間(h)作圖，即得腫瘤細胞在發酵液樣品 作用下的生長曲線。實驗方法待測樣品的製備將實例2中的5種細菌分別接種到馬鈴薯液體培養基中，於 30-35°C恆溫培養3-5天，離心(10000rpm、10min，4°C )，取上清液，過濾除菌備用(待測樣
口 、
m ) οMTT法測定樣品的體外抗腫瘤細胞活性取一瓶處於對數生長期的人子宮頸癌 細胞(HeLa)進行細胞計數。根據細胞計數結果，用完全培養基把細胞稀釋到2X 104/ml， 200 μ L細胞懸液/ ？L，即按4Χ IO3/孔做傳代培養接種於96孔板。24h後開始待測樣品。 24h後加入50 μ L的MTT (5mg/ml)，37°C孵育。4h後將培養基小心取出，再加入裂解液(10% SDS+0. ΝΗ4α)200μ ，37 孵育過夜。第二天在酶標儀上於570nm處讀取OD值。每個 發酵液樣品檢測3個時間點24h、48h、72h。以培養時間為橫坐標，測定的光吸收值(OD)為 縱坐標繪製細胞生長曲線，以稀釋倍數為橫坐標，測定的光吸收值(OD)為縱坐標繪製細胞 生長曲線。實驗結果結果見圖2，從圖2可觀察到對照樣品和5種微生物的無菌發酵液上清對HeLa細 胞的影響。從圖中可以看到，對照樣品由於不含抑制腫瘤細胞生長的物質，所以隨著培養時 間的延長，HeLa細胞的數量逐漸增加。5種發酵液樣品與HeLa細胞作用後，HeLa活細胞數 都明顯低於正常水平，與對照組HeLa細胞的生長曲線相比，這5種發酵液樣品對HeLa細胞 都有顯著的抑制作用。其中的2號樣品對HeLa細胞的抑制作用48h後達到最大，但48h後， 隨著培養時間的延長，其抑制作用有所降低，即48h後，HeLa細胞的生長開始緩慢恢復。3-6 號樣品，從作用24h到72h都表現出對HeLa細胞較強的抑制作用，其抑制作用維持在相對 穩定的水平，也就是說3-6號樣品從24h開始到72h就一直表現出明顯的對HeLa細胞的抑 製作用，抑制作用持久，效果明顯，具有抗腫瘤藥物的基本特徵。應用spss軟體對實驗數據 進行分析發現(表1)，Sig. (2-tailed)的數據都小於0. 005，也就是說ρ值小於0. 005，每組 數據與對照組數據之間相比有顯著性差異，說明待測樣品對Hela細胞有明顯的抑制作用。 因此，從2-6號樣品中，有可能分離純化得到對腫瘤細胞有特異抑制作用的抗腫瘤物質。
表 IT-TEST 檢驗
權利要求
一種用於篩選抗腫瘤藥物的微生物篩選模型，其特徵在於該模型的篩選方法是以本實驗室選育的菌株Y作為指示菌株，即菌株Y是對作用於腫瘤細胞DNA複製的抗腫瘤藥物的敏感菌株。如果某種微生物發酵液的無菌上清能抑制菌株Y的生長繁殖，那麼這種微生物的發酵液中就含有抑制腫瘤細胞DNA複製的抗腫瘤物質或抗腫瘤抗生素。該模型的篩選方法是將無菌小濾紙片貼到塗布有指示菌株Y的PDA培養基平板的表面，在小濾紙片上分別加20-30μl的不同微生物發酵液的無菌上清，將平板於30-35℃條件下培養12-16h，以抑制菌株Y生長的發酵液為陽性，不抑制菌株Y生長的發酵液為陰性。陽性樣品中含有抑制腫瘤細胞DNA複製的抗腫瘤藥物或抗腫瘤抗生素。這一篩選模型特別適合從各類微生物的代謝產物中篩選抑制腫瘤細胞DNA複製的抗腫瘤藥物或抗腫瘤抗生素，也適合從單一化合物中篩選抗腫瘤藥物。
2.根據權利要求1所述一種用於篩選抗腫瘤藥物的微生物篩選模型，其特徵在於以本 實驗室選育的菌株Y作為指示菌株建立篩選模型，從各類微生物代謝產物中及其它來源的 物質中篩選抗腫瘤藥物或抗腫瘤抗生素的方法。
3.根據權利要求1所述一種用於篩選抗腫瘤藥物的微生物篩選模型，其特徵在於應用 某種微生物菌株作為指示菌株，從各類微生物代謝產物中或其它來源的物質中篩選抗腫瘤 藥物或抗腫瘤抗生素的方法。
4.根據權利要求1所述一種用於篩選抗腫瘤藥物的微生物篩選模型，其特徵在於在固 體培養基上應用濾紙片抑菌實驗方法從各類微生物代謝產物中或其它來源的物質中篩選 抗腫瘤藥物或抗腫瘤抗生素的方法。
全文摘要
本發明屬於藥物領域，公開了一種用於篩選抗腫瘤藥物的微生物篩選模型。基本原理是以本實驗室選育的菌株Y作為指示菌株，如果某種微生物的發酵液能抑制菌株Y的生長繁殖，那麼這種微生物的發酵液中就含有抑制腫瘤細胞DNA複製的抗腫瘤物質。篩選方法是將無菌小濾紙片貼到塗布有指示菌株Y的培養基平板表面，在濾紙片上加上20-30μl的微生物發酵液的無菌上清，於30-35℃培養12-16h，以抑制菌株Y生長的樣品為陽性，否則為陰性。陽性樣品中含有抑制腫瘤細胞DNA複製的抗腫瘤物質。本模型快速、簡便和準確，可實現高通量篩選，特別適合從複雜的各類微生物的代謝產物中篩選抑制腫瘤細胞DNA複製的抗腫瘤藥物。
文檔編號C12Q1/02GK101880705SQ20101019913
公開日2010年11月10日 申請日期2010年6月12日 優先權日2010年6月12日
發明者王琴, 辛明秀, 黃綺雯 申請人:辛明秀;王琴;黃綺雯