集核酸擴增和微陣列檢測於一體的微流控裝置的製作方法

2023-08-05 13:03:26 1

本發明涉及生物分析領域中一種用於核酸分析晶片的微流控裝置，特別是一種集核酸擴增和微陣列檢測於一體的微流控裝置。

背景技術：
隨著生物技術的發展，對於核酸的檢測和分析被越來越多的應用於各種檢測目標，包括醫療診斷、司法鑑定、食品檢測、學術研究等。通常，用於核酸分析的樣品都是微量的，所以需要將含有目標核酸分子的基因片段進行擴增，然後再用於定性和定量檢測。聚合酶鏈反應(PCR)是核酸擴增反應最常見的一種。擴增產物的檢測通常有實時螢光檢測、凝膠電泳、毛細管電泳以及微陣列檢測。其中微陣列技術能夠同時檢測多個核酸目標序列，為實施樣品的複雜分析提供了很好的平臺。通常微陣列分析有如下步驟：核酸擴增，將擴增產物與雜交試劑混合，將雜交混合物轉移到微陣列系統，孵化雜交反應，洗液清洗，檢測。傳統的方法中每一步操作都需要相配套的儀器，以及人工操作來完成試劑的轉移和添加。在打開反應管的過程中會將反應試劑暴露在空氣中，極易造成樣品與環境的交叉汙染。這對檢測環境及操作人員都提出了要求。目前，很多公司推出了集成核酸擴增和雜交檢測的產品。一類平臺利用大型設備中的機械手完成各個反應步驟間的操作，包括核酸擴增、雜交檢測以及擴增前的核酸提取。如TruSentryTMSystem(AkonniBiosystems)，Prove-itTMStripArray(Mibidiag)，但仍然在開放的體系中實現溶液的轉移，無法解決體系封閉的問題。另一類平臺是在封閉的卡盒或晶片中設置不同的反應腔室，藉助外部設備及卡盒或晶片的特殊設計操縱液體在不同反應腔室之間的轉移。如iCubateSystem(Icubate)利用卡盒內部的移液槍轉移液體；UnyveroTMSolution(CuretisAG)將微陣列探針固定在PCR反應室上端的特殊的多孔膜上，通過氣壓控制液體上下移動；RheonixCARDTM(Rheonix)藉助於氣動閥和氣動泵完成試劑的添加和反應室間的溶液轉移。這些設備都需要複雜的泵閥設計以完成液體的轉移，且卡盒式裝置難以藉助微流控系統內密閉的流體環境實現流體往復運動以加快雜交反應的進程，而微流控晶片裝置中設置核酸擴增室則需要複雜的加工工藝使裝置能夠承受PCR反應過程中的熱壓。因此，仍需要改進技術使診斷裝置在保證檢測靈敏度的同時，具有更短的檢測時間以及更低的成本。

技術實現要素：
本發明的目的是提供一種集核酸擴增和微陣列檢測於一體的微流控裝置，本發明將核酸擴增反應設在外置的擴增反應管內減少了對微流控晶片加工的要求，且配合微流控體系內動態雜交的技術，能夠大大縮短檢測的時間。本發明所提供的一種集核酸擴增和微陣列檢測於一體的微流控裝置，包括微流控晶片、擴增反應管和雜交檢測室；所述微流控晶片上設有若干個樣品池、若干個雜交試劑池和若干個混合池，所述樣品池和所述雜交試劑池均通過蓋子進行密封；所述擴增反應管的數量與所述樣品池相同，所述擴增反應管設於所述微流控晶片的上部，所述擴增反應管的一端通過接頭裝置和設於所述微流控晶片內的流體通道Ⅰ相連接，且所述流體通道Ⅰ和所述樣品池相連通，另一端通過所述接頭裝置和設於所述微流控晶片內的流體通道Ⅱ相連接，且所述流體通道Ⅱ與所述混合池相連通；所述混合池的頂部設有一通孔Ⅰ；所述雜交檢測室設於所述微流控晶片內，所述雜交檢測室包括2個流體入口和1個流體出口，一個所述流體入口通過設於所述微流控晶片內的流體通道Ⅲ與設於所述微流控晶片上的一通孔Ⅱ相連通，另一個所述流體入口通過設於所述微流控晶片內的流體通道Ⅳ與所述混合池相連通；所述流體出口通過設於所述微流控晶片上的流體通道Ⅴ與設於所述微流控晶片上的一通孔Ⅲ相連通；所述雜交試劑池通過設於所述微流控晶片內的流體通道Ⅵ與所述混合池相連通。上述的微流控裝置中，所述蓋子上設有一氣孔，所述氣孔靠近所述樣品池和所述雜交試劑池一側貼附有一疏水透氣膜，所述氣孔能夠保證所述微流控裝置內的氣壓與外界保持相對平衡，所述疏水透氣膜則能夠防止核酸擴增的汙染物進入大氣中。上述的微流控裝置中，所述流體通道Ⅰ、所述流體通道Ⅱ、流體通道Ⅳ和流體通道Ⅵ上均設有一閥結構；所述閥結構可分別控制所述流體通道Ⅰ、所述流體通道Ⅱ、流體通道Ⅳ和流體通道Ⅵ的開閉。上述的微流控裝置中，所述擴增反應管的材質可為玻璃、石英、橡膠或塑料等。上述的微流控裝置中，所述擴增反應管通過矽膠軟管與所述接頭裝置相連接。上述的微流控裝置中，所述微流控裝置還包括一支撐平臺，所述支撐平臺上設有金屬板，所述金屬板上設有若干個凹槽，所述擴增反應管設於所述凹槽內；使用本發明時，所述金屬板與加熱冷卻元件緊密貼合，藉助於所述金屬板良好的導熱性能夠實現所述擴增反應管內溶液溫度的快速升降。上述的微流控裝置中，所述混合池的容積大於所述樣品池和所述雜交試劑池的總容積，以避免所述混合池內溶液通過其頂部設置的通孔進入外圍流路。上述的微流控裝置中，所述接頭裝置為螺紋接頭或套管接頭；所述閥結構為膜片閥、相變閥或扭矩閥。本發明微流控裝置應用於核酸擴增和雜交檢測中。本發明微流控裝置應用時，所述核酸為DNA或RNA。使用本發明的微流控裝置進行試驗時，將微流體晶片上的通孔與外圍流路相連通。所述外圍流路上設有至少一個驅動流體流動的泵，至少一個控制外圍流體流路的閥。所述泵可以為柱塞泵或蠕動泵。所用泵連接有步進電機，可以精密地控制微升級單位體積。晶片內液體的位置可通過泵的步進距離精確控制，所用閥可以為夾管閥。外圍流路連接至少一個清洗液室和一個廢液室，用於雜交孵育完成後，檢測室的清洗操作。所述微流體裝置上的通孔與外圍流路的連接可以通過接口裝置實現緊密貼合，接口裝置內有O型圈以增強密封效果。連接後的整個流路系統形成相對閉合的體系，以避免分析檢測過程中的汙染問題。本發明微流體裝置與上述外圍流路連接好後，與檢測儀器進行配合工作。使用時，用戶只需要將樣品和試劑加入樣品池和雜交試劑池中，然後將該裝置插入儀器中。儀器經過預先設定好的工作流程完成指令，給出實驗結果。本發明提供的微流控裝置實現了自動化的核酸擴增和雜交檢測，減少了對操作人員的要求並且整體實驗環境密封，避免了環境汙染問題；該裝置將核酸擴增反應設在外置的擴增反應管內，從而減少了對微流控晶片加工的要求，降低製作成本。且配合微流控體系內動態雜交的技術，能夠大大縮短檢測的時間。附圖說明圖1為本發明微流控裝置的結構示意圖。圖2為本發明微流控裝置使用時的系統控制示意圖。圖3為本發明微流控裝置檢測的耳聾基因的實驗結果，其中圖3(a)為微陣列晶片探針排布圖，圖3(b)為完成操作後採集的圖像。圖中各標記如下：1微流控晶片、11樣品池、111蓋子、112氣孔、113疏水透氣膜、12雜交試劑池、13接頭裝置、14支撐平臺、15混合池、2核酸擴增反應平臺、21擴增反應管、22矽膠軟管、23金屬板、3微陣列檢測平臺、31雜交檢測室、32流體入口、33流體入口、34流體出口、40閥結構、51通孔Ⅰ、52通孔Ⅱ、53通孔Ⅲ。具體實施方式下面結合附圖對本發明做進一步說明，但本發明並不局限於以下實施例。如圖1所示，本發明提供的微流控裝置包括微流控晶片1、核酸擴增反應平臺2和微陣列檢測平臺3。微流控晶片1上設有2個樣品池11、1個雜交試劑池12和1個混合池15。樣品池11通過可拆卸的蓋子111進行密封，蓋子111上有一個氣孔112，蓋子111內側貼有防氣溶膠的疏水透氣膜113。使用時打開蓋子111，將擴增反應的樣品和雜交試劑加入相應的樣品池11和雜交試劑池12(通過蓋子密封)中，再將蓋子111扣緊。樣品池11與擴增反應管21相連通。在該實施例中，擴增反應管21為不透氣的矽膠硬管，一端通過矽膠軟管22連接在微流控晶片1上凸起的接頭裝置13上，然後通過設置於微流控晶片1內的流體通道Ⅰ與樣品池11相連通；另一端通過矽膠軟管22連接在微流控晶片1上凸起的接頭裝置13上，然後通過設置於微流控晶片1內的流體通道Ⅱ與混合池15相連通。矽膠軟管22的內徑比擴增反應管21的接頭裝置13的外圍尺寸略小，矽膠軟管22的彈性張力保證其與擴增反應管21及接頭裝置13的連接口緊密閉合。矽膠軟管22還將配合儀器中壓管閥裝置用來控制擴增反應管21中流體的流入和流出。也可通過在流體通道Ⅰ上設置閥結構40來控制通道的開閉。此外，該實施例還包括有金屬板23，可將擴增反應管21包埋在其上設置的凹槽(圖中未標)內。微流控晶片1上可加工有支撐平臺14以支撐金屬板23和矽膠軟管22，金屬板23也可固定在儀器中，擴增反應管21放到金屬板23的槽(圖中未示)。該微流控晶片1插入儀器後，金屬板23與加熱冷卻元件緊密貼合，藉助於金屬板良好的導熱性能實現反應室內溶液溫度的快速升降。擴增後的反應液通過設有壓管閥的矽膠軟管22進入混合池15。雜交試劑池12通過設置於微流控晶片1內的流體通道Ⅵ與混合池15相連通，在該流體通道Ⅵ上設有閥結構40以控制通道的開閉。所用閥為常開的膜片閥。當沒有外力作用時，管道為連通狀態；當外力作用管道上方的彈性膜時，膜發生形變從而堵塞管道的連接口。微陣列檢測平臺3上設有雜交檢測室31，它包括2個流體入口32和33，一個流體出口34，流體入口33通過設於微流控晶片1內的流體通道Ⅲ與設於微流控晶片1上的一通孔Ⅱ52相連通，流體入口32通過設於微流控晶片1內的流體通道Ⅳ與混合池15相連通；流體出口34通過設於微流控晶片1上的流體通道Ⅴ與設於微流控晶片1上的通孔Ⅲ53相連通。混合池15的頂部設有通孔Ⅰ51，與外圍流路的泵相連。核酸擴增後的產物與雜交試劑在泵閥裝置驅動下順序流入混合池15中，並通過泵的往復運動使其充分混合。混合後的溶液輸送至雜交檢測室31中。雜交檢測室31也將與儀器中溫控元件、光學檢測元件以及外圍流路的連接裝置協調放置。雜交室的流體入口33將通過晶片上通孔Ⅱ52與外圍流路連接，流體出口34將通過晶片通孔Ⅲ53與外圍流路連接。外圍流路設有洗液室、廢液室以及泵、閥等裝置。雜交過程中可以通過控制加熱元件實現對雜交腔體的溫度控制，同時也可以通過泵控制雜交腔體內流體的往復運動來加快雜交反應的進程。雜交反應完成後，在外圍流路的控制下實現雜交腔室的清洗，乾燥等步驟。圖2為本發明上述微流控裝置的一種分析系統的示意圖。該系統包括：微流體裝置；用於控制擴增平臺2和檢測平臺3的溫控裝置61和62；配合微流體裝置中閥結構40和矽膠軟管22的下壓閥裝置41、42、43、44、45和46，以及控制外圍流路的夾管閥47、48和49；驅動液體流動的蠕動泵8；外圍流路的液體存儲裝置71、72和73。液體存儲裝置71、72可以為洗液池或空氣池，通過通孔Ⅱ52流入雜交檢測室31。流體存儲裝置73可以為廢液池用於收集系統中的廢液。驅動液體流動的泵8設置在系統的最末端，泵通過雙向閥49分別通過混合池15頂部的通孔53和雜交檢測室流體出口端的通孔Ⅲ53與微流控裝置相連。雜交檢測室31的上方還設有光學檢測元件9，用來對反應結果進行檢測。根據本發明上述提供的微流體裝置和分析系統進行試驗，試驗過程如下：取晶芯九項遺傳性耳聾基因檢測試劑盒(微陣列晶片法)(博奧生物有限公司)。按照試劑盒說明書提取全血或濾紙幹血斑中的基因組DNA。將提取的DNA按照一定的體積比例與試劑盒中PCR擴增反應體系混合。使用者打開本發明微流控裝置上樣品池的蓋子，用移液器將混合的PCR反應液加入樣品池中，再蓋上蓋。同樣將雜交試劑加入試劑池中，再加蓋閉合。將加完試劑後的裝置在系統初始化完成後插入到儀器中，儀器將自動完成剩餘操作。具體的系統操作過程如下：1、系統初始化：1)準備洗液：將洗瓶71中裝入洗液1(0.3XSSC和0.1％SDS)，洗瓶72中裝入洗液2(0.06XSSC)2)系統預充液：打開夾管閥47、將雙向閥49切換至a端閉合，b端打開，洗液池71與廢液池73之間通過與儀器內流路的連接(未顯示)形成閉合流路，蠕動泵逆時針運動使該分支流路充滿液體。關閉夾管閥47，打開夾管閥48，切換夾管閥49至另外一側，將外圍流路的另一條支路充滿液體。2、裝卡盒：將加完樣品和試劑的卡盒裝入儀器，儀器內的光學或磁性感應器驗證卡盒的位置；同時，通過彈簧或卡槽設計將卡盒與加熱原件緊密貼合；外圍流路的接口也與相應的卡盒通孔貼緊。3、擴增：關閉所有閥，將連接泵的雙向閥49切換至a端打開，b端閉合；打開閥41、42，將樣品池中液體抽至擴增室中，關閉41、42；同理，控制閥43、44，將另一樣品池中樣品抽至相應擴增室；按照說明書要求設定PCR反應熱循環程序進行PCR擴增反應。4、混合：順序打開壓管閥41、42和43、44，將擴增反應後的反應液抽至混合池，完成後關閉閥；打開閥45，將雜交液也抽至混合池；蠕動泵進一步通過正反向運動往復抽吸溶液以混合雜交反應液。5、雜交：打開閥46，將雙向閥49切換至b側打開，將混合的雜交反應液輸送至雜交檢測室31；設定溫控模塊的反應溫度為60℃，進行雜交反應；且在雜交過程中，蠕動泵通過正反向的往復運動驅動雜交檢測室內反應液往復運動，實現動態雜交。6、清洗：將溫控裝置60℃溫度降至25℃；打開夾管閥47，抽取洗液池71中洗液，洗液經過雜交腔體流入廢液室；同樣，用洗液池72中洗液清洗雜交腔體。7、檢測：通過LED光源和CCD相機裝置採集圖像或視頻文件。圖3(a)為微陣列晶片探針排布圖，圖3(b)為完成以上操作後採集的圖像。圖像中，參照點和樣品點出現很強的螢光信號，表現出顯著的檢測功能。