純化白蛋白的方法

2023-08-05 20:32:41

專利名稱：純化白蛋白的方法
技術領域：
本發明涉及一種用於純化白蛋白、其變體或片段)，含白蛋白、其變體或片段的融合蛋白，或者含白蛋白、其變體或片段)的綴合物的方法。白蛋白可以是獲得自動物或微生物如酵母的血清白蛋白，如人血清白蛋白。
背景技術：
白蛋白用於治療有嚴重燒傷，休克或失血的病人。它也用於補充培養高等真核細胞的培養基和作為藥理學活性化合物(其中許多需要穩定化)的賦形劑。白蛋白融合蛋白是一種蛋白與白蛋白或與其變體或片段的融合體，並且提高所述蛋白的半衰期，如增加的體內半衰期。目前，白蛋白是從血液產品，如血清中獲得，或在微生物，如酵母中或由轉基因植物或動物重組產生。為了提供足夠純的產品以滿足使用者的需要和/或獲得高產量的產品，白蛋白必須從生產源中純化出來。目前白蛋白產品的一個問題是所需的純化方法。能夠獲得高純度但是這需要多個費時和/或昂貴的層析純化步驟。例如，WO 2000/044772中描述的純化方法包括三步驟的方法陽離子交換層析然後是陰離子交換層析然後是染料結合(親和)層析。因此，需要一種更簡單的純化方法。

發明內容
本發明提供一種更簡單的白蛋白純化方法。因此本發明涉及一種用於純化白蛋白或其變體或片段、含白蛋白或其變體或片段的融合蛋白或者含白蛋白或其變體或片段的綴合物的方法，該方法包括(i)用包含白蛋白或其變體或片段、含白蛋白或其變體或片段的融合蛋白或者含白蛋白或其變體或片段的綴合物的水溶液上樣於包含結合在固體支持物上的白蛋白特異性配體的固體基質；(ii)洗滌所述基質以除去至少一些雜質；並(iii)從基質上洗脫白蛋白或其變體或片段、含白蛋白或其變體或片段的融合蛋白或者含白蛋白或其變體或片段的綴合物，獲得純化的白蛋白或其變體或片段、含白蛋白或其變體或片段的融合蛋白或者含白蛋白或其變體或片段的綴合物。發明人已鑑定了可以用一種單一親和步驟代替先前白蛋白純化中使用的公知的分離步驟，如陽離子交換和染料結合方法，所述單一親和步驟相對於這些公知步驟提高了不想要的蛋白的清除和/或提高了產量。在整個本說明書中，術語「白蛋白」包括天然存在的白蛋白、白蛋白相關蛋白和其變體，如天然的或工程化的變體。變體包括多態性，片段如結構域和亞結構域，片段和/或融合蛋白。白蛋白可與SEQ ID No. 1具有至少40，50，60，70，80，90，95，96，97，98，99%的相似性或同一性。附圖簡述

圖1. Prosaptide白蛋白融合體純化的SDS-PAGE，見實施例2。
泳道樣品上樣
1.rHA1昭
2.上樣1/100
3.上樣1/1000
4.穿透(Flow Through)nt.
5.洗塗1nt.
6.洗滌2nt.
7.洗滌3nt.
8.洗滌4nt.
9.洗脫1/1000
10.rHA1昭圖2顯示T20白蛋白融合體純化的SDS-PAGE，見實施例2。
泳道樣品上樣
1.上樣1/100
2.上樣1/1000
3.穿透Nt
4.洗滌1Nt
5.洗滌2Nt
6.洗滌3Nt
7.洗滌4Nt
8.洗脫1/100
9.洗脫1/1000
10.rHA1昭圖3顯示ILlRA白蛋白融合體純化的SDS-PAGE，見實施例2。泳道樣品上樣
1.上樣1/100
2.上樣1/1000
3.穿透nt
4.洗滌1nt
5.洗塗2nt
6.洗塗3nt
7.洗滌4nt
8.洗脫1/100
9.洗脫1/1000
10.rHA1昭圖4顯示AlbuPureTM純化的動物白蛋白的SDS-PAGE，見實施例8。
IB泳道 2B樣品3B上樣
_1__SeeBlue Plus2 MW 標準品__5|iL
2__兔血清白蛋白__2|ig3__小鼠血清白蛋白__2昭
_4__大鼠血清白蛋白__2\ig
5__狗血清白蛋白__2|ig
_6__人血清白蛋白__2μ§,_
_7_I SeeBlue Plus2 MW 標準品5|iL圖5顯示AlbuPureTM純化的白蛋白片段的SDS-PAGE，見實施例8。
泳道_樣品___
J__人血清白蛋白__Ipg
_2__人血清白蛋白結構域1+2__l|igJ__人血清白蛋白結構域2+3__l|ig
_4__人血清白蛋白結構域1+3__l|ig
J__人血清白蛋白結構域3__l|ig
_6_I SeeBlue Plus2 MW 標準品5|iL發明詳述本發明涉及一種純化白蛋白或其變體或片段、含白蛋白或其變體或片段的融合蛋
白或者含白蛋白或其變體或片段的綴合物的方法。在本申請和權利要求中，術語「純化」意
指一種方法，通過該方法至少一種不希望得到的化合物，如細胞碎片、其他血漿或宿主細胞
蛋白、鹽、脂質碳水化合物等，相對於希望得到的化合物減少了。取決於用於此方法的起始
材料，可從希望得到的化合物，白蛋白或其變體或片段、含白蛋白或其變體或片段的融合蛋
白中完全地或部分地除去不希望得到的化合物。
作為血漿的最豐富的蛋白質，白蛋白是本領域已知的，人們已經從大量哺乳動物和禽類中描述和表徵了白蛋白，並認為其在維持正確的滲透壓中具有作用並且其在轉運血流中多種化合物中也具有作用。原則上本發明的方法可用於純化任何已知白蛋白，例如源自人、狗、綿羊、山羊、牛 (bovine)、奶牛(cow)、驢、兔、小鼠、大鼠、倉鼠、豚鼠和雞(chicken)的白蛋白。優選的白蛋白是人血清白蛋白，尤其是具有SEQ ID NO 1中公開的序列的人血清白蛋白。本發明所述的白蛋白變體意指具有白蛋白整體結構但與親本白蛋白相比已改變了至少一個胺基酸殘基的化合物。其中親本白蛋白是理解為天然的未改變的白蛋白化合物。變體可與親本白蛋白在多於一個位置上不同，而且原則上只要變體保持白蛋白的整體結構，對於改變的數目沒有確定的上限，所述改變包括胺基酸殘基的取代、缺失或插入以及化學修飾。在一個優選實施方案中，與親本白蛋白相比白蛋白變體包含1個改變，優選地至少2個改變，更優選至少5個改變，更優選至少10個改變，甚至更優選至少20個改變，以及最優選具有至少25個改變。白蛋白變體與親本白蛋白優選地具有至少60%的序列同一性，優選地至少70% 的序列同一性，更優選至少80%的序列同一性，甚至更優選至少90%的序列同一性，甚至更優選至少95%的序列同一性，最優選與親本白蛋白具有至少98%的序列同一性。在一個優選實施方案中，白蛋白或其片段或變體與SEQ ID No. 1具有至少40，50， 60，70，80，90，95，96，97，98，99% 的序列同一性。同一性兩條胺基酸序列之間或兩條核苷酸序列之間的相關性由參數「同一性」來描述。就本發明而言，兩條胺基酸序列之間的同一性的程度是使用如EMBOSS程序包 (EMBOSS :The European Molecular Biology Open SoftwareSuite, Rice 等，2000, Trends in Genetics 16 :276-277)(優選版本3. 0. 0或更新的版本)中的Needle程序所執行的 Needleman-Wunsch 算法(Needleman 和 Wunsch，1970，J. Mol. Biol. 48 :443-453)來確定的。 使用的可選參數是缺口產生罰分為10，缺口延伸罰分為0. 5，以及EBL0SUM62(BL0SUM62的 EMBOSS版本)取代矩陣。將標記為「最長同一性」的Needle輸出(使用-nobrief選項獲得)用作百分比同一性，其是如下計算的(相同的殘基數XlOO)/(比對的長度-比對中的缺口總數)。在描述本發明的多種變體時，應用下述的命名法以便參考。在所有的情況中，應用了公認的IUPAC單字母或三字母胺基酸縮寫。取代對於胺基酸取代，採用了如下的命名法[原始胺基酸，位置，取代的胺基酸]。因此，蘇氨酸在位置2 用丙氨酸取代記為「Thr2^Ala」或「T226A」。多個位置突變通過加入標記(「 + 」)分開，例如，「Gly205Arg+kr411Phe」或「G205R+S411F」，代表分別在位置205用精氨酸(R)取代甘氨酸(G)和在位置411用苯丙氨酸(F)取代絲氨酸( 的突變。缺失對於胺基酸缺失，採用了如下命名法[原始胺基酸，位置 。因此，在位置 195缺失甘氨酸記為「Glyl95*」或「G195*」。多個缺失通過加入標記(「 +，，)分開，例如， "Glyl95*+Ser4ir」 或 「G195*+S411*，，。插入對於胺基酸插入，採用了如下的命名法[原始胺基酸，位置，原始胺基酸，新插入的胺基酸]。因此，在位置195的甘氨酸之後插入賴氨酸記為「Glyl95GlyLys」或 「G195GK」。多個胺基酸插入記為[原始胺基酸，位置，原始胺基酸，新插入的胺基酸#1， 新插入的胺基酸#2 ；等等]。例如，在位置195的甘氨酸之後插入賴氨酸和丙氨酸記為 「Glyl95GlyLysAla」 或 「G195GKA，，。在此情況下，通過在插入的胺基酸殘基前的胺基酸殘基的位置號添加小寫字母而對插入的胺基酸殘基進行編號。因此，在上一例子中序列為
權利要求
1.一種用於純化白蛋白或其變體或片段、含白蛋白或其變體或片段的融合蛋白或者含白蛋白或其變體或片段的綴合物的方法，所述方法包括(i)用含白蛋白或其變體或片段、含白蛋白或其變體或片段的融合蛋白或者含白蛋白或其變體或片段的綴合物的水溶液上樣包含結合在固體支持物上的白蛋白特異性配體的固體基質；( )洗滌所述基質以除去至少一些雜質；並(iii)從所述基質上洗脫白蛋白或其變體或片段、含白蛋白或其變體或片段的融合蛋白或者含白蛋白或其變體或片段的綴合物，以提供純化的白蛋白或其變體或片段、含白蛋白或其變體或片段的融合蛋白或者含白蛋白或其變體或片段的綴合物。
2.依照權利要求1所述的方法，其中所述白蛋白源自哺乳動物，如人、兔、小鼠、山羊、 綿羊、牛；或者源自禽類，如雞。
3.依照權利要求1或2所述的方法，其中所述白蛋白或其變體或片段、含白蛋白或其變體或片段的融合蛋白或者含白蛋白或其變體或片段的綴合物含有與HSA的序列(SEQ ID NO 1)具有至少60 %序列同一性，優選至少70 %，優選至少80 %，優選至少85 %同一性，更優選至少90%同一性，甚至更優選至少95%同一性，甚至更優選至少97%的序列同一性， 以及最優選至少99%序列同一性的序列。
4.依照權利要求3所述的方法，其中與HSA具有至少80%序列同一性的序列包含至少10個連續的胺基酸，更優選至少25個胺基酸，更優選至少50個胺基酸，以及最優選至少 100個胺基酸。
5.依照權利要求1所述的方法，其中所述白蛋白特異性配體是2-氯-4，6-二O』-硫代苯胺)-S-三嗪。
6.依照權利要求1所述的方法，其中所述包含白蛋白或其變體或片段、含白蛋白(或其變體或片段)的融合蛋白或者含白蛋白(或其變體或片段)的綴合物的水溶液選自發酵上清液、部分純化的發酵上清液、血清、血清級分或者部分純化的血清或血清級分、轉基因原料的乳或者轉基因植物的提取物。
7.依照權利要求1或權利要求6所述的方法，其中上樣到所述基質上的包含白蛋白或其變體或片段、含白蛋白或其變體或片段的融合蛋白或者含白蛋白或其變體或片段的綴合物的水溶液具有4-9. 5，更優選pH4-9，甚至更優選4-8，以及最優選4_7的pH。
8.依照權利要求1所述的方法，其中所述洗滌是通過具有連續升高的PH的一次或多次洗滌進行的。
9.依照權利要求8所述的方法，其中第一次洗滌具有在pH4.0-6.0的範圍內的pH。
10.依照權利要求8或9所述的方法，其中最後一次洗滌具有在pH7.0-8. 0的範圍內的pH。
11.依照權利要求8-10所述的方法，其中在第一次和最後一次洗滌步驟之間具有至少一次額外的洗滌步驟。
12.依照權利要求1所述的方法，其中使用含有脂肪酸的鹽或硫氰酸鹽的水溶液，或者在PHlO或更高的條件下，從所述基質上洗脫所述白蛋白或其變體或片段、含白蛋白或其變體或片段的融合蛋白或者含白蛋白或其變體或片段的綴合物。
13.依照權利要求12所述的方法，其中所述的脂肪酸的鹽在水中具有大於IOmM的溶解度。
14.依照權利要求13所述的方法，其中所述的脂肪酸鹽是選自丁酸、戊酸、己酸、庚酸、 辛酸、壬酸、癸酸的鹽。
15.依照權利要求12-14所述的方法，其中洗脫緩衝液中所述脂肪酸鹽的濃度是在 5mM-0. 5mM的範圍內，優選在IOmM-IOOmM的範圍內。
16.依照權利要求12所述的方法，其中所述硫氰酸鹽是選自鈉、鉀、銨、鋇或其他1族或 2族鹼金屬的鹽。
17.依照權利要求12或16所述的方法，其中所述硫氰酸鹽以5mM-lM的範圍內，優選 10mM-500mM的範圍內的濃度使用。
全文摘要
公開了一種改進的純化白蛋白(或其變體或片段)、含白蛋白(或其變體或片段)的融合蛋白或者含白蛋白(或其變體或片段)的綴合物的方法。
文檔編號C07K14/765GK102549012SQ201080019924
公開日2012年7月4日 申請日期2010年5月7日 優先權日2009年5月7日
發明者J.卡梅隆, L.E.布拉克威爾, M.J.伯頓, P.H.莫頓, R.A.多德, S.J.伯頓 申請人:普羅米蒂克生物科學有限公司, 諾維信生物製藥丹麥公司