一種非破壞性測定花生單粒種子含油量的方法
2023-08-03 13:28:36 2
專利名稱：一種非破壞性測定花生單粒種子含油量的方法
技術領域：
本發明涉及花生種子品質成分的定量分析技術領域，具體是指一種應用傅立葉變換近紅外光譜分析技術、結合現代化學計量學方法的非破壞性測定花生單粒種子含油量的方法。
背景技術：
測定花生種子含油量的常規化學方法一般採用索氏法。該測定方法的取樣方式和樣品預處理方法均為破壞性的，也存在耗時費力、測定程序煩瑣、測定成本較高等缺點。在花生品質育種和遺傳研究中極為需要快速實時、操作簡單、不破壞樣品的分析方法。在以提高含油量為目的的花生品質育種中，迫切需要能在早期分離世代非破壞性地檢測出花生單粒種子含油量的分析技術，使育種者能在變異世代定向選擇高油性狀，從而使高油基因得以累加並能與高產、抗病等優良基因整合。毋用置疑，非破壞性分析技術已成為花生高油育種研究的瓶頸，嚴重阻礙育種效率的提高。
近十年來，由於近紅外光譜技術、化學計量學和計算機軟體技術的有機結合，使近紅外光譜技術在天然複雜物質的品質分析上發展迅速，應用範圍越來越廣泛，並以其測定速度快、操作簡便和對樣品的非破壞性等特點而日益受到重視。雖然應用近紅外光譜技術分析農產品品質成分的報導很多，但迄今為止未見有應用近紅外光譜技術非破壞性測定花生單粒種子含油量的報導。
發明內容
本發明的目的就是為了解決上述現有技術中存在的不足之處，提供一種快速實時、操作簡單、非破壞性測定花生單粒種子含油量的方法。
本發明所述一種非破壞性測定花生單粒種子含油量的方法，其特徵是，它包括如下步驟第一步 選擇有代表性的花生單粒種子作為建立多元回歸預測模型的標準樣品集；第二步 使用傅立葉變換近紅外光譜儀和光導纖維固體探頭測定標準樣品集中每個花生單粒種子樣品的漫反射光譜；第三步 採用索氏殘存法測定標準樣品集中每個花生單粒種子樣品的含油量，作為與樣品集近紅外光譜一一對應的化學值；第四步 採用多元校正方法建立和優化多元回歸預測模型，通過比較各種可能組合下預測模型的決定係數(R2)和均方根差(RMSECV)，選取R2儘可能大而RMSECV儘可能小的組合，RMSECV和R2按照以下方式確定RMSECV=1M(Differi)2]]>R2=1-(Differi)2(yi-ym)2]]>其中，Differi為第i個樣品的化學值和預測值之差，M為樣品數，yi為第i個樣品的化學值，ym為M個樣品預測值的平均值；第五步 按照第二步的方法採集未知樣品的近紅外光譜，將光譜輸入預測模型，從而確定未知樣品的含油量。
為了更好地實現本發明，本發明的另一發明點是用分步建模法來解決尋找有代表性樣品難的問題，可節省建模的時間和費用。花生種子是化學成分複雜的天然有機物質，無法象純化學物質那樣隨意人工配製各種濃度梯度的樣品，只能從大量的材料中篩選有代表性的樣品，而採用常規化學方法測定花生單粒種子含油量耗時費力，工作量很大且成效低。分步建模法的具體步驟是先隨機選擇50～60份樣品材料，按上述1～4步驟先建立一個基本模型；應用基本模型從大量的材料中尋找和篩選有代表性的樣品50～60份，測定其近紅外光譜和含油量化學值，將其作為建模樣品加入到基本模型中，按步驟4的方法進行建模和優化，獲得第一個優化模型；再重複上述步驟，獲得第二個、第三個以及更多的優化模型，直到獲得滿意的預測模型。
本發明的原理是，以傅立葉變換近紅外漫反射技術為基礎，結合現代化學計量學方法，採用漫反射測定方式，以多種基因型的花生單粒種子作為樣品背景，通過化學計量學方法建立多元回歸預測數學模型，再由模型測定未知樣品的含油量。
本發明適用於以提高花生含油量為目的的品質育種研究，可用於分離世代單粒種子含油量的非破壞性檢測，也適用於花生油分性狀遺傳規律研究和種質資源的評價利用。
本發明與現有技術相比，具有如下優點和有益效果
1.本發明是一種非破壞性的分析方法，以完整的花生單粒種子為測定對象，單粒種子不需要任何預處理就可快速檢測出其含油量，對種子的活力和組織結構無任何損傷。
2.本發明方法操作簡單、測定成本低，測定速度快，一個樣品僅耗時一分鐘，因此可在短期內處理大量樣品。
3.本發明方法的測定準確性較高，可滿足花生高油育種的要求。
圖1是本發明的流程圖；圖2是本發明實施例的漫反射光譜測定裝置的結構示意圖。
具體實施例方式
下面結合附圖和實施例，對本發明做進一步地詳細說明。
如圖1所示，本發明實施例的流程如下第一步 建模樣品集的選擇採用分步建模的方法來尋找有代表性樣品，選擇一定數量有代表性的不同基因型花生單粒種子作為建立模型的標準樣品集，樣品的數量以不少於150份為好，本實施例共選擇和收集了230個樣品作為標準樣品集。花生單粒種子材料來源於200個不同品種或品系，在分類上屬珍珠豆類型；材料來源還包括不同年份和季節以及不同產地。樣品集含油量的變化幅度為30.80％～66.89％，濃度梯度空間分布合理。在自然條件下曬乾花生種子，種子的含水量保持在8％以下。本發明所說的樣品代表性是指樣品遺傳背景的多樣化、時間(年份和季節)和空間(產地來源)分布的多樣化。樣品集代表性的好壞對預測模型的穩定性、適應性有很大影響。樣品集的材料類型越多越好，含油量變化幅度越大越好，濃度梯度的空間分布越均勻越好。
第二步 花生單粒種子近紅外光譜的測定本實施例使用德國布魯克公司生產的VECTOR 22/N型傅立葉變換近紅外光譜儀，儀器參數設置為掃描譜區為4000～10000cm-1，掃描次數為64次，解析度為8cm-1，以白陶瓷為背景。樣品近紅外光譜的測定是在花生單粒種子漫反射光譜測定裝置上完成。
花生單粒種子近紅外光譜的採集是利用光導纖維固體探頭、以漫反射方式進行的，可以在漫反射光譜測定裝置上完成。本實施例提供的一個專門設計的漫反射光譜測定裝置的結構如圖2所示，它的底座10上垂直固定有固定支架1，在固定支架1上依次安裝有2個固定夾3和可上下水平移動的平臺8，平臺8由旋鈕9手動控制，連接光導纖維2的固體探頭4的頭部垂直向下由固定夾3安裝在固定支架1上，在平臺8上正對固體探頭4安裝有白陶瓷7，白陶瓷7上固定有樣品墊圈6，其內放置單粒種子樣品5。
裝樣方法在可移動平臺上安放表面平滑的白陶瓷背景，將種子放置在其上，在種子下面可放置大小合適的墊圈，防止種子滾動；種子的子葉背面向上。
測定方法利用平臺上下移動使種子子葉背面中部與垂直的固體探頭頭部接觸，指令光譜儀開始掃描，1分鐘內即完成掃描，獲得樣品的漫反射近紅外光譜，掃描期間不要移動或振動樣品和固體探頭。
所有樣品近紅外光譜的測定均嚴格按照上述裝樣方法和測定方法進行。
第三步 花生單粒種子含油量的測定採用常規化學方法測定標準樣品集中每一樣品的含油量，作為與樣品集近紅外光譜一一對應的化學值。採用索氏殘存法測定花生單粒種子的含油量，在YG-2型脂肪抽提器中以乙醚抽提，具體操作步驟參考國家標準GB 2909-82。嚴格控制測定誤差，測定結果的標準差控制在1％左右為好。
第四步 預測數學模型的建立和優化建立預測數學模型採用的多元校正方法可以是偏最小二乘算法(PLS)、主成分回歸法(PCR)、逆最小二乘法(ILS)和多元線性回歸法(MLR)等。目前以偏最小二乘法(PLS)最為成熟，應用最廣。採用偏最小二乘算法(PLS)建立多元回歸預測數學模型。本實施例應用德國布魯克公司的OPUS4.2版本定量分析軟體進行多元回歸模型的校正和優化，同樣可採用其他商業化的同類型定量分析軟體來完成。
將標準樣品集中每個樣品的近紅外光譜和含油量化學值一一對應輸入OPUS定量分析軟體。利用在OPUS軟體中設置的自動尋找和優化功能尋找建立模型的最佳條件，通過比較各種可能組合下預測模型的決定係數(R2)和均方根差(RMSECV)，選取R2儘可能大而RMSECV儘可能小的組合。採用內部交叉證實對預測數學模型進行驗證。內部交叉證實是指依次剔除建模樣品集中一個(或多個)樣品，用剩餘樣品來建模預測被剔除樣品的含量，比較被剔除樣品預測值與化學值的差異，由此判斷所建模型的預測準確性。
RMSECV和R2由以下方式確定RMSECV=1M(Differi)2]]>R2=1-(Differi)2(yi-ym)2]]>其中Differi表示第i個樣品的化學值和預測值之差，M為樣品數，yi為第i個樣品的化學值，ym為M個樣品預測值的平均值。
由於在常規化學分析和近紅外光譜測定中不可避免出現誤差，在建模時需要對樣品近紅外光譜進行統計學上的顯著性檢驗，商業化軟體中均有此功能。在F檢驗時，設置檢驗異常閾值(F概率值)為0.99，將每一個建模樣品的化學值與預測值之間的誤差與平均誤差進行比較，得到相應的F值和F概率值。經F值檢驗，剔除誤差顯著的異常樣品。另外，樣品集的個數並非越多越好。根據「少而精」的原則，對建模樣品進行選擇和優化。在保證樣品集含油量變幅大、濃度梯度分布均勻的前提下，剔除在空間分布過度密集的樣品，同時儘量避免空間分布出現空洞。
經反覆測試比較，本實施例獲得建立花生單粒種子含油量多元回歸預測模型的最佳條件為最佳主成分維數為15，最佳譜區範圍為10000～6098cm2和4601～4247cm2，最佳光譜預處理方法為一階導數+直線遞減(先進行一階導數處理，再進行直線遞減處理)。由此而建立的預測模型有很高的質量，模型的決定係數(R2)為0.9785，測定誤差(RMSECV)為1.16％，與索氏殘存法的測定誤差1.15％相接近。
第五步 應用模型測定未知樣品建立好預測數學模型之後，就可以測定未知樣品(完整的花生單粒種子)的含油量。重複第二步採集未知樣品的近紅外光譜，將光譜輸入預測模型，計算機立即給出未知樣品的含油量。
用本實施例建立的模型測定30個花生單粒種子樣品的含油量，同時採用索氏殘存法測定其含油量作為對比，測定結果列於表1。由結果可見，兩種方法的測定結果很相近，絕對誤差和相對誤差都較小，表明本發明方法有較高的測定準確性。作為一種非破壞性和快速的測定方法，實際測定結果無疑是可以接受的。
表1.本實例測定花生單粒種子含油量的效果
如上所述，即可較好地實現本發明。
權利要求
1.一種非破壞性測定花生單粒種子含油量的方法，其特徵是，它包括如下步驟第一步選擇有代表性的花生單粒種子作為建立多元回歸預測模型的標準樣品集；第二步 使用傅立葉變換近紅外光譜儀和光導纖維固體探頭測定標準樣品集中每個花生單粒種子樣品的漫反射光譜；第三步 採用索氏殘存法測定標準樣品集中每個花生單粒種子樣品的含油量，作為與樣品集近紅外光譜一一對應的化學值；第四步採用多元校正方法建立和優化多元回歸預測模型，通過比較各種可能組合下預測模型的決定係數R2和均方根差RMSECV，選取R2儘可能大而RMSECV儘可能小的組合，RMSECV和R2按照以下方式確定RMSECV=1M(Differ)2---R2=1-(Differi)2(yi-ym)2]]>其中，Differi為第i個樣品的化學值和預測值之差，M為樣品數，yi為第i個樣品的化學值，ym為M個樣品預測值的平均值；第五步 按照第二步的方法採集未知樣品的近紅外光譜，將光譜輸入預測模型，從而確定未知樣品的含油量。
2.根據權利要求1所述的一種非破壞性測定花生單粒種子含油量的方法，其特徵是，所述有代表性的花生單粒種子的選擇採用分步建模法，先隨機選擇50～60份樣品材料，建立一個基本模型；應用基本模型從大量的材料中尋找和篩選有代表性的樣品50～60份，測定其近紅外光譜和含油量化學值，將其作為建模樣品加入到基本模型中，按第四步的方法進行建模和優化，獲得第一個優化模型；再重複上述步驟，獲得第二個、第三個以及更多的優化模型，直到獲得滿意的預測模型。
3.根據權利要求1所述的一種非破壞性測定花生單粒種子含油量的方法，其特徵是，所述漫反射光譜的測定採用如下裝置一個垂直固定有固定支架的底座，在固定支架上依次安裝有固定夾和可上下水平移動的平臺，平臺由旋鈕控制，連接光導纖維的固體探頭的頭部垂直向下由固定夾安裝在固定支架上，在平臺上正對固體探頭安裝有白陶瓷，白陶瓷上固定有樣品墊圈，其內放置單粒種子樣品。
4.根據權利要求3所述的一種非破壞性測定花生單粒種子含油量的方法，其特徵是，所述固體探頭頭部直接接觸種子子葉背面的中部。
5.根據權利要求1所述的一種非破壞性測定花生單粒種子含油量的方法，其特徵是，測定漫反射光譜時，所述花生單粒種子的裝樣方法是種子的子葉背面向上。
6.根據權利要求1所述的一種非破壞性測定花生單粒種子含油量的方法，其特徵是，建立多元回歸預測模型的最佳譜區範圍是10000～6098cm2和4601～4247cm2。
7.根據權利要求1所述的一種非破壞性測定花生單粒種子含油量的方法，其特徵是，建立多元回歸預測模型的最佳光譜預處理方法是先進行一階導數處理，再進行直線遞減處理。
8.根據權利要求1所述的一種非破壞性測定花生單粒種子含油量的方法，其特徵是，所述未知樣品是完整的花生單粒種子。
9.根據權利要求1所述的一種非破壞性測定花生單粒種子含油量的方法，其特徵是，所述多元校正方法包括偏最小二乘算法、主成分回歸法、逆最小二乘法、多元線性回歸法。
全文摘要
本發明是一種非破壞性測定花生單粒種子含油量的方法，該方法以傅立葉變換近紅外光譜技術為基礎，結合化學計量學方法，採用漫反射測定方式，以多種基因型的花生單粒種子為樣品背景建立多元回歸數學模型，再通過模型預測未知樣品的含油量。本發明方法是非破壞性的，不需要對樣品進行任何預處理，不傷害種子活力和組織結構。本發明方法操作簡單，測定速度快，測定準確性較高。本發明適用於花生高油品質育種、種質資源評價和遺傳規律研究。
文檔編號G01N21/47GK1544921SQ20031011233
公開日2004年11月10日 申請日期2003年11月26日 優先權日2003年11月26日
發明者曹幹, 曹 幹 申請人:廣東省農業科學院作物研究所