副豬嗜血桿菌免疫原性蛋白基因PilA的應用的製作方法

2023-08-06 01:40:46 3

專利名稱：副豬嗜血桿菌免疫原性蛋白基因PilA的應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於獸醫微生物學和動物傳染病技術領域。具體涉及副豬嗜血桿菌的一個 具有免疫原性蛋白基因的分離、克隆以及它編碼的蛋白在疫苗和診斷中的應用。
背景技術：
副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis, HPS)是巴斯德菌科的一種革蘭氏陰性小 桿菌，是副豬嗜血桿菌病(GMsser's disease)的病原體。作為當前危害世界養豬業最為嚴 重的細菌性傳染病之一，副豬嗜血桿菌病可以影響2周齡到4月齡的豬，仔豬主要在斷奶前 後和保育階段發病，通常見於5 8周齡的豬，發病率一般在10% 15%，嚴重時死亡率 高達50%。主要臨床症狀表現為咳嗽、呼吸困難、消瘦、跋行和死亡；剖檢的主要病變表現 為多發性漿膜炎(纖維素性胸膜炎、心包炎、腹膜炎)、關節炎和腦膜炎等。副豬嗜血桿菌 還可引起敗血症，並且在急性感染後可能留下後遺症，即母豬流產、公豬慢性跛行，增加了 種豬的淘汰率。此外，由於豬群中副豬嗜血桿菌的帶菌率很高，在豬群發生豬繁殖與呼吸綜 合徵、豬圓環病毒病等病毒性傳染病時，副豬嗜血桿菌病的發病率會急劇升高，危害更為嚴 重，造成大批豬死亡。近年來，副豬嗜血桿菌病在規模化豬場的高健康豬群的發病率和死亡率都顯著 升高(Cai X，Chen H，Blackall P J，Yin，Z，Wang, L，Liu Z and Jin Μ. Serological characterization of Haemophilus parasuis isolatesfrom China.Vet Microbiol， 2005，111 :231-236)。由於該病在多數情況下爆發突然，抗生素等抗微生物藥物的治療作用 非常有限，而且耐藥性的產生迅速，因此，藥物和免疫預防是防控該病的主要途徑。目前，常 規滅活菌苗是世界上唯一可以用於該病免疫防治的一類疫苗，在包括中國在內的多個國家 實現了商業化。這些滅活疫苗一般由2個或3個血清型的地方流行菌株製備而成(Baumarm G，Bilkei G. Effect of vaccinatingsows and their piglets on the development of Glasser's disease induced by a virulent strain of Haemophilusparasuis serovar 5. Vet Rec，2002，151 18-21 ；Bak H，Riising H J. Protection of vaccinated pigs againstexperimental infection with homologous and heterologous Haemophilus parasuis. Vet Rec, 2002,151 :502_505)，但是，目前已經鑑定的副豬嗜血桿菌至少有15種 血清型，還有約12%的分離株尚不能分型，而且不同國家和地區流行的優勢血清型不盡相 同，不同血清型菌株之間缺乏或僅能提供有限的交叉免疫保護，常規多價滅活疫苗的交叉 免疫保護率有限，只有在流行菌株血清型相符的地區的豬群中才能提供較好的免疫保護 (Oliveira S,Pijoan C. Haemophilus parasuis :new trends on diagnosis,epidemiology and control. Vet Microbiol，2004b，99 :1-12)。因此，副豬嗜血桿菌保守的保護性抗原的 鑑定是該病新型疫苗研製的技術關鍵。到目前為止，國際上關於副豬嗜血桿菌保護性抗原 的報導還較少，周明光等2009年發表於Vaccine上的一篇論文首次做了對四個蛋白外膜蛋 白PalA，0mp2，D15和假設蛋白HPS 06257的免疫原性做了初步的研究(Zhou Μ, Guo Y, Zhao J, Hu Q, Hu Y,Zhang A,Chen H,Jin M. Identification and characterization of novel
3immunogenicouter membrane proteins of Haemophilus parasuis serovar 5.Vaccine, 2009,27(38) :5271_7)。PilA蛋白屬於蛋白質二型分泌系統IV型菌毛(Type IV Pili) ；PilA蛋白與DNA 的攝取相關；致病過程中介導細菌吸附於黏膜上皮細胞完成入侵的第一步，在流感嗜血杆 菌中pilA基因對其菌毛及生物被膜的產生以及對該病原菌在哺乳動物上呼吸道上皮細胞 的定植起著重要的作用。程安春等(2007)將鴨源和雞源致病性大腸桿菌的PilA重組蛋白 疫苗，分別在雛鴨和雛雞進行免疫，能得到很高的ELIAS抗體效價，通過攻毒實驗觀察，該 重組蛋白對宿主有著有效地保護效果(程安春，於小娜，汪銘書，朱德康，李玲，孫磊，陳孝 躍.鴨源致病性大腸桿菌I型菌毛PilA基因的原核表達及重組蛋白對強毒攻擊的免疫保 護作用.生物工程學報，2007，23:440-445;於珊，張倩，水小溪，於宙亮，趙寶華.致病性雞 大腸桿菌PilA基因和外膜蛋白C基因的克隆.生物工程學報，2008，24 :1561_1567)。

發明內容
本研究的目的在於克隆一個具有免疫原性的副豬嗜血桿菌的蛋白基因，利用其編 碼的蛋白應用於研製對副豬嗜血桿菌感染具有保護力的亞單位疫苗和診斷試劑中。本發明是這樣實現的申請人:從副豬嗜血桿菌的地方分離株SH0165菌株(菌株來源參見實施例1)中克 隆到IV型菌毛蛋白基因PilA。經過測序發現本發明的蛋白基因PilA其編碼區由453個 鹼基組成，具有序列表SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列。經過序列分析發現的pilA基因 編碼的蛋白PilA是由150個經過序列分析發現本發明的pil4基因編碼的蛋白PilA是由 286個胺基酸殘基組成，具有序列表SEQ ID NO :1所示的胺基酸序列，去掉信號肽部分之後 表達蛋白預計分子量大小為15kDa。通過原核表達和室內生物測定證實本發明的基因pilA 在微生物中表達的PilA蛋白，能夠對副豬嗜血感染有保護作用，這就預示著該蛋白可以用 於研製副豬嗜血桿菌的亞單位疫苗。本發明提供的上述基因序列是副豬嗜血桿菌的具有免疫原性的蛋白基因，該蛋白 還可以應用於對於副豬嗜血桿菌的診斷和疫苗的研製中。更詳細的技術方案參考實施例部分的描述。


序列表SEQ ID NO :1是本發明分離克隆的副豬嗜血桿菌免疫原性蛋白基因的核苷 酸序列及其編碼的蛋白質序列；圖1 是本發明實施例中副豬嗜血桿菌免疫原性蛋白基因PilA所在的原核表達載 體pET28a/Hps-pilA的構建圖和物理圖譜；圖2 是本發明實施例中副豬嗜血桿菌免疫原性蛋白基因pilA在重組菌BL21中 表達純化的SDS-PAGE電泳分析；圖中M 蛋白質分子量標準；圖3 評估免疫原性蛋白免疫仔豬後的抗體水平；圖4 蛋白對仔豬免疫的致死保護率；具體實施方案以下敘述是根據本發明實施方案的實施例。應該說明的是，本發明的實施例對於 本發明只有說明作用，而沒有限制作用。有關DNA的標準操作方法和所使用的藥品均參考 《分子克隆實驗指南》所描述的內容(參見薩姆布魯克和拉塞爾，2001，分子克隆實驗指南， 第三版，金冬雁等(譯)，科學出版社，北京)。本發明中所涉及的其他各種實驗操作，均為 本領域的常規技術，文中沒有特別說明的部分，本領域的普通技術人員可以參照本發明申 請日之前的各種常用工具書、科技文獻或相關的說明書、手冊等加以實施。實施例1副豬嗜血桿菌SH0165菌株免疫原性蛋白基因pilA的克隆本發明以副豬嗜血桿菌SH0165作為免疫原性蛋白基因pilA的來源菌株(該 菌株的來源見文獻Yue Μ, Yang F，Yang J, Bei W, Cai X，Chen L，Dong J, Zhou R， Jin M, Jin Q, Chen H. Complete genome sequence ofHaemophilus parasuis SH0165. J Bacteriol. 2009,191(4) 1359-60)該菌株為地方分離株，血清型5型，感染了一定劑量的該菌株的仔豬或青年豬會 在4日內發病或死亡，為高毒力菌株1.副豬嗜血桿菌SH0165中免疫原性蛋白基因pilA的克隆利用副豬嗜血桿菌SH0165的基因組為模板，申請人依據該基因的特異序列並在 兩端引入酶切位點BamHI和XhoI設計上遊引物Pl (引物序列為5 』-ATAGGATCCTCTTACACCA GTTACAC-3，)和下遊引物 P2(引物序列為5，-ATACTCGAGTTATTGCCTACAGAAATTC-3，)，進行 PCR擴增以獲得目標基因，PCR反應的體系和程序如下25 μ L 反應體系包含2· 5 μ LlOXPCR 反應緩衝液，1 μ LdNTP (各 2. 5mM)，0. 5 μ L 特異性上遊引物Pl (20mM),0. 5 μ L特異性下遊引物Ρ2 (20mM)，1 μ L模板(副豬嗜血桿菌 SH0165),0. 25 μ LEx Taq酶，加滅菌去離子水至25 μ L。PCR反應參數和程序為94°C，5min， 1 個循環;94°C，30s，60°C，30s，72°C，lmin，30 個循環；72°C, IOmin, 1 個循環。將擴增到的目標片段通過PCR產物回收試劑盒購自生工生物工程(上海)有限 公司純化回收後通過T/A克隆連接到T載體pMD18-T Simple Vector上(購自TaKaRa公 司)，將目標片段連接到pET28a購自默克公司(上海)得到含有pilA全長序列的重組質 粒pET28a/HpS-pilA(見圖1)。之後將該重組質粒轉化大腸桿菌(E. coli)DH5 α，並塗布卡 那黴素抗性平板(KanK，終濃度為50μ g/mL)。將抗性平板置於37°C培養箱中培養12_16h， 待轉化子長到一定大小以後，篩選轉化子。將篩選到的轉化子用5mL的液體LB培養基活化 培養，然後抽提質粒進行酶切驗證，酶切片段大小與預期大小一致。最後將篩選到的陽性轉 化子用5mL的液體LB培養基活化培養，取ImL的過夜培養物送樣測序(由北京三博遠志生 物技術有限責任公司完成)。測序結果顯示該基因具有如序列表SEQ ID NO :1中所示的核 苷酸序列，申請人將該基因命名為PilA(在本發明中，被命名的基因以斜體小寫表示)。通 過軟體分析預測此段編碼序列可編碼一個如序列表SEQ ID NO :1中所示的由116個胺基酸 組成的多肽片段，預測其分子量為15kDa，申請人將其命名為PilA(在本發明中，被命名的 蛋白以正體大寫表示)。申請人:將上述轉化了重組質粒pET28a/HpS-pilA的重組大腸桿菌命名為大腸杆 菌(Escherichia coli) DH5 α/Hps-pi 1A，於2009年12月16日將該重組大腸桿菌送交湖北 省武漢市武漢大學內的中國典型培養物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏編號為CCTCCN0
5M209303。實施例2副豬嗜血桿菌免疫原性蛋白基因PilA在大腸桿菌BL21中的表達純化及 對副豬嗜血感染保護力的檢測1.副豬嗜血桿菌免疫原性蛋白基因PilA在大腸桿菌BL21中的表達和純化為了大量表達pilA蛋白，申請人將上述攜帶有其編碼序列的重組表達質粒 pET28a/Hps-pilA轉化到大腸桿菌BL21 (大腸桿菌購自Tiangen公司)中，得到了重組菌 BL21/pET28a/Hps-pilA。將該重組菌株 BL21/pET28a/Hps_pilA 接種於 5mL LB 液體培養基 中(附加終濃度為50 μ g/mL卡那黴素)，過夜活化。以1 100 (ν/ν)轉接至50mL LB液體培 養基中，置於37°C搖床培養至OD6tltl為0. 5-0. 8左右以後，加入1. Ommol/L的異丙基-B-D-硫 代半乳糖苷(即IPTG，購自sigma公司)於37°C誘導培養3h。將上述50mL重組菌BL21/ pET28a/Hps-pilA的3h誘導培養物經過12000rpm離心30s收集菌體，利用超聲波(技術參 數功率400W，破碎30s，間歇30s)將細胞破碎後12000rpm離心15min取上清。然後將上 清液過Ni-IDA親和層析柱(His鎳柱)(購自Novagen公司)提純該特異蛋白PilA(具體 的純化步驟按照試劑盒操作說明書進行)。對最終的純化產物進行SDS-PAGE電泳檢測，結 果如圖2所示，提純的蛋白與蛋白分子量標準比對，估算分子量為15kDa，與預計的PilA蛋 白分子量大小基本吻合，證明本發明的副豬嗜血桿菌免疫原性蛋白PilA在大腸桿菌BL21 中得到了成功的表達。2對副豬嗜血桿菌免疫原性蛋白進行免疫後仔豬抗體水平評價為了對PilA蛋白進行免疫後抗體水平評價，申請人將PilA及其他4個副豬嗜血 桿菌的蛋白，滅活苗及佐劑對照進行免疫後仔豬抗體水平評價。將仔豬隨機分成7組，每組 3頭豬。第1組每隻肌肉注射副豬嗜血桿菌滅活苗25 μ g(與等體積氫氧化鋁佐劑混合)。 第2 6組注射各個副豬嗜血桿菌的重組蛋白(加入等體積氫氧化鋁佐劑)；第7組為對 照組，注射氫氧化鋁佐劑。第1次，每隻200 μ g蛋白，總劑量3ml/只，約2周後頸靜脈採血 (大約Iml)，進行ELIAS檢測。第2次，劑量為500 μ g/3ml/只，1周後進行ELIAS檢測。第 3次，劑量為500 μ g/3ml/只。0周為第一次免疫，2周為第二次免疫，4周為第三次免疫；第 0，1，3，5周進行了採血檢測(圖3)。結果顯示PilA蛋白在二免後，抗體水平就已經達到較 好的水平。3.副豬嗜血桿菌免疫原性蛋白對副豬嗜血感染保護力的檢測申請人:將PilA及其他4個副豬嗜血桿菌的蛋白，滅活苗及佐劑對照進行三免7天 後用副豬嗜血桿菌分離菌株進行感染試驗，副豬嗜血桿菌SH0165株經氣管內注射21頭豬，每 頭豬注射3ml菌液2X IOltl/只。注射後連續觀察6天。將純化的蛋白DnaK，GidA，PilA，RfTA 和SiaB免疫仔豬，攻毒評價重組表達蛋白的免疫保護力。致死保護力率如圖4所示，滅活苗 和PilA蛋白免疫組的致死保護率為100%，GidA蛋白和佐劑免疫組的致死保護率為0%。通過評分評價，結果如表1所示。其中PilA蛋白免疫對陰性對照差異顯著 (p ^ 0.01)，而PilA蛋白免疫對滅活苗免疫差異不顯著(ρ > 0.05)。表1副豬嗜血桿菌免疫原性蛋白對副豬嗜血感染保護力的評測
權利要求
pilA基因作為副豬嗜血桿菌的免疫原性蛋白的應用，它的核苷酸序列如序列表SEQID NO1所示，編碼150個胺基酸。
2.一株表達副豬嗜血桿菌的免疫原性蛋白基因的重組大腸桿菌(Escherichia coli) DH5 α /Hps-pi 1Α,保藏在中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，保藏編號為CCTCC NO Μ209303。
3.權利要求1所述的應用，其中的應用包括在製備副豬嗜血桿菌病亞單位疫苗中的應用。
4.權利要求1所述的的應用，其中的應用包括在製備副豬嗜血桿菌病診斷試劑中的應用。
5.權利要求2所述的保藏編號為CCTCCNO :Μ209303的重組大腸桿菌在製備副豬嗜血 桿菌病亞單位疫苗中的應用。
6.權利要求2所述的保藏編號為CCTCCNO :Μ209303的重組大腸桿菌在製備副豬嗜血 桿菌病診斷試劑中的應用。
全文摘要
本發明屬於獸醫微生物學和動物傳染病技術領域。具體涉及副豬嗜血桿菌的一個具有免疫原性蛋白基因的分離、克隆以及它編碼的蛋白在疫苗和診斷中的應用。本發明從副豬嗜血桿菌的強毒株SH0165菌株中分離得到一個新的具有免疫原性的蛋白基因pilA；它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO1所示，編碼150個胺基酸。該基因的編碼產物為一種新的具有免疫原性蛋白PilA；該蛋白PilA對仔豬感染副豬嗜血桿菌0165能提供有效的免疫保護力。本發明還包括表達免疫原性蛋白基因pilA的大腸桿菌重組菌DH5α/Hps-pilA的製備，該重組大腸桿菌菌已保藏在中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，其保藏編號為CCTCC NOM209303。
文檔編號A61K39/102GK101940786SQ20091027343
公開日2011年1月12日 申請日期2009年12月28日 優先權日2009年12月28日
發明者嚴琦, 周銳, 郭志偉, 金卉, 陳煥春 申請人:華中農業大學