一種進行核酸擴增檢測的裝置及方法與流程

2023-08-05 12:15:31 4

本發明涉及生物檢測技術領域，具體涉及核酸擴增檢測技術及穿戴式醫療設備技術。

背景技術：

可穿戴式設備（wearabledevice）是直接能穿在身上、或直接整合到用戶的衣服或配件中的設備。該設備可以集成多媒體、傳感器和無線通信等技術，實現快速的數據獲取、超快的數據傳輸，擺脫傳統的手持設備而獲得無縫的網絡訪問體驗。具有佩戴舒適甚至無感、使用過程不幹擾正常生活、外觀適合使用場合和環境等優點。目前全球可穿戴市場規模約為30億~50億美元，且未來兩到三年有望成長為300億~500億美元的巨大市場，特別是隨著4g和移動終端的普及，可穿戴設備有巨大的發展潛力。目前應用最廣泛的可穿戴設備主要是眼鏡、手錶、手環和項鍊等，實現的功能主要是健康監測，如手環監測心率等；安全保障，如藍牙近距離通信實現錢包防竊等；以及遊戲娛樂，如kinect體感遊戲機等。隨著支撐技術的不斷進步，可穿戴產品朝著更輕便、更隱蔽、更快捷的方向轉變，時尚型和功能型將成為可穿戴產品的發展的兩條主線。隨著硬體技術及網際網路技術的發展，可穿戴產品的功能會更加的全面，並且具有巨大的市場潛力以及廣闊的發展空間。

醫療管理類可穿戴設備是目前最主要的發展方向。利用集成各種傳感器到可穿戴設備上，能夠長期實時監測人體中某種參數的指標。由於柔性材料如聚二甲基矽氧烷（pdms）、聚甲基丙烯酸甲脂（pmma）等在範德華力的作用下能夠和人體皮膚充分接觸，並且具有較好的透明性，傳熱效應和電化學電阻，通過工程處理之後可以做成彎曲的形狀，和皮膚更緊密的接觸，通常用於集成傳感器做成可穿戴設備。將柔性電流傳感器集成到隱形眼鏡中，用於檢測淚液中的葡萄糖含量；將生物傳感器集成到護口器中可用於檢測唾液中的乳酸含量；近期還研發出了將生物傳感器集成到臨時紋身中，以非入侵的方式測量人皮膚或間質液體中的汗液成分。將基於聚酯片的傳感器集成到柔性材料中，可用於記錄人體的腦電圖（eeg）、心電圖（ecg）和肌電圖（emg），並通過無線數據傳輸的方式將結果送入電腦終端，實時分析人體的檢測狀況。雖然目前的可穿戴設備的應用領域非常的廣泛，但至今沒有可穿戴設備可用於核酸擴增及檢測。

目前核酸擴增技術有很多種，最常見的就是聚合酶鏈式反應（polymerasechainreaction,pcr）。該方發是通過高溫下核酸的變性、延伸、復性的方法，但是需要有溫度循環的設備，所需條件較高，而一些恆溫擴增技術通過酶切割鹼基序列，需要一個恆定溫度即可實現核酸擴增，為可穿戴設備應用到核酸擴增領域提供了可能。重組酶聚合酶擴增技術（recombinasepolymeraseamplification,rpa）是一種恆溫擴增技術，擴增溫度為31~42˚c，接近於人體體溫，且能夠在十幾分鐘內將核酸擴增到可檢測的水平，是一種快速核酸恆溫擴增技術。

技術實現要素：

本發明首先要解決的技術問題是提供一種進行核酸擴增檢測的裝置，可以對核酸進行快速的檢測，且所需要的外部設備條件要求低，能夠隨時隨地進行檢測。

本發明解決上述技術問題所採用的技術方案是：一種進行核酸擴增檢測的裝置，包括檢測系統和晶片，晶片置於檢測系統內，檢測系統包括光激發設備和信號採集設備，由光激發設備發出的光，照射到晶片上，在檢測區域產生發射光，經過濾得到螢光信號，信號採集設備採集該螢光信號從而進行檢測，該晶片能夠被集成在穿戴設備上。

在採用上述技術方案的同時，本發明還可以採用一下進一步的技術方案：

檢測系統包括殼體，殼體內設有驅動設備、光激發設備、信號採集設備、檢測設備和檢測腔室，驅動設備包括電源和變壓器，驅動設備為光激發設備和信號採集設備供電，光激發設備包括風扇、散熱器和led光源，檢測設備包括激發片、二向分鏡和發射片，信號採集設備為工業相機，激發片置於led光源的前端，發射片置於工業相機的鏡頭前端，二向分鏡和晶片置於檢測腔室內，光激發設備位於檢測腔室的一側且led光源朝向檢測腔室的方向，工業相機位於檢測腔室的上方且鏡頭朝向檢測腔室的方向，晶片置於檢測腔室的底部，二向分鏡在檢測腔室內成45度角放置，其一面朝向光激發設備，另一面朝向工業相機。

晶片包括設置在中部的六邊形的反應腔室，該反應腔室的兩端分別設有進液口和出液口，反應腔室的上下兩面分別設有頂層和底層作為封層，當晶片置於檢測腔室內時，其下方設有加熱片，加熱片由驅動設備供電。

晶片是具有生物相容性的高分子聚合物晶片，例如pdms，晶片的頂層包含通道結構，晶片的底層是0.5mm厚的pdms膜，pdms通道的厚度為0.5-1.5mm，進液口和出液口的孔徑為1-4mm。

晶片頂層的通道結構為單通道結構或多通道結構，通道的總體積不小於50µl。

led光源的功率為5-15w。

激發片的帶通波長為435-480nm。

發射片的帶通波長為500-560nm。

該晶片能夠被集成在腕錶上，佩帶在人體手腕處。

本發明所要解決的另一個技術問題是提供一種進行核酸擴增檢測的方法，該方法應用上述的裝置，並包括以下步驟：

（1）測量人體溫度：向晶片中注水，將晶片通過穿戴設備固定在人體皮膚表面，通過熱電偶測量晶片中的液體溫度，驗證用人體體溫擴增的可行性；

（2）構建核酸檢測的標準曲線：

（2.1）從原始濃度的核酸模板開始按比例稀釋，得到梯度稀釋的模板濃度；

（2.2）按照rpa試劑盒說明書上的方法，配置好反應所需混合物；

（2.3）在混合物中加入不同濃度的模板和醋酸鎂充分混勻；

（2.4）將混勻後的反應物從進液口打入晶片，放入檢測系統，拍照記錄螢光強度；

（2.5）將晶片佩戴在人體皮膚表面，通過人體體溫進行擴增，反應一定時間後，取出晶片放入檢測系統中拍照記錄；

重複步驟（2.1）-（2.5）至少三次，

（2.6）imagej分析檢測區域的綠色螢光強度，根據反應結束後的螢光強度建立標準曲線；

（3）樣本濃度檢測：按照步驟（2.1）-（2.5）檢測樣本並將檢測結果帶入標準曲線中，得到樣本中的核酸濃度。

本發明的有益效果是：本發明設計了與人體皮膚直接接觸的可穿戴設備，將含有rpa試劑的晶片插入手錶中，利用手腕處的體溫提供rpa擴增所需的溫度，通過自帶的光學系統檢測反應後產生的螢光信號。利用本發明的裝置可以對核酸進行快速的檢測，甚至可以定量核酸的含量，且所需要的外部設備條件要求低，在貧困地區也可以廣泛使用，對貧困地區易發生的重大傳染病如hiv、hbv、ebola和zika等檢測具有重大的意義，對一些突發性疾病病原檢測如mers、流感等也有重要的意義。由於檢測所需要的時間短，只要20分鐘左右，也適用於出入境的人員做傳染病檢測。該方法在快速核酸檢測、傳染病防治等方面擁有廣闊的商業潛力。

附圖說明

圖1是晶片的結構圖。

圖2是晶片的分解狀態示意圖。

圖3是檢測裝置的結構圖。

圖4是實時螢光擴增結果圖。

圖5是核酸濃度檢測標準曲線。

圖中標號：1-晶片，2-頂層，2-1-進液口，2-2-出液口，2-3-反應腔室，3-底層，4-加熱片，5-光激發設備，5-1-風扇，5-2-散熱器，5-3-led光源，6-電源，7-驅動設備，8-工業相機，9-檢測系統，9-1-發射片，9-2-二巷分鏡，9-3-激發片，10-二號擋板，11-檢測腔室。

具體實施方式

以下結合實施例對本發明的技術方案作進一步詳細說明，實施例僅用於解釋本發明的實施方式或過程，不是對本發明保護範圍的限定。

實施例1，一種進行核酸擴增檢測的裝置，參照附圖1-3。

本發明提供一種進行核酸擴增檢測的裝置，該裝置能夠利用穿戴設備佩帶在人體皮膚表面，從而感受人體溫度，進行核酸擴增檢測，具體來說，本發明的裝置包括檢測系統9和晶片1，晶片1可以被置於穿戴設備，例如腕帶或腕錶中，從而與人體皮膚直接接觸。

晶片1的具體結構是：晶片1包括設置在中部的六邊形的反應腔室2-3，該反應腔室2-3的兩端分別設有進液口2-1和出液口2-2，反應腔室2-3的上下兩面分別設有頂層2和底層3作為封層，當晶片1置於檢測系統9的檢測腔室內時，其下方設有加熱片4，加熱片4由檢測系統9內的驅動設備7供電。

本發明中的晶片1是具有生物相容性的高分子聚合物晶片，例如pdms，晶片1的頂層2中包含通道結構，通道結構可以是單通道結構或多通道結構，只需要保證通道的總體積不小於50µl。當晶片1位pdms時，晶片1的底層3是0.5mm厚的pdms膜，pdms通道的厚度為0.5-1.5mm，進液口2-1和出液口2-2的孔徑為1-4mm。

檢測系統9包括光激發設備5和信號採集設備，由光激發設備5發出的光，照射到晶片1上，在檢測區域產生發射光，經過濾得到螢光信號，信號採集設備採集該螢光信號從而進行檢測。

檢測系統9包括殼體，殼體內設有驅動設備7、光激發設備5、信號採集設備、檢測設備和檢測腔室11，驅動設備7為光激發設備和信號採集設備供電，驅動設備7包括電源6和變壓器，變壓器將電源6的電源轉換為不同的電壓，以適應檢測系統中不同用電裝置的需求。

光激發設備5包括風扇5-1、散熱器5-2和led光源5-3，風扇5-1的額定電壓為12v，led光源5-3的功率為11w，額定電壓為11v，所需電壓由電源6提供，且由驅動模塊7中的變壓器轉換為對應的電壓。

檢測設備包括激發片9-3、二向分鏡9-2和發射片9-1，信號採集設備為工業相機8，激發片9-3置於led光源5-3的前端，發射片9-1置於工業相機8的鏡頭前端且貼緊工業相機8的鏡頭，二向分鏡9-2和晶片1置於檢測腔室11內，激發片9-3的中心波長為475nm，帶寬為40nm，距led光源5-3的距離為2.3mm；光激發設備5位於檢測腔室11的右側且led光源5-3的發射方向朝向檢測腔室的方向，工業相機8位於檢測腔室11的上方且鏡頭朝向檢測腔室11的方向，晶片置於檢測腔室的底部，檢測腔室11是55×55mm的正方形腔室，二向分鏡在檢測腔室內成45度角放置，其一面朝向光激發設備，另一面朝向工業相機，二號擋板10是一塊黑色的pmma板，用於遮住幹擾光，距激發片9-3的距離為2.3mm，防止散射光產生背景幹擾。

實施例2，構建標準曲線，參照附圖5。

本實施例使用hiv-1dna質粒為檢測模板，將混合物注入晶片中，晶片通過手錶與人體緊貼，利用人體體溫擴增核酸，並檢測，建立不同濃度的標準曲線。具體包括如下步驟：

（1）從原始濃度109copies/ml的hiv-1dna質粒模板開始按1：10的比例稀釋，得到梯度稀釋的模板濃度。

（2）rpa試劑盒購買自twist，按照配套說明書上的方法，29.5µlrehydrationbuffer,2.1µlprimer-f，2.1µlprimer-r，0.6µlprobe和3.2µl水，配置好混合物。

（3）在混合物中加入10copies/mlhiv-1dna模板10µl，2.5µl醋酸鎂充分混勻，得反應物。

（4）在冰上將反應物打入晶片4中，放到檢測系統中，ccd工業相機8拍照記錄檢測區域初始反應的螢光強度。

（5）將晶片鑲嵌在手錶中，配戴在人體的手腕處，反應24分鐘後，取出晶片置於檢測系統中拍照記錄。

（6）將（2）中的模板分別換成模板濃度為105-102copies/m，重複(2)-(5)。

（7）重複(2)-(6)三次。

（8）imagej分析檢測區域2-3的綠色螢光強度，根據反應結束後的螢光強度建立標準曲線。

（9）陰性對照組使用rna-free水代替核酸模板，重複(4)-(5)。標準曲線如圖4。

實施例3，核酸擴增檢測，參照附圖4。

1）在pdms晶片1中打入50µl水，放置在加熱片上4，插入熱電偶測通道中水的溫度，調節加熱溫度，使水的溫度達到33~34˚c,模仿體溫。

2）將hiv-1dna質粒濃度從109copies/ml開始按1:10開始稀釋，得到不同的濃度梯度。

2）根據rpa試劑說明書的方法，29.5µlrehydrationbuffer,2.1µlprimer-f,2.1µlprimer-r,0.6µlprobe和3.2µl水，配置好混合物。

3）加入10copies/ml的hiv-1dna模板10µl，醋酸鎂2.5µl，充分混勻，得反應物。

4）在冰上將反應物打入晶片1中，放到檢測系統中，ccd工業相機8拍照記錄檢測區域初始反應的螢光強度。

5）加熱片4開始加熱，工業相機8每隔三分鐘記錄一次擴增圖像，共統計到30分鐘。

6）濃度為105~102copies/mlhiv-1dna作為擴增模板，重複步驟6）~8）。

7）重複5）~9）三次。

8）imagej分析檢測區域2-3的螢光強度，建立實時螢光擴增曲線。檢測結果如圖3。