一種快速定量檢測肌鈣蛋白i的免疫螢光試紙條組件、及其製成的檢測卡組件和製備方法

2023-08-05 19:29:46

專利名稱：一種快速定量檢測肌鈣蛋白i的免疫螢光試紙條組件、及其製成的檢測卡組件和製備方法
技術領域：
本發明屬於醫學檢驗所需的免疫螢光試紙條技術領域，尤其涉及ー種快速定量檢測肌鈣蛋白I的免疫螢光試紙條組件及其製備方法，和由免疫螢光試紙條組件支撐的檢測卡組件及其製備方法。
背景技術：
冠心病已成為影響人群健康的主要疾病，其中急性心肌梗死則是造成冠心病人死亡的主要原因。所以，如何及時地發現急性心肌梗死病人並給予及時的治療是挽救病人生命的關鍵所在。對此，傳統的診斷主要是根據典型的臨床表現、心電圖的改變及實驗室酶學檢查等手段進行。但是由於相當一部分心肌梗死病人臨床表現不明顯，且早期心電圖無明顯改變，導致了診斷的困難，而在這種情況下，心肌組織損傷特異性標誌物的應用對心肌梗死症狀的早期確診就起到了關鍵的作用，其中，肌I丐蛋白I (Cardiac troponin I, cTnl)是ー種重要的心肌組織損傷特異性標識物，越來越多的開始臨床用於急性心肌梗死及其它心肌損傷性疾病的診斷。具體的，肌鈣蛋白複合體是由3個亞基組成，3個亞基分別是肌鈣蛋白T、肌鈣蛋白I及肌鈣蛋白C。鈣蛋白T是原球蛋白結合亞基，主要調節肌鈣蛋白複合體與細肌絲間的相互作用；肌鈣蛋白I是肌原纖維AFP酶的抑制性亞單位；肌鈣蛋白C是鈣離子結合部分，主要調節鈣離子依賴型的肌肉收縮。肌鈣蛋白I的基因長約6. 2Kb，可以編碼205個胺基酸。其中，肌鈣蛋白I非常特異地僅存在心肌中，在肌肉及其它組織中從沒有發現肌鈣蛋白I。肌鈣蛋白I以不同形式存在於心肌細胞中，其中胞漿內游離的肌鈣蛋白I只佔4.1%,為可溶性，大部分肌鈣蛋白I則與肌鈣蛋白T及C亞單位結合在一起，以複合體的形式存在。當心肌損傷時，外周血中的肌鈣蛋白I主要與TNC形成的ニ聚體(1C)，此外肌鈣蛋白I還有可能以氧化型、還原型、磷酸化、去磷酸化、蛋白降解形式釋放。因為肌鈣蛋白I分子質量較CK-MB小，對心肌損傷很敏感，對微型心肌損傷肌鈣蛋白I即可出現陽性結果，而此時CK-MB未增高或處正常高限。當心肌細胞膜的完整性受破壞，肌鈣蛋白I會先從胞漿內釋放，因此血清水平很快升高，而結合的肌鈣蛋白I由於相對分子質量大，從心肌細胞結構蛋白緩慢持續的釋放，心肌損傷後4 6h釋放入血，可以達到診斷決定值。另外，心肌缺血症狀發作後14 36h出現高峰，高峰出現時間與血中CK、CK-MB相似，持續3 7天，部分病例14天時仍可測到。此外，最近文獻指出，測定血清肌鈣蛋白I診斷AMI的敏感性為97%，特異性為98%，預測值為99. 8%，所以，肌鈣蛋白I增高對於心肌損傷的診斷往往很有價值。在90年代以來，對肌鈣蛋白的大量臨床研究表明，肌鈣蛋白具有心肌損傷的高度的特異性和敏感性。美國臨床化學學會(NACB)及國際檢測醫學聯合會(TFCC)建議心肌肌鈣蛋白是檢測心肌損傷的新的標誌物；中國檢驗學會也推薦由心肌肌鈣蛋白逐步取代CK-MB成為檢出心肌損傷的新標準。
實際應用中，肌鈣蛋白I的具體測定始於20世紀80年代中期，多採用雙抗體競爭放射免疫法和競爭性ELISA測定法。有研究者將金標記或硒標記單克隆抗體與免疫層析技術相結合，用紙條法半定量床邊檢測肌鈣蛋白I濃度，最低檢測值為0. g/L。而發展到現在，肌鈣蛋白I的檢測多採用化學發光法，用化學發光物質標記後作為檢測抗體，大大提高了其測定的精確性和敏感性，現在所通用的肌鈣蛋白I測定方法因為尚無標準化，不同的方法採用不同的抗體識別位點，所以在使用商品肌鈣蛋白I試劑盒時，必須研究商品試劑的特性。而目前的床旁檢測方法-肢體金試紙法，不能滿足臨床診斷準確定量的要求，也無法對AMI的病程起到很好的療效監測作用。因此，建立ー種檢測時間儘量縮短，並且檢測除了能在實驗室進行外還能夠進行床旁檢測，同時還可以定量測定肌鈣蛋白I的檢測方法，從而為臨床提供準確的診斷依據，是十分必要的。 其中，申請號為200720140929的中國專利提供了ー種利用快速免疫層析法，定型地檢測臨床標本(全血/血清/血漿)中心肌鈣蛋白I的診斷試紙，具備一定的特異性、靈敏度和易儲存性，不需要專門的技術人員和儀器設備，結果也易讀，但是，該專利也同樣的無法良好滿足檢測時間短、適用性強等需求，存在一定缺陷。

發明內容
為解決上述的現有技術的不足，本發明根據免疫螢光技術特點和cTnl抗原抗體系統的特點，設計了新的原材料、試劑和エ藝流程的組合。本發明的反應原理為固相雙抗體夾心法的免疫螢光層析法。待測樣品與適當比例的鉬卟啉標記特異抗體在液相均質介質中充分混和均勻，在此過程中樣品中的肌鈣蛋白I(cTnl)能專ー性地與鉬卟啉標記的抗肌鈣蛋白I(cTnl)抗體充分結合，然後再轉加到試紙條上，流經檢測卡中的包被分析膜時，其中所含的、已反應結合在一起的cTnl-抗cTnl螢光抗體複合物能為包被分析膜上的檢測線上固定的抗cTnl的另ー個抗體特異性捕獲，所發出的螢光可用專用儀器定量測定，螢光強度與樣品中cTnl濃度成正比。具體的，本發明的目的通過以下技術方案得以實現ー種快速定量檢測肌鈣蛋白I的免疫螢光試紙條組件，包括試紙條和與試紙條配合使用且獨立包裝的鉬卟啉標記特異抗體；其中試紙條是由底和設在底襯上的依次接合的吸水墊、包被分析膜、樣品墊組成；所述包被分析膜上設有檢測線和質控線；所述檢測線包被特異抗體為抗肌鈣蛋白I單克隆抗體，所述質控線包被特異抗體為兔IgG抗體；所述鉬卟啉標記特異抗體為抗肌鈣蛋白I單克隆抗體和抗兔IgG抗體。優選地，所述底襯表面塗覆有黏膠或雙面膠，用於固定所述的吸水墊、包被分析膜和樣品墊，所述包被分析膜粘附在所述底襯的中間，同時包被分析膜兩端分別與所述吸水墊和所述樣品墊連接。
優選的，所述吸水墊為濾紙，為吸水紙或濾油紙；所述吸水墊粘附在所述底襯上，同時所述吸水墊與所述包被分析膜的連接處重疊l_2mm。進ー步地，所述包被分析膜由硝酸纖維素膜組成，所述包被分析膜上噴塗抗肌鈣蛋白I單克隆抗體和抗兔IgG抗體。優選地，所述樣品墊為磷酸鹽緩衝液緩浸泡過的玻璃纖維膜，所述樣品墊粘附在所述底襯上，其中所述樣品墊與所述包被分析膜的連接處重疊1_2_。優選地，所述鉬卟啉標記特異抗體為抗肌鈣蛋白I單克隆抗體和抗兔IgG抗體，並分別用含如下組分的0. 02M磷酸鹽緩衝液稀釋後用塑料瓶密封而得0. 01%-0. 5%聚こニ醇、1% -5%牛血清白蛋白、5% -20%甘油和0. 01% -0. 05%表面活性剤。其中，所述鉬卩卜啉標記的激發光光源波長範圍為390_420nm,發射光波長範圍為600_700nm。一種製備上述快速定量檢測肌鈣蛋白I的免疫螢光試紙條組件的方法，包括以下步驟I)抗體的製備選用純化的基因工程表達的抗肌鈣蛋白I單克隆抗體、抗兔IgG抗體和純化的兔IgG抗體； 2)包被分析膜的製備採用噴膜機分別在ー硝酸纖維膜上劃檢測線和質控線，劃線細緻均勻，檢測線與質控線間隔5mm ；用檢測線包被緩衝液稀釋抗肌鈣蛋白I單克隆抗體至濃度為10-20ug/ml，採用噴膜機將抗肌鈣蛋白I單克隆抗體噴印在硝酸纖維膜的檢測線上；用質控線包被緩衝液稀釋純化的兔IgG抗體至濃度為10_20ug/ml，採用噴膜機將純化的兔IgG抗體噴印在硝酸纖維膜的質控線上；將噴膜後的硝酸纖維膜放入25_50°C的真空乾燥箱內，乾燥後取出密封備用；3)鉬卟啉標記抗體的製備用0. IM碳酸氫鈉溶液分別將抗肌鈣蛋白I單克隆抗體和抗兔IgG抗體的濃度稀釋至lmg/ml,各取5ml抗體溶液,再分別加入30_50mg鉬卟啉標記特異抗體並攪勻,在室溫下孵育I小時，其中在孵育過程中每隔15分鐘分別混勻一次，孵育完成後，用規格型號為G25的凝膠柱分別進行過柱分離純化，再分別收集標記好鉬卟啉標記特異抗體的抗肌鈣蛋白I單克隆抗體和抗兔IgG抗體，各自用按含0. 01%-0. 5%聚こニ醇、I % -5%牛血清白蛋白、5%-20%甘油和0. 01%-0. 05%表面活性劑的0. 02M磷酸鹽緩衝液稀釋混勻後，分別用塑料瓶密封包裝，於4°C環境下保存；4)樣品墊的製備用包含0. 01% -0. 5%聚こニ醇、1% -5%牛血清白蛋白和0. 01% -0. 05%表面活性劑的0. 04M、PH值為7. 2的磷酸鹽緩衝液浸泡樣品墊玻璃纖維膜，浸泡處理後，放入30-50°C的真空乾燥箱內進行乾燥，待乾燥完成後取出並密封備用；5)免疫螢光試紙條的製備先將包被分析膜粘附在所述底襯中間位置上，在所述包被分析膜一端粘附吸水墊，所述包被分析膜和所述吸水墊的連接處重疊l_2mm ;在所述包被分析膜另一端粘附所述樣品墊，所述包被分析膜和所述樣品墊的連接處重疊l_2mm ;再將黏貼好所述包被分析膜、所述吸水墊和所述樣品墊的所述底襯裁切成4_寬的細條；6)獨立包裝的鉬卟啉標記特異抗體工作液的製備確定適量濃度的鉬卟啉標記的抗肌鈣蛋白I單克隆抗體和抗兔IgG抗體，採用按含0. 01% 0. 5%聚こニ醇、1% 5%牛血清白蛋白、5% -20%甘油和0. 01% -0. 05%表面活性劑的0. 02M磷酸鹽緩衝液一井稀釋，分裝在塑料試劑瓶中並密封瓶蓋。ー種由上述的快速定量檢測肌鈣蛋白I的免疫螢光試紙條組件製成的檢測卡組件，包括試紙條組件以及由聚苯こ烯或聚氯こ烯製成的蓋板和聚苯こ烯或聚氯こ烯製成的背板組成的卡盒；其中，所述背板包括放置所述試紙條組件的卡槽和用幹與所述蓋板結合的卡齒，所述蓋板包括可觀測檢測結果的檢測窗、可滴加樣品的加樣孔和用幹與所述背板的卡齒結合的固定孔；所述試紙條組件通過所述卡齒與所述固定孔結合而嵌合在所述背板和所述蓋板之間；特別的，所述包被分析膜正對所述檢測窗，所述樣品墊正對所述加樣孔。另外，獨立包裝的鉬卟啉標記特異抗體分裝在塑料試劑瓶中並密封瓶蓋。製備上述的快速定量檢測肌鈣蛋白I的免疫螢光試紙條組件製成的檢測卡組件的方法，包括以下步驟
I)製成背板和蓋板用聚苯こ烯或聚氯こ烯製成背板和蓋板，所述背板包括放置所述試紙條組件的卡槽和用幹與所述蓋板結合的卡齒，所述蓋板包括可測結果的檢測窗、可滴加樣品的加樣孔以及用幹與所述背板的卡齒結合的固定孔；2)組裝將試紙條組件放在所述背板的所述卡槽內，通過所述背板的卡齒與所述蓋板的固定孔結合，將試紙條組件嵌合在背板和蓋板之間，其中，包被分析膜正對所述檢測窗，樣品墊正對所述加樣孔；另外，獨立包裝的鉬卟啉標記特異抗體分裝在塑料試劑瓶中並密封瓶
至Jhl o3)包裝將I人份的試紙條、卡盒和一包幹燥劑封裝在鋁箔塑膠袋內，並將多組所述鋁箔塑膠袋和對應的多組所述獨立包裝的鉬卟啉標記特異抗體裝入ー個包裝盒，在2°C -8°C環境下避光不凍存的進行保存。本發明具有以下有益之處本發明採用免疫螢光快速檢測技術，利用螢光的高靈敏特點，在樣品與螢光標記抗體在試劑瓶內反應後再加入檢測卡，由於樣品與螢光標記抗體在液相中全面接觸，反應充分，因此可大幅度提高反應靈敏度，同時增加了樣品的稀釋倍數，去除了樣品的基質效應，令定量結果有很好的可重複性，而且本發明省略了直接加樣步驟，提高了定量結果的精密度和準確度，可滿足同時檢測高值和低值的臨床診斷要求，，並且性價比高，適用於臨床快速檢測。此外，應用本發明提供的試紙條檢測人體內cTnl水平，成本相對低廉，操作簡單、快速、靈敏，且特異性好，只需要配套常規的專用螢光檢測儀即可，因此可廣泛應用於各級醫療檢驗場所，尤其是基層醫療機構，包括鄉鎮衛生院等均可開展，所以推展了其應用性，對於心腦血管事件發生的預防有極為重要的意義。


圖I是本發明試紙條的結構示意圖。圖2是本發明檢測卡的分解結構示意圖。圖3是鉬卟啉發光材料的發射光譜曲線。
圖4為本發明的反應方式示意圖。圖5為本發明的檢測結果示意圖。其中，a :檢測結果為陽性；b :檢測結果為陰性；c :檢測結果無效。圖6為本發明的檢測標準工作曲線。
具體實施例方式以下實施例僅用於闡述本發明，而本發明的保護範圍並非僅僅局限於以下實施例。所述技術領域的普通技術人員依據以上本發明公開的內容和各項參數所取範圍，均可實現本發明的目的。實施例I如附圖I所示，ー種快速定量檢測肌鈣蛋白I的免疫螢光試紙條組件，包括試紙條和與試紙條配合使用且獨立包裝的鉬卟啉標記特異抗體；其中試紙條是由底襯I和設在底襯I上的依次接合的吸水墊2、包被分析膜3、樣品墊6組成；所述包被分析膜3上設有檢測線4和質控線5 ;所述檢測線4包被特異抗體為抗肌鈣蛋白I單克隆抗體，質控線5包被特異抗體為抗兔IgG抗體；其中，底襯I表面塗覆有黏膠或雙面膠，用於固定所述的吸水墊2、包被分析膜3和樣品墊6，具體的，包被分析膜3粘附在所述底襯I的中間，同時包被分析膜3兩端分別與所述吸水墊2和所述樣品墊6連接。包被分析膜3由硝酸纖維素膜組成，包被分析膜3上噴塗抗肌鈣蛋白I單克隆抗體和抗兔IgG抗體。樣品墊6為磷酸鹽緩衝液緩浸泡過的玻璃纖維膜，樣品墊6粘附在底襯I上，其中，樣品墊6與包被分析膜3的連接處重疊l_2mm。吸水墊2為濾紙，具體的為吸水紙或濾油紙；吸水墊2粘附在底襯I上，同時吸水墊2與包被分析膜3的連接處重疊l_2mm。鉬卟啉標記特異抗體為抗肌鈣蛋白I單克隆抗體和抗兔IgG抗體，分別用按含
0.01%-0. 5%聚こニ醇、1%-5%牛血清白蛋白、5%-20%甘油和0. 01%-0. 05%表面活性劑的0. 02M磷酸鹽緩衝液稀釋，用塑料試劑瓶密封包裝。上述快速定量檢測肌鈣蛋白I的免疫螢光試紙條組件的製備方法，步驟為I、抗體的製備選用純化的基因工程表達的抗肌鈣蛋白I單克隆抗體、抗兔IgG抗體和純化的兔IgG抗體。2、包被分析膜3的製備採用噴膜機分別在ー硝酸纖維膜上劃檢測線(4)和質控線(5)，劃線細緻均勻，檢測線4與質控線5間隔5mm ；用檢測線包被緩衝液稀釋抗肌鈣蛋白I單克隆抗體至濃度為10-20ug/ml，採用噴膜機將抗肌鈣蛋白I單克隆抗體噴印在硝酸纖維膜的檢測線上；用質控線包被緩衝液稀釋純化的兔IgG抗體至濃度為10_20ug/ml，採用噴膜機將純化的兔IgG抗體噴印在硝酸纖維膜的質控線上；將噴膜後的硝酸纖維膜放入25_50°C的真空乾燥箱內，乾燥後取出密封備用；
具體的，檢測線4包被緩衝液的製備方法用50mM、pH值7. 6的磷酸鹽緩衝液，此磷酸鹽緩衝液按含1%海藻糖、0. 5%牛血清白蛋白和lmg/ml的19C7抗體。質控線5包被緩衝液的製備方法用50mM的pH值7. 6的磷酸鹽緩衝液，此磷酸鹽緩衝液按含1%甲醇、0. 8%牛血清白蛋白和0. 5mg/ml的兔IgG。 包被分析膜3的製備調試噴膜機，使其膜液量為20ul/40cm，機器劃線令檢測線4與質控線5間隔保持5_，劃線細緻均勻，將噴膜後的包被分析膜3放置在30-50°C真空乾燥箱內處理20-30分鐘，之後取出真空裝袋以密封備用。3、樣品墊6的製備 用包含0. 01% -0. 5%聚こニ醇、1% -5%牛血清白蛋白和0. 01% -0. 05%表面活性劑的0. 04M、PH值為7. 2的磷酸鹽緩衝液浸泡樣品墊玻璃纖維膜，浸泡處理後，放入30-50°C的真空乾燥箱內進行乾燥，待乾燥完成後取出並密封備用。4、免疫螢光試紙條的製備先將包被分析膜3粘附在底襯I中間位置上，在包被分析膜3 —端粘附吸水墊2，包被分析膜3和吸水墊2的連接處重疊l_2mm ;在包被分析膜3另一端粘附樣品墊6，包被分析膜3和樣品墊6的連接處重疊l_2mm ;再將黏貼好包被分析膜3、吸水墊2和樣品墊6的底襯I裁切成4mm寬的細條。參閱圖I所示，包被分析膜3上設有通過噴膜機噴印形成的檢測線4和質控線5。5、鉬卟啉標記抗體的製備用0. IM碳酸氫鈉溶液分別將抗肌鈣蛋白I單克隆抗體和抗兔IgG抗體的濃度稀釋至lmg/ml,各取5ml抗體溶液,再分別加入30mg鉬卟啉標記特異抗體並攪勻，在室溫下孵育I小時，其中在孵育過程中每隔15分鐘分別混勻一次，孵育完成後，用規格型號為G25的凝膠柱分別進行過柱分離純化，再分別收集標記好鉬卟啉標記特異抗體的抗肌鈣蛋白I單克隆抗體和抗兔IgG抗體，各自用按含0.01% -0. 5%聚こニ醇、I % -5%牛血清白蛋白、5% -20%甘油和0. 01% -0. 05%表面活性劑的0. 02M磷酸鹽緩衝液稀釋混勻後，分別用塑料瓶密封包裝，於4°C環境下保存。6、獨立包裝的鉬卟啉標記特異抗體工作液的製備確定適量濃度的鉬卟啉標記的抗肌鈣蛋白I單克隆抗體和抗兔IgG抗體，採用按含0. 01% 0. 5%聚こニ醇、1% 5%牛血清白蛋白、5% -20%甘油和0. 01% -0. 05%表面活性劑的0. 02M磷酸鹽緩衝液一井稀釋，分裝在塑料試劑瓶中並密封瓶蓋。參閱圖2所示，ー種由快速定量檢測抗肌鈣蛋白I的免疫螢光試紙條組件製成的檢測卡組件，其包括試紙條、由用聚苯こ烯或聚氯こ烯製成的蓋板11和用聚苯こ烯或聚氯こ烯製成的背板13組成的卡盒以及獨立包裝的鉬卟啉標記特異抗體15。所述背板13包括放置試紙條的卡槽12和用幹與蓋板結合的卡齒14 ;所述蓋板11包括可觀測檢測結果的檢測窗8、可滴加樣品的加樣孔7和用幹與背板13的卡齒14結合的固定孔10。所述試紙條通過所述卡齒14與所述固定孔10結合而嵌合在所述背板13和所述蓋板11之間，即形成了檢測卡。其中，所述包被分析膜3正對所述檢測窗8，所述樣品墊6正對所述加樣孔7 ;另夕卜，獨立包裝的鉬卟啉標記特異抗體15分裝在塑料試劑瓶中並密封瓶蓋。本發明提供一種製備快速定量檢測抗肌鈣蛋白I的免疫螢光試紙條組件製成的檢測卡組件的方法，其包括以下步驟
I)製成背板13和蓋板11用聚苯こ烯或聚氯こ烯製成背板13和蓋板11，所述背板13包括放置所述試紙條組件的卡槽12和用幹與所述蓋板11結合的卡齒14，所述蓋板11包括可測結果的檢測窗
8、可滴加樣品的加樣孔7以及用幹與所述背板的卡齒14結合的固定孔10。2)組裝將試紙條組件放在所述背板13的所述卡槽內12，通過所述背板13的卡齒14與所述蓋板11的固定孔10結合，將試紙條組件嵌合在背板13和蓋板11之間，其中，包被分析 膜3正對所述檢測窗8，樣品墊6正對所述加樣孔7。另外，獨立包裝的鉬卟啉標記特異抗體分裝在塑料試劑瓶中並密封瓶蓋。3)包裝將I人份的試紙條、卡盒和一包幹燥劑封裝在鋁箔塑膠袋內，並將25人份的所述鋁箔塑膠袋和對應的25瓶所述獨立包裝的鉬卟啉標記特異抗體裝入ー個包裝盒，在2V _8°C環境下避光不凍存的進行保存。本發明的檢測原理參閱圖3所示，鉬卟啉發光材料的發射光譜曲線進行分析，發現鉬卟啉所具有的特徵光譜的激發光光源範圍為390-420nm，發射光波長範圍為600_700nm。由於鉬卟啉發光標記物的特點，使得以其作為標記物的免疫螢光試紙條可與儀器結合，使得基於鉬卟啉發光技術的免疫層析試紙條可進行靈敏度極高的多重分析、且對目標被檢測物進行靈敏度極高的精確定量檢測。本發明採用免疫螢光快速檢測技術，利用螢光的高靈敏特點，待測樣品與鉬卟啉標記先在試劑瓶內反應，由於待測樣品與鉬卟啉標記在液相中全面接觸，反應充分，因此可大幅度提高反應靈敏度，同時增加了待測樣品的稀釋倍數，去除了待測樣品的基質效應，使定量結果有很好的可重複性，而且此方法省略了直接加樣步驟，提高了定量結果的精密度和準確度，可滿足同時檢測高值和低值的臨床診斷要求，參照附圖4，鉬卟啉標記特異抗體與待測樣品中充分結合形成一複合物；然後複合物轉加到檢測卡上，在吸水墊2的吸力下流經到檢測卡中的包被分析膜3上，如果該複合物具有肌鈣蛋白I，其能被檢測線4上的肌鈣蛋白I單克隆抗體捕獲17，在緑色光照射下以紅外光光信號的形式表現出來，所發出的螢光可用專用儀器定量測定，螢光強度與樣品中心肌鈣蛋白I的濃度成正比；如果複合物中肌鈣蛋白I低於最低檢測標準，則檢測線4不會發出螢光；試紙條有效的情況下，質控線5上的兔IgG抗體18均會與複合物反應發出螢光。請參閱圖5中的a、b、c所示，即檢測線4與質控線5均發光，試紙條檢測結果呈陽性；只有質控線5發光，試紙條檢測結果呈陰性；兩條線均未發光，試紙條檢測結果無效。本發明的標準工作曲線的繪製首先，將提純的肌鈣蛋白I標準品用I : 10稀釋的正常人血清(採用pH7. 2 0. 02MPB緩衝液稀釋)作為稀釋液配製系列濃度標準品，濃度為Ong/ml、IOng/ml、25ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml的6份樣品。其次,姆個樣品分別用10個肌I丐蛋白I試紙條檢測10次，10次檢測儀器判讀的樣品檢測T值和對照C值分別取平均值，最終根據二者的比值得出每個濃度對應的T/C結果，列於表I。
權利要求
1.ー種快速定量檢測肌鈣蛋白I的免疫螢光試紙條組件，其特徵在於包括試紙條和與試紙條配合使用且獨立包裝的鉬卟啉標記特異抗體；其中試紙條是由底襯(I)和設在底襯(I)上的依次接合的吸水墊(2)、包被分析膜(3)、樣品墊(6)組成；所述包被分析膜(3)上設有檢測線(4)和質控線(5);所述檢測線(4)包被特異抗體為抗肌鈣蛋白I單克隆抗體，所述質控線(5)包被特異抗體為兔IgG抗體；所述鉬卟啉標記特異抗體為抗肌鈣蛋白I單克隆抗體和抗兔IgG抗體。
2.根據權利要求I所述的快速定量檢測肌鈣蛋白I的免疫螢光試紙條組件，其中，所述試紙條的底襯(I)表面塗覆有黏膠或雙面膠，用於固定所述的吸水墊(2)、包被分析膜(3)和樣品墊出)，包被分析膜(3)粘附在所述底襯(I)的中間，同時包被分析膜(3)兩側分別與所述吸水墊(2)和所述樣品墊(6)連接。
3.根據權利要求I或2所述的快速定量檢測肌鈣蛋白I的免疫螢光試紙條組件，其特徵在於所述吸水墊(2)為濾紙，為吸水紙或濾油紙；所述吸水墊(2)粘附在所述底襯(I)上，同時所述吸水墊(2)與所述包被分析膜(3)的連接處重疊l_2mm。
4.根據權利要求I或2所述的快速定量檢測肌鈣蛋白I的免疫螢光試紙條組件，其特徵在於所述包被分析膜(3)由硝酸纖維素膜組成，所述包被分析膜(3)上噴塗抗肌鈣蛋白I單克隆抗體和兔IgG抗體。
5.根據權利要求I或2所述的快速定量檢測肌鈣蛋白I的免疫螢光試紙條組件，其特徵在於所述樣品墊(6)為磷酸鹽緩衝液緩浸泡過的玻璃纖維膜，所述樣品墊(6)粘附在所述底襯(I)上，其中所述樣品墊(6)與所述包被分析膜(3)的連接處重疊l_2mm。
6.根據權利要求I或2所述的快速定量檢測肌鈣蛋白I的免疫螢光試紙條組件，其特徵在於所述鉬卟啉標記特異抗體為抗肌鈣蛋白I單克隆抗體和抗兔IgG抗體，並分別用含如下組分的0. 02M磷酸鹽緩衝液稀釋後用塑料瓶密封而得0. 01% -0. 5%聚こニ醇、1% -5%牛血清白蛋白、5% -20%甘油和0. 01% -0. 05%表面活性剤。
7.根據權利要求I所述的快速定量檢測檢測肌鈣蛋白I的免疫螢光試紙條組件，其特徵在於所述鉬卟啉標記的激發光光源波長範圍為390-420nm，發射光波長範圍為600_700nmo
8.ー種製備權利要求I所述的快速定量檢測肌鈣蛋白I的免疫螢光試紙條組件的方法，其特徵在於包括以下步驟 1)抗體的製備 選用純化的基因工程表達的抗肌鈣蛋白I單克隆抗體、抗兔IgG抗體和純化的兔IgG ； 2)包被分析膜(3)的製備 採用噴膜機分別在ー硝酸纖維膜上劃檢測線(4)和質控線(5)，劃線細緻均勻，檢測線(4)與質控線(5)間隔5mm ； 用檢測線包被緩衝液稀釋抗肌鈣蛋白I單克隆抗體至濃度為10-20ug/ml，採用噴膜機將抗肌鈣蛋白I單克隆抗體噴印在硝酸纖維膜的檢測線上； 用質控線包被緩衝液稀釋純化的兔IgG抗體至濃度為10-20ug/ml，採用噴膜機將純化的兔IgG抗體噴印在硝酸纖維膜的質控線上； 將噴膜後的硝酸纖維膜放入25-50°C的真空乾燥箱內，乾燥後取出密封備用； 3)樣品墊(6)的製備用包含0.01% -0.5%聚こニ醇、1% -5%牛血清白蛋白和0.01% -0. 05%表面活性劑的0. 04M、PH值為7. 2的磷酸鹽緩衝液浸泡樣品墊玻璃纖維膜，浸泡處理後，放入30-50°C的真空乾燥箱內進行乾燥，待乾燥完成後取出並密封備用； 4)免疫螢光試紙條的製備 先將包被分析膜(3)粘附在底襯(I)中間位置上，在包被分析膜(3) —端粘附吸水墊(2)，包被分析膜(3)和吸水墊(2)的連接處重疊1-2_;在包被分析膜(3)另一端粘附樣品墊出)，包被分析膜(3)和樣品墊￠)的連接處重疊l_2mm ;再將黏貼好包被分析膜(3)、吸水墊⑵和樣品墊(6)的底襯⑴裁切成4mm寬的細條； 5)鉬卟啉標記抗體的製備 用0. IM碳酸氫鈉溶液分別將抗肌鈣蛋白I單克隆抗體和抗兔IgG抗體的濃度稀釋至lmg/ml,各取5ml抗體溶液,再分別加入30_50mg鉬卟啉標記特異抗體並攪勻,在室溫下孵育I小時，其中在孵育過程中每隔15分鐘分別混勻一次，孵育完成後，用規格型號為G25的凝膠柱分別進行過柱分離純化，再分別收集標記好鉬卟啉標記特異抗體的抗肌鈣蛋白I單克隆抗體和抗兔IgG抗體，各自用按含0.01% -0.5%聚こニ醇、I % -5%牛血清白蛋白、5% -20%甘油和0. 01% -0. 05%表面活性劑的0. 02M磷酸鹽緩衝液稀釋混勻後，分別用塑料瓶密封包裝，於4°C環境下保存； 6)獨立包裝的鉬卟啉標記特異抗體工作液的製備 確定適量濃度的鉬卟啉標記的抗肌鈣蛋白I單克隆抗體和抗兔IgG抗體，採用按含0.01% 0. 5%聚こニ醇、1% 5%牛血清白蛋白、5%-20%甘油和0. 01%-0. 05%表面活性劑的0. 02M磷酸鹽緩衝液一井稀釋，分裝在塑料試劑瓶中並密封瓶蓋。
9.根據權利要求8所述的製備快速定量檢測肌鈣蛋白I的免疫螢光試紙條組件的方法，其特徵在於所述步驟2)中，檢測線包被緩衝液的製備方法用50mM、pH值7. 6的磷酸鹽緩衝液，此磷酸鹽緩衝液含1%海藻糖、0. 5%牛血清白蛋白和lmg/ml的抗肌鈣蛋白I單克隆抗體；質控線(5)包被緩衝液的製備方法用50mM的pH值7. 6的磷酸鹽緩衝液，此磷酸鹽緩衝液含1%甲醇、0. 8%牛血清白蛋白和0. 5mg/ml的兔IgG抗體；包被分析膜(3)的製備調試噴膜機，使其膜液量為20ul/40cm，機器劃線令檢測線(4)與質控線(5)間隔保持5mm,劃線細緻均勻，將噴膜後的包被分析膜(3)放置在30_50°C真空乾燥箱內處理20-30分鐘，之後取出真空裝袋以密封備用。
10.根據權利要求8所述的製備快速定量檢測肌鈣蛋白I的免疫螢光試紙條組件的方法，其特徵在於所述的步驟2)中，檢測線包被緩衝液的製備方法用50mM、pH值7. 6的Tris緩衝液,此Tris緩衝液包含0. 8%甲醇、0. 6%牛血清白蛋白和lmg/ml的抗肌鈣蛋白I單克隆抗體。
11.根據權利要求8所述的製備快速定量檢測肌鈣蛋白I的免疫螢光試紙條組件的方法，其特徵在於所述的步驟2)中，質控線包被緩衝液的製備方法用50mM的pH值7. 6的磷酸鹽緩衝液，此磷酸鹽緩衝液包含0. 7%甲醇、0. 5%牛血清白蛋白和0. 5mg/ml的兔IgG抗體。
12.根據權利要求8所述的製備快速定量檢測肌鈣蛋白I的免疫螢光試紙條組件的方法，其特徵在於所述的步驟5)中，用0. IM碳酸氫鈉溶液將抗肌鈣蛋白I單克隆抗體和抗兔IgG抗體的濃度分別稀釋至lmg/ml,各取5ml抗體溶液,分別加入30_50mg突光素鉬卩卜啉溶解液並攪勻，在室溫下孵育2小時，孵育過程中每隔15分鐘混勻一次。
13.根據權利要求8)所述的製備快速定量檢測肌鈣蛋白I的免疫螢光試紙條組件的方法，其特徵在於所述的步驟3中，採用含0. 4%聚こニ醇、3. 5%牛血清白蛋白和0. 02%表面活性劑的0. 04M磷酸鹽緩衝液，通過噴膜機將磷酸鹽緩衝液噴印在樣品墊(6)上，將噴印後的樣品墊(6)放入30°C _50°C的真空乾燥箱內進行乾燥，待乾燥4小時後取出密封備用。
14.一種由權利要求I所述的快速定量檢測肌鈣蛋白I的免疫螢光試紙條組件製成的檢測卡組件，其特徵在於所述檢測卡組件包括試紙條組件以及由聚苯こ烯或聚氯こ烯製成的蓋板(11)和聚苯こ烯或聚氯こ烯製成的背板(13)組成的卡盒；其中，所述背板(13)包括放置所述試紙條組件的卡槽(12)和用幹與所述蓋板(11)結合的卡齒(14)，所述蓋板(11)包括可觀測檢測結果的檢測窗(8)、可滴加樣品的加樣孔(7)和用幹與所述背板的卡齒(14)結合的固定孔(10);所述試紙條組件通過所述卡齒(14)與所述固定孔(10)結合而嵌合在所述背板(13)和所述蓋板(11)之間；特別的，所述包被分析膜(3)正對所述檢測窗(8)，所述樣品墊(6)正對所述加樣孔(7)，另外，獨立包裝的鉬卟啉標記特異抗體分裝在塑料試劑瓶中並密封瓶蓋。
15.ー種製備權利要求14所述的快速定量檢測肌鈣蛋白I的免疫螢光試紙條組件製成的檢測卡組件的方法，其特徵在於包括以下步驟 1)製成背板(13)和蓋板(11) 用聚苯こ烯或聚氯こ烯製成背板(13)和蓋板(11)，所述背板(13)包括放置所述試紙條組件的卡槽(12)和用幹與所述蓋板(11)結合的卡齒(14)，所述蓋板(11)包括可測結果的檢測窗(8)、可滴加樣品的加樣孔(7)以及用幹與所述背板的卡齒(14)結合的固定孔(10)； 2)組裝 將試紙條組件放在所述背板(13)的所述卡槽內(12)，通過所述背板(13)的卡齒(14)與所述蓋板(11)的固定孔(10)結合，將試紙條組件嵌合在背板(13)和蓋板(11)之間，其中，包被分析膜⑶正對所述檢測窗(8)，樣品墊(6)正對所述加樣孔(7);另外，獨立包裝的鉬卟啉標記特異抗體分裝在塑料試劑瓶中並密封瓶蓋。
3)包裝 將I人份的試紙條、卡盒和一包幹燥劑封裝在鋁箔塑膠袋內，並將多組所述鋁箔塑膠袋和對應的多組所述獨立包裝的鉬卟啉標記特異抗體裝入ー個包裝盒，在2°C -8°C環境下避光不凍存的進行保存。
全文摘要
本發明公開了一種快速定量檢測肌鈣蛋白I的免疫螢光試紙條組件、及其製成的檢測卡組件和製備方法，試紙條組件包括試紙條和獨立包裝的鉑卟啉標記特異抗體，試紙條包括底襯、吸水墊、包被分析膜及樣品墊，該包被分析膜上設有檢測線和質控線，檢測線包被的特異抗體為抗肌鈣蛋白I單克隆抗體，質控線包被的特異抗體為兔IgG抗體；檢測卡組件包括試紙條、由蓋板和背板組成的卡盒以及獨立包裝的鉑卟啉標記特異抗體；本發明採用免疫螢光快速檢測技術檢測人體內肌鈣蛋白I水平，成本相對低廉，操作簡單、快速、靈敏，且特異性好，對於心腦血管事件發生的預防有極為重要的意義。
文檔編號G01N33/558GK102662055SQ20121013380
公開日2012年9月12日 申請日期2012年4月28日 優先權日2012年4月28日
發明者李必松, 梁萬興, 羅琪, 謝愛武 申請人:廣州鴻琪光學儀器科技有限公司