生產類胡蘿蔔素的方法
2023-08-03 18:20:46
專利名稱：生產類胡蘿蔔素的方法
技術領域：
本發明涉及一種利用微生物生產類胡蘿蔔素的生物學方法，所用微生物為Xanthophyllomyces(Phaffia)屬微生物，能在存在抑制焦磷酸法呢酯(farnesyl pyrophosphate)(此後稱為FPP)生物合成甾醇的抑制劑的前提下生產類胡蘿蔔素。
已報導的類胡蘿蔔素有600多種不同的種類，來自在細菌、酵母、真菌和植物中發現的類胡蘿蔔素源生物體。現在商業上以微生物生產的只有其中兩種，β-胡蘿蔔素和蝦青素，用於食品和飼料業。這些類胡蘿蔔素作為天然色素以及有益於人體健康的強抗氧化性的功能性物質，具有重要的工業價值。此外，從商業前景來看，對染色劑蝦青素的需求在增長，尤其是在養魚業中，比如鮭魚養殖，因為蝦青素(astaxanthin)使魚類帶鮮明的桔紅色而有助於吸引消費者。
其它類胡蘿蔔素，例如番茄紅素、玉米黃素、角黃素和β-隱黃素，它們作為天然的色素和抗氧劑也具有重要的工業價值。番茄紅素經體外試驗顯示能有效去除單態氧。番茄紅素抑制脂質過氧化作用，其血清水平與發生胰腺癌和子宮癌的危險成反比。水果和蔬菜，例如西紅柿、粉紅葡萄柚、中的紅色、紅葡萄皮、西瓜和紅番石榴之所以呈紅色，都是因為番茄紅素。其它膳食資源包括木瓜和杏。玉米黃素是黃色的胡蘿蔔素，它是一種氧化的β-胡蘿蔔素羥基衍生物。玉米黃素富含於菠菜、玉米和許多其它植物品種中。這是一種強抗氧化劑，在視網膜中也有發現。公認玉米黃素可以起到過濾器的作用，並能防護來自於眼睛的有害藍光和抵抗與年齡相關的斑點樣退化。角黃素是紅色的類胡蘿蔔素，在許多植物和動物身上都有發現。用於雞蛋黃、小雞和養殖的鱒魚的著色，以及用於要求更顯桔紅色的食品和化妝品中。角黃素也可起到單態氧的猝滅劑和自由基的滅火劑的作用。β-隱黃素是黃色的類胡蘿蔔素，存在於桔子、芒果、番木瓜、南瓜和許多其它水果中。β-隱黃素也被認為是一種預防癌症的強抗氧劑。
在能大量生產類胡蘿蔔素的微生物中，法夫紅酵母(Phaffiarhodozyma)是一種最為人所熟知的類胡蘿蔔素源菌株。該酵母菌株產生蝦青素，是現在用於供應食品和飼料業所需蝦青素的幾種微生物之一。在近期的分類學研究中，披露了一種法夫紅酵母的雄分生孢子(sexual cycle)，其遠距離刺激變形態(telemorphic state)被命名為Xanthophyllomycesdendrorhous[Golubev，Yeast 11101-110(1995)]。在本申請的描述中，取其眾所周知的名稱法夫紅酵母。
為了提高微生物生產類胡蘿蔔素的水平開展了一些研究，比如，包括使用合適的宿主菌株通過基因工程構造重組微生物使其獲得大量生產幾種類胡蘿蔔素的能力，這類菌株有大腸埃希氏桿菌、釀酒酵母和產朊假絲酵母[Misawa等，J.Bacteriol.1726704(1990)；Yamano等，Biosci.Biotech.Biochem.581112(1994)；Miura等，Biotechnol.Bioeng.58306(1998)]，改進菌株以獲得高產發生器，例如來自法夫紅酵母的蝦青素的高產發生器[Johnson等，Critical Reviews inBiotechnology11297-326(1991)]，改進方法以獲得最佳的發酵工藝，例如已實施的通過法夫紅酵母(US5,972,642)生產蝦青素的方法。US5,356,809公開了在法夫紅酵母細胞中加入抗黴素或另一種主要呼吸鏈抑制劑提高了蝦青素的產出。但該方法並不是特別有效和方便。顯然，仍然需要有一個簡單有效的方法來提高類胡蘿蔔素的產率。
本發明的一個實施方式是生產類胡蘿蔔素的生物學方法，其中包括有氧條件下在含水營養培養基中培養一種能在抑制劑抑制FPP生物合成甾醇的前提下生產類胡蘿蔔素的微生物。
更優選使用高度類胡蘿蔔素源微生物，例如屬於Xanthophyllomyces(Phaffia)屬的微生物。因而，本發明所述微生物優選的例子是Xanthophyllomyces(Phaffia)屬的微生物。本發明優選的Xanthophyllomyces(Phaffia)菌株得自美國典型培養物保藏中心，10801University Blvd.，Manassas，VA20110-2209，U.S.A.稱為Xanthophyllomyces(Phaffia)ATCC96594(根據布達佩斯條約再次於1998年4月8日保藏，保藏號ATCC74438)。
因而本發明特別地涉及到一種生產類胡蘿蔔素的方法，其中包括培養一種Xanthophyllomyces(Phaffia)屬的微生物在抑制劑抑制焦磷酸法呢酯生物合成甾醇的前提下生產類胡蘿蔔素，一種用於有氧條件下在含水營養培養基中生產類胡蘿蔔素的底物，以及從所述微生物的細胞或從培養基中分離出所得到的類胡蘿蔔素。
尤其是，對於本發明所述的生物學方法，更優選抑制甾醇途徑的初始反應，該反應由角鯊烯合酶催化。
據報導，角鯊烯合酶(在本領域也稱作角鯊烯合成酶)抑制劑可以降低細胞的甾醇水平。角鯊烯合酶是一種催化甾醇生物合成甾醇初始關鍵步驟的酶。兩分子的FPP縮合形成角鯊烯。
因而，本發明的另一個實施例是生產類胡蘿蔔素的生物學方法，其中包括培養一種能在抑制劑抑制角鯊烯合酶的前提下生產類胡蘿蔔素的微生物。
已報導了幾種角鯊烯合酶抑制劑[Biler等，Current PharmaceuticalDesign21-40(1996)]。報導的角鯊烯合酶抑制劑大致有三類，銨離子基角鯊烯合酶抑制劑、含FPP類似物的磷，和羧化物基抑制劑。本發明優選任一種角鯊烯合酶抑制劑。這些角鯊烯合酶抑制劑優選的例子之一是銨離子基角鯊烯合酶抑制劑。
而且，優選的銨離子基角鯊烯合酶抑制劑之一是苯氧丙胺型角鯊烯合酶抑制劑[Brown等，Journal of MedicinalChemistry384157-4160(1995)]。已知有很多苯氧丙胺型角鯊烯合酶抑制劑，比如，包括[3-(3-烯丙基-聯苯-4-基氧基)-丙基]-異丙基-胺，N-異丙基-3-(4-乙醯胺基-2-烯丙基苯氧基)丙胺，N-甲基-N-異丙基-3-(4-乙醯胺基-2-烯丙基苯氧基)丙胺，N-環戊基-3-(4-乙醯胺基-2-烯丙基苯氧基)丙胺，N-環丁基-3-(4-乙醯胺基-2-烯丙基苯氧基)丙胺，N-異丙基-3-(2-烯丙基-4-丁醯胺基苯氧基)丙胺，N-異丙基-3-(4-乙醯胺基-2-氯-苯氧基)丙胺，N-異丙基-3-(4-乙醯胺基-2-丙基苯氧基)丙胺，和N-異丙基-3-(4-乙醯胺基-2-烯丙基苯氧基)-1-甲基丙胺，和其生物學上可接受的鹽。
本發明實施例中所使用的優選的角鯊烯抑制劑包括[3-(3-烯丙基-聯苯-4-基氧基)-丙基]-異丙基-胺，N-異丙基-3-(4-乙醯胺基-2-烯丙基苯氧基)丙胺和N-甲基-N-異丙基-3-(4-乙醯胺基-2-烯丙基苯氧基)丙胺。
類胡蘿蔔素一般通過在培養基中培養一種類胡蘿蔔素源微生物來進行生產，培養基中包括適合於細胞的常量營養物或微量營養物，如糖蜜、蔗糖或葡萄糖，用作細胞生長的糖源，也作為類胡蘿蔔素生長的底物，以及氮源如玉米浸漬液、酵母提取物、硫酸二銨、磷酸銨、氨水或脲，磷源如磷酸銨和磷酸和加入的微量營養物或礦物鹽如硫酸鎂、硫酸鋅和生物素或脫硫生物素。
進行培養時優選的條件是pH值的範圍在4到8之間，且溫度範圍在15到26℃之間，培養時間24到500小時，更優選的培養條件是pH值的範圍在5到7之間，且溫度範圍在18到22℃之間，培養時間48到350小時。
進行培養時，進行通氣和攪拌通常會使類胡蘿蔔素的生產取得良好的結果。
在本發明中，抑制FPP生物合成甾醇的抑制劑被加入培養基中。相應地，抑制劑的濃度應根據抑制劑和用於生產類胡蘿蔔素的微生物的種類而改變，比如，濃度範圍使得在類胡蘿蔔素生產條件下細胞生長的減少小於50％。更優選的抑制劑濃度可以是在使細胞生長的減少小於30％濃度範圍內。
在本發明中，抑制FPP生物合成甾醇的抑制劑可以在培養的任何階段被加入培養基中。
按照本發明的方法通過培養類胡蘿蔔素源微生物所生產的類胡蘿蔔素，可以在被分泌進入培養基的情況下從培養基中將其分離出來，或者可以從微生物細胞中分離出來，並且如果想要一種特定的類胡蘿蔔素在需要時也可將其與其它的類胡蘿蔔素分開，分離方法是本領域所公知的[例如，Carotenoids VolIAIsolation and Analysis，Britton等，BirkhuserVerlag，Basel(1995)]。
根據本發明生產的類胡蘿蔔素可用於加工生產食品或飼料。本領域普通技術人員對此類方法都很熟悉。某些複合食品或飼料還可包括一些一般用於某種目的且為本領域所公知的添加劑或成分。
下述實施例進一步舉例說明本發明，但並不因此而限定了本發明的範圍。
實施例所用的角鯊烯合酶抑制劑是[3-(3-烯丙基-聯苯-4-基氧基)-丙基]-異丙基-胺，屬於苯氧丙胺型抑制劑系列中的一種。該化合物的合成是根據Brown等(supra)公開的方法將聯苯-4-酚(產品代碼H7751，Sigma，USA)與烯丙基溴和碳酸鉀在丁烷-2-酮中通過熱重排反應來生產3-烯丙基-聯苯-4-酚。3-烯丙基-聯苯-4-醇與1，3-二溴丙烷和碳酸鉀在丁烷-2-酮中進行反應，隨後與異丙胺在2-丙醇中反應得到[3-(3-烯丙基-聯苯-4-基氧基)-丙基]-異丙基-胺。
實施例1加入角鯊烯合酶抑制劑對法夫紅酵母細胞生長的影響將法夫紅酵母ATCC96594接種到YPD培養基上(DIFCO，Detroit，U.S.A.，在試管中有10mL)，在20℃下搖動試管培養2天。將0.5mL的培養物接種到新鮮的YPD培養基上(在試管中有10mL)，培養基含有30g/L的葡萄糖和各自0、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0和20.0μg/mL的[3-(3-烯丙基-聯苯-4-基氧基)-丙基]-異丙基-胺，在20℃下搖動試管培養5天。
不時地通過取回等量樣品的培養物，通過使用UV-1200光度計(ShimadzuCorp.，Kyoto，Japan)測量660nm下的光密度，來分析細胞生長。結果見表1。
當角鯊烯合酶抑制劑的濃度不高於2.0μg/mL時細胞生長不受影響。在第2天抑制劑5.0μg/mL條件下觀察到細胞生長約23％受到抑制。
實施例2加入角鯊烯抑制劑對法夫紅酵母生產蝦青素的影響如實施例1在YPD培養基中培養法夫紅酵母ATCC96594，20℃下搖瓶培養2天。將2.5mL的培養物接種到新鮮的YPD培養基上(在燒瓶中有50mL)，培養基含有22g/L的葡萄糖和各自0、0.5、1.0、2.0和5.0μg/mL的[3-(3-烯丙基-聯苯-4-基氧基)-丙基]-異丙基-胺，在20℃下搖瓶培養7天。培養的第2天，在培養基中加入50g/L的葡萄糖。也試驗了在培養的中期加入抑制劑。培養的第4天和第7天取回等量樣品的培養物，測定在660nm下的光密度(按照和實施例1所述的相同方法)和培養物中蝦青素的含量。
為了分析蝦青素的含量，將取回的培養液和溶劑混合物(乙醇、己烷和乙酸乙酯)混合，通過用玻璃珠劇烈搖瓶以從法夫紅酵母中提取類胡蘿蔔素。提取後，破裂的細胞和玻璃珠經離心除去，所得上清液用HPLC分析蝦青素含量。所用的HPLC條件如下HPLC柱Chrompack Lichrosorb si-60(4.6mm，250mm)溫度室溫洗脫液丙酮/己烷(18/82)加1ml/L的水到洗脫液上樣量10μl流速2.0ml/minute檢測UV在450nm下蝦青素的對照品得自Hoffmann La-Roche(Basel，Switzer-land)。結果見表2。
*相對值計算以沒有抑制劑時第7天的蝦青素含量為100。
**培養開始時沒有抑制劑，培養第2天加入5.0μg/mL的抑制劑。
在所有試驗條件下蝦青素的生產都有提高。當培養第2天加入抑制劑時所獲得的結果最好，而對於生產蝦青素來說在培養開始時加入抑制劑也同樣有效。
權利要求
1.一種生產類胡蘿蔔素的生物學方法，其中包括有氧條件下在含水營養培養基中，在存在抑制焦磷酸法呢酯生物合成甾醇的抑制劑下，培養一種能生產類胡蘿蔔素的微生物。
2.一種生產類胡蘿蔔素的生物學方法，其中包括在存在抑制焦磷酸法呢酯生物合成甾醇的抑制劑前提下，培養一種Xanthophyllomyces(Phaffia)屬的微生物生產類胡蘿蔔素，一種用於有氧條件下在含水營養培養基中生產類胡蘿蔔素的底物，以及從所述微生物的細胞或從培養基中分離出所得到的類胡蘿蔔素。
3.權利要求2的方法，其中的微生物是Xanthophyllomycesdendrorhous(法夫紅酵母)ATCC96594。
4.權利要求1或2的方法，其中用於抑制焦磷酸法呢酯生物合成甾醇的抑制劑選自角鯊烯合酶抑制劑類。
5.根據權利要求4的方法，其中的角鯊烯合酶抑制劑選自銨離子基的角鯊烯合酶抑制劑類。
6.根據權利要求5的方法，其中銨離子基的角鯊烯合酶抑制劑選自苯氧丙胺型角鯊烯合酶抑制劑類。
7.根據權利要求6的方法，其中苯氧丙胺型角鯊烯合酶抑制劑選自[3-(3-烯丙基-聯苯-4-基氧基)-丙基]-異丙基-胺，N-異丙基-3-(4-乙醯胺基-2-烯丙基苯氧基)丙胺，N-甲基-N-異丙基-3-(4-乙醯胺基-2-烯丙基苯氧基)丙胺，N-環戊基-3-(4-乙醯胺基-2-烯丙基苯氧基)丙胺，N-環丁基-3-(4-乙醯胺基-2-烯丙基苯氧基)丙胺，N-異丙基-3-(2-烯丙基-4-丁醯胺基苯氧基)丙胺，N-異丙基-3-(4-乙醯胺基-2-氯-苯氧基)丙胺，N-異丙基-3-(4-乙醯胺基-2-丙基苯氧基)丙胺，和N-異丙基-3-(4-乙醯胺基-2-烯丙基苯氧基)-1-甲基丙胺，和其生物學上可接受的鹽。
8.根據權利要求7的方法，其中苯氧丙胺型角鯊烯合酶抑制劑是[3-(3-烯丙基-聯苯-4-基氧基)-丙基]-異丙基-胺，或其生物學上可接受的鹽，N-異丙基-3-(4-乙醯胺基-2-烯丙基苯氧基)丙胺或N-甲基-N-異丙基-3-(4-乙醯胺基-2-烯丙基苯氧基)丙胺。
9.根據權利要求1或2的方法，其中所述抑制劑的濃度範圍使得在類胡蘿蔔素生產條件下細胞生長的減少小於50％。
10.根據權利要求9的方法，其中所述抑制劑的濃度範圍使得在類胡蘿蔔素生產條件下細胞生長的減少小於30％。
11.根據權利要求1或2的方法，其中進行培養時pH值的範圍在4到8之間，且溫度範圍在15到26℃之間，培養時間24到500小時。
12.根據權利要求11的方法，其中進行培養時pH值的範圍在5到7之間，且溫度範圍在18到22℃之間，培養時間48到350小時。
全文摘要
本發明涉及一種利用微生物生產類胡蘿蔔素的生物學方法，所用微生物為Xanthophyllomyces(Phaffia)屬微生物，能在抑制劑抑制焦磷酸法呢酯生物合成甾醇的前提下生產類胡蘿蔔素。
文檔編號C12R1/645GK1662658SQ03813933
公開日2005年8月31日 申請日期2003年4月10日 優先權日2002年6月21日
發明者星野達雄, 益田節子, 瀨戶口豐 申請人:Dsm Ip資產公司