一種基於DNAOrigami的DNA分子邏輯門及其構建方法與流程
2023-08-03 23:59:21
本發明屬於分子計算領域，具體涉及一種基於dnaorigami的dna分子邏輯門及其構建方法。
背景技術：
近年來，dna自組裝已經變成一種構建納米結構的強大的工具，在構建各種各樣的二維和三維結構方面有著廣泛的應用，包括平面陣列，柱形管以及各種幾何形狀。dnaorigami首次被rothemund發現，他通過一條長的dna單鏈m13與幾百條短的dnahelper鏈雜交形成了初步的納米結構，為研究人員提供了一種高效的能明確定義形狀和大小的dna納米結構的方法。現在，dnaorigami已經被應用在分子信號傳感和邏輯計算等各個領域。金顆粒具有獨特的結構和光學特性，一種能充分控制金顆粒與dna組裝的方法吸引著許多生物傳感和納米設備領域人員的關注。
elbaz和他的同事們通過一個三元環鏈狀的dna結構構造了一個動態的用燃料驅動的金顆粒設備，然而，這種簡單的dna環只能提供有限的不是很精確的金顆粒結合位點。因此，實現複雜的可以空間尋址的金顆粒排列依然是一個大的挑戰。
haoyan和他的同事們以dnaorigami(一種dna自組裝體)為模板，來控制金顆粒的組裝。使用這種方法，不同大小的金顆粒可以被排列到想要的位置，粒子之間的方向和位置都可以被控制。這項研究用靜態的方式向我們展示了納米粒子能與dnaorigami組裝，但是，設計一個具有動態操作特性的納米粒子和dnaorigami結合的策略仍然是令人關注的。此外，在大多數先前的納米粒子與dnaorigami組裝的納米系統中，實現同時多個輸入的邏輯操作是非常困難的，這極大的阻礙了基於dnaorigami的傳感系統的發展。
納米金顆粒(aunps)是指尺寸在1-100nm範圍內的粒子，一般為分散在水中的水溶膠，故又稱膠體金。由於納米金顆粒具有與大小、形狀和聚集程度相關的物理和化學特性，被廣泛應用於各種生物分析和生物醫學檢測技術中以及一些生物傳感器的檢測中。
技術實現要素：
本發明的目的是提出一種基於dnaorigami的dna分子邏輯門及其構建方法，具體技術方案如下：
一種基於dnaorigami的dna分子邏輯門包括：輸入信號、信號轉化器和輸出信號；
所述信號轉化器包括：dnaorigami模板、位於dnaorigami模板上的helper鏈，以及和helper鏈識別並連接的dna/aunp結合物；
所述helper鏈為dna鏈；
所述dna/aunp結合物包括dna鏈和與之結合的aunp；
一條所述helper鏈與所述dna/aunp結合物中的一條dna鏈雜交相連；
所述輸入信號為dna輸入鏈x-l；所述dna輸入鏈x-l與helper鏈雜交相連，並置換出dna/aunp結合物中的dna鏈，從而將dna/aunp結合物從dnaorigami模板上釋放；
所述輸出信號為dna/aunp結合物從dnaorigami模板上釋放。
所述dna/aunp結合物中dna鏈一端通過巰基化與aunp相連。
一種基於dnaorigami的dna分子邏輯門，所述dna/aunp結合物包括dna鏈x1』、y1』及與其兩者共同相連的aunp。
一種基於dnaorigami的dna分子邏輯門，所述dna/aunp結合物包括dna鏈x1』、y1』，及兩者分別相連的aunp。
一種基於dnaorigami的dna分子邏輯門，所述dna/aunp結合物包括dna鏈a1』、b1』、c1』、d1』，其中a1』、b1』與一aunp相連，c1』、d1』與另一aunp相連，b1』和c1』相連。
dna鏈分子之間的連接為雜交相連，所述雜交相連為完全互補或不完全互補。
所述dnaorigami模板為m13mp18鏈與staple鏈按摩爾比1:10的比例混合。
一種基於dnaorigami的dna分子邏輯門，所述邏輯門為或門，包括輸入信號、信號轉化器和輸出信號；
所述信號轉化器包括：dnaorigami模板、位於dnaorigami模板上的helper鏈b1,c1，以及和helper鏈識別並連接的dna/aunp結合物；
所述dna/aunp結合物包括dna鏈b1』，c1』和與兩者分別結合的aunp；
所述dna鏈b1，c1分別與dna鏈b1』，c1』雜交相連；
所述輸入信號為dna輸入鏈b1-l、c1-l或兩者混合；所述dna輸入鏈b1-l，c1-l分別與dna鏈b1，c1雜交相連，並置換dna鏈b1』，c1』；
所述輸出信號為dna/aunp結合物從dnaorigami模板上釋放。
一種基於dnaorigami的dna分子邏輯門，所述邏輯門為與門，包括輸入信號、信號轉化器和輸出信號；
所述信號轉化器包括：dnaorigami模板、位於dnaorigami模板上的helper鏈d1，e1，以及和helper鏈識別並連接的dna/aunp結合物；
所述dna/aunp結合物包括dna鏈d1』，e1』及與其兩者共同結合的aunp；
所述dna鏈d1』，e1』和aunp的摩爾比為1:1:1；
所述dna鏈d1，e1分別與dna鏈d1』，e1』雜交相連；
所述輸入信號為dna輸入鏈d1-l和e1-l；所述dna輸入鏈d1-l，e1-l分別與dna鏈d1，e1雜交相連，並置換dna鏈d1』，e1』；
所述輸出信號為dna/aunp結合物從dnaorigami模板上釋放。
一種基於dnaorigami的dna分子邏輯門，其特徵在於，所述邏輯門為多輸入與門，包括輸入信號、信號轉化器和輸出信號；
所述信號轉化器包括：dnaorigami模板、位於dnaorigami模板上的helper鏈f1，g1，以及和helper鏈識別並連接的dna/aunp結合物；
所述dna/aunp結合物包括dna鏈f1』，g1』，t1，t2和與之結合的aunp；其中f1』，t1與aunp相連；g1』，t2與另一aunp相連；所述dna鏈t1，t2分別與橋梁鏈t雜交相連；
所述dna鏈f1』、t1和aunp的摩爾比為1:1:1；所述dna鏈g1』、t2和aunp的摩爾比為1:1:1；
所述dna鏈f1，g1分別與dna鏈f1』，g1』雜交相連；
所述橋梁鏈t一端與t1鏈雜交相連，另一端與t2鏈雜交相連。
所述輸入信號為dna輸入鏈f1-l，g1-l，t-l；所述dna輸入鏈f1-l，g1-l，t-l分別與dna鏈f1，g1，t雜交相連，並置換dna鏈f1』，g1』，t1，t2；
所述輸出信號為dna/aunp結合物從dnaorigami模板上釋放。
一種基於dnaorigami的dna分子邏輯門的構建方法，包括如下步驟：
1)將m13mp18鏈與staple鏈按1:10的摩爾比在緩衝液中混和，並退火，組裝為dnaorigami模板，選取dna鏈，對其一端的dna序列按照所設計的序列進行延長，從而在dnaorigami模板表面特定位置延伸出來helper鏈；
2)將巰基化的與helper鏈雜交相連的dna鏈與aunp結合，形成dna/aunp結合物；
3)將步驟1)中所述的dnaorigami模板與步驟2)中所述的dna/aunp結合物雜交，形成aunp/origami結合物；
4)向步驟3)中加入dna輸入鏈，輸出信號為dna/aunp結合物從dnaorigami模板上釋放。
步驟1)中所述緩衝液為tae/mg2+緩衝液，其配製方法為：40mmtris，20mm乙酸，2mmedta，12.5mm醋酸鎂調到ph＝8.0。
本發明的有益效果為：
1、本發明基於dnaorigami的dna分子邏輯門在dnaorigami上通過特定的dna信號鏈來實現對金顆粒有選擇性和動態的釋放，從而實現邏輯門的運算；通過利用dna鏈連接的金顆粒二聚物實現了同時輸入3條輸入鏈的邏輯門運算。
2、本發明實現了動態的多輸入合作控制aunps的位置，並且操作結果能直接通過觀察aunps和dnaorigami之間特定的位置來獲得。
3、本發明為構造複雜的分子電路和納米器件提供思路；通過與各種納米工程策略相結合，也可用來組裝大型的可編程的結構，為各種分子構象的靈敏檢測鋪平了道路。
附圖說明
圖1為二輸入or邏輯門，其中，(a)為or門系統圖解，(b)為電泳圖，(c)為tem圖像和統計分析。
圖2為二輸入and邏輯門，其中，(a)為and門系統圖解，(b)為np-de-1電泳圖，(c)為tem圖和統計分析，(d)為np-de-2電泳圖。
圖3(a)為np-t形成圖，(b)為金顆粒二聚體電泳圖。
圖4為三輸入and邏輯門，其中，(a)為and門系統圖解，(b)為產物vii和產物viii的tem圖，(c)為通過uv照射的電泳圖，(d)為凝膠電泳圖。
具體實施方式
以下的實施例便於更好地理解本發明，但並不限定本發明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。
下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
實驗中所使用的dna鏈購自上海生工，未被修飾的鏈用page電泳純化；被修飾了二硫化物和螢光基的鏈通過高性能液相色譜法提純，相關dna分子序列見表1；m13mp18dna鏈從newenglandbiolabs購買；金顆粒從tedpellainc購買。
tae/mg2+緩衝液配製為：40mmtris，20mm乙酸，2mmedta，12.5mm醋酸鎂調到ph＝8.0。
丙烯醯胺母液配製如下：配製500ml，濃度為45％的丙烯醯胺母液，稱取217g丙烯醯胺和8g亞甲雙丙烯醯胺，在37℃下溶解,加入去離子水定容至500ml。
實施例1：二輸入或(or)邏輯門
(1)將1.6nm的m13mp18鏈(約7000個鹼基的環狀鏈)與202個短staple鏈(表1)以1:10的比例在1×tae/mg2+緩衝液裡面混和，並從90℃退火至室溫，組裝為dnaorigami-1模板,dnaorigami-1模板表面特定位置延伸出來3個helper鏈a1，b1，c1；
(2)巰基化的dna鏈a1′與15nm金顆粒(aunp)結合，形成dp-a結合物；巰基化的dna鏈b1′，c1′分別與5nm金顆粒(aunp)結合，形成dp-b和dp-c結合物；其中，鏈a1′，b1′，c1′能夠分別識別helper鏈a1，b1，c1；
(3)步驟(1)中dnaorigami-1模板與步驟(2)中dp-b和dp-c結合物雜交，形成aunp/origami結合物(產物i)，如圖1a；
(4)向步驟(3)中加入dna輸入鏈，通過使用鏈置換有選擇性的釋放aunp來實現邏輯運算。
np-b和np-c作為可以釋放的目標，而np-a作為一個參照物。dna輸入鏈b1-l和c1-l能識別helper鏈b1和c1上結合位點，並且能優先將鏈b1′，c1′置換出來，從而分別使得origami-1表面的np-b和np-c被釋放。「真」值的輸出由origami-1上的任何一個aunp的釋放來表示。
當只加入鏈c1-l時，np-c釋放形成產物ii(在origami-1表面只剩np-a和np-b)；當只加入鏈b1-l時，np-b從origami-1上釋放形成產物iii(在origami-1表面只剩np-a和np-c)；同時加入鏈c1-l和b1-l時，會形成產物iv(origami-1上只存在np-a)。
圖1b是圖1a中對應產物的凝膠電泳圖，泳道1對應的是origami-1，泳道2是產物i，泳道3是產物iii，泳道4是產物ii，泳道5是產物iv。泳道1中origami-1由於沒有aunps的存在移動最快，泳道2中的產物i由於存在aunps最多移動最慢，泳道3和4因釋放的都是5nm的aunp，所有位移相似，泳道5中的產物iv只含一個15nmaunp，所以位移只比泳道1中的origami-1慢。圖1c是對應產物的tem圖像，以及對應產物的統計分析，產物i，ii，iii，iv對應的產率分別為：58.3％，69.6％，61.4％，87.6％，這充分說明了在origami中的aunps能夠有選擇性的被釋放。
實施例2：二輸入與(and)邏輯門
(1)同實施例1中步驟，不同在於，組裝為dnaorigami-2模板，dnaorigami-2模板表面特定位置延伸出來3個helper鏈a1，d1，e1；
(2)巰基化的dna鏈a1′與15nm金顆粒(aunp)結合，形成dp-a結合物；巰基化的dna鏈d1′，e1′，5nm金顆粒(aunp)按照1：1:1的摩爾比結合形成dp-de-1結合物；其中，鏈a1′，d1′，e1′能夠分別識別helper鏈a1，d1，e1；
(3)步驟(1)中dnaorigami-2模板與步驟(2)中dp-a，dp-de-1結合物雜交，結合物np-de-1與origami-2通過鏈d1′/e1′和d1/e1相互雜交連接在一起，而作為參照的np-a也連接在origami-2表面，形成aunp/origami結合物(產物v)如圖2a；
(4)向步驟(3)中加入dna輸入鏈，通過使用鏈置換有選擇性的釋放aunp來實現邏輯運算。
dna輸入鏈d1-l和e1-l能夠識別helper鏈d1和e1上結合位點。
當只加入輸入鏈d1-l時，結合物np-de-1沒有從origami-2中分離。因為輸入鏈d1-l只能從中置換鏈d1′，而aunp上的鏈e1′與origami-2上的helper鏈e1仍然連接在一起。圖2b中的泳道3(產物v與輸入鏈d1-l充分反應後的產物)中的帶與泳道2(產物v)中帶的位移一樣，證明了我們的實驗設計。
當只加入輸入鏈e1-l時，結合物np-de-1沒有從origami-2中分離。因輸入鏈e1-l能將aunp中的e1′置換出來，而不能使得aunp從np-de-1結合物中分離。
當同時加入鏈d1-l和e1-l時，d1-l和e1-l會分別與origami-2上的d1和e1雜交，從而將5nmaunp上的鏈d1′和e1′置換出來，最後使得5nmaunp從origami-2中釋放。tem圖像也證明了「and」邏輯門操作。圖2c分別顯示了初始時5nmaunp和15nmaunp連在origami-2和只剩15nmaunp與origami-2相連的圖像，以及對應產物的比例分析。圖2b是對應產物的電泳圖，雖然圖中最終產物iv(泳道5)比初始產物v(泳道2)位移更快一些，但是很難區分。
為了更進一步的驗證二輸入「and」邏輯門，我們又設計了另一個aunp/origami組裝，是一個15nm的aunp上的鏈d1′/e1′與origami上的helper鏈d1/e1雜交形成，即產物vi，如圖2d，泳道1是其電泳位置，泳道2和3分別是只加鏈d1-l或e1-l的電泳位置，可以看出僅加入鏈d1-l或e1-l並不能使aunp與origami-2分離。同時加入d1-l和e1-l時，通過鏈置換15nmaunp從origami-2上分離，即產物vi，泳道4是其電泳位置，紅帶完全消失很好的證明了這一點。
實施例3三輸入與(and)邏輯門
(1)將1.6nm的m13mp18鏈(約7000個鹼基的環狀鏈)與202個短staple鏈以1:10的比例在1×tae/mg2+緩衝液裡面混和，並從90℃退火至室溫，組裝為dnaorigami-3模板，dnaorigami-3模板表面特定位置延伸出來2個helper鏈f1，g1；
(2)巰基化的dna鏈f1′、巰基化dna鏈t1與15nm的金顆粒aunp按照摩爾比1:1:1形成結合物np-m；巰基化的dna鏈g1′、巰基化dna鏈t2與15nm的金顆粒aunp按照摩爾比1:1:1形成結合物np-n；
(3)步驟(1)中dnaorigami-3模板、步驟(2)中dp-m、dp-n結合物與橋梁鏈t雜交，形成aunp/origami結合物(產物vii)；
(4)向步驟(3)中加入dna輸入鏈，通過使用鏈置換有選擇性的釋放aunp來實現邏輯運算。
其中，在橋梁鏈t(與t1，t2互補)存在的條件下，np-m和np-n會雜交在一起形成一個二聚物np-t，圖3b是這三種產物的電泳圖，泳道1，2，3分別是np-t，np-m，np-n，可以看出np-t比兩外兩個產物要慢很多。
圖4a中，np-t與origami-3通過互補鏈f1與f1′和g1與g1′雜交連接在一起形成三輸入多數計算「and」邏輯門的初始產物vii。而三條輸入鏈(t-l,f1-l,g1-l)是用於置換出產物vii中的aunp，輸出「真」表示有aunp從origami-3中分離。對這個系統來說，只要加入兩個或所有的輸入鏈，這輸出值就為「真」。
當只加入一條輸入鏈如f1-l時，鏈f1-l將會識別f1並置換出f1′，但是沒有aunp會從origami-3中釋放，從圖4b中tem圖中清晰的可以看到兩個aunp仍然連在origami-3上。在圖4c中泳道4中的帶與泳道3(產物vii)中帶有著相同的位移，這也證明了只加入一條輸入鏈時沒有aunp從origami-3中釋放，因此，當只有一條輸入鏈時，輸出結果為「假」。
當同時輸入任意兩條輸入鏈時(例如：t-l和g1-l)，t-l和g1-l分別會識別鏈t和g1′(通過t和g1′上的特異性識別位點)，將np-n從origami-3置換出來，使之分離。從電泳結果可以看出分離了np-n後的產物viii(圖4c中泳道5，圖4d中泳道3)的帶比產物vii的帶跑的更快。說明在origami-3產物viii上只有一個aunp，而產物vii上存在兩個aunp。tem圖如圖4b。
當同時加入三個輸入鏈(t-l，f1-，g1-l)時，t-l，f1-l，g1-l分別識別t，f1′和g1′，並將所有aunps完全從origami-3中置換出來，使之分離。從圖4d的電泳圖可以看出加入三條輸入鏈後原先的產物vii完全消失，說明兩個aunps完全從origami-3上分離。
表1