糖鏈衍生物的製造方法、結構解析方法、以及糖鏈衍生物的製作方法

2023-07-20 02:13:11 1

專利名稱：：糖鏈衍生物的製造方法、結構解析方法、以及糖鏈衍生物的製作方法
技術領域：
：本發明涉及來自糖鏈的混合物的糖鏈衍生物的製造方法、以及糖鏈的結構解析方法。進一步，涉及根據本發明的糖鏈衍生物的製造方法製造的新的糖鏈衍生物。
背景技術：
：糖蛋白質中的糖鏈認為具有保持蛋白質的立體結構、獲得防止被蛋白酶的分解的抵抗性等作用。最近，逐漸地闡明了糖蛋白質中的糖鏈參與受精和分化、信號傳導、癌化、蛋白質的細胞內輸送和生理活性的調節等的生命現象。另外，還闡明了細胞表面的粘接分子和糖蛋白質性激素等的糖鏈與其功能的關係，總結了糖質科學公會(consortium)構想。現在，糖鏈功能研究的中心研究以影響其的生合成糖轉移酶(糖鏈基因)為中心，如果考慮糖轉移酶還根據基因組情報被保存，利用與其他蛋白質的協調作業，參與生命功能，還需要利用捕捉細胞、組織中表達的糖鏈的整體圖像進行解析的結構糖組學(glyconomics)手法，進行糖鏈的功能解析。糖鏈科學中的結構糖組學的作用是綜合地解析在多數生命現象中擔負重要作用的糖鏈識別機理，對功能糖組學是不可缺少的要素。作為結構糖組學所要求的技術的要素，有高綜合性、高生產量、高感度以及高精度。現在，作為糖蛋白質糖鏈的結構解析法，對從蛋白質切出的糖鏈進行焚光標記後，利用高效液相色鐠(HPLC)或者質譜分析法(MS)的解析的方法成為利用質譜分析的快速技術進步的有力的手段(非專利文獻1~4)，唾液酸糖鏈的分離中，逐漸地專門地利用陰離子交換色譜色譜(非專利文獻5)。非專利文獻1BiomedChromatogr.16:103-115(2002)非專利文獻2AnalBiochem.206:278-287(1992)非專利文獻3BiochemSocTrans.21:121-125(1993)非專利文獻4ChemRev.102:321-369(2002)非專利文獻5BiochimBiophysActa.705:167-173(1982)但是，對細胞或組織中的糖鏈綜合解析的場合，由於存在唾液酸和巖藻糖等的非還原末端修飾的多樣性和糖鏈的分枝這樣的問題，不能充分地分離混合存在的糖鏈，不能得到滿意的結果。特別地，如果使用離子交換色鐠等，由於沒有特異的分離能力，不僅不能獲得充分的分離，而且分離操作後必須要進行脫鹽處理，可以說並不是實用的方法。因此，對這些的糖鏈不均一性情報有擔心，同時迫切希望對細胞、組織可以詳細進行特徵糖鏈結構解析的實用的手法。本發明的課題在於，提供從像細胞或者組織中的糖鏈那樣混合存在的各種的糖鏈的狀態分離、獲取各糖鏈的手段。另外，本發明課題在於，提供對於分離的各糖鏈化合物的結構進行解析的手段。進一步，本發明的課題在於提供新的糖鏈衍生物。
發明內容本發明涉及以下的發明。1.糖鏈衍生物的製造方法，是從糖鏈混合物製造糖鏈衍生物的方法，其特徵在於，包括下述工序(a)在糖鏈混合物中的糖鏈上導入脂溶性基，得到糖鏈衍生物的混合物的工序、以及(b)將該糖鏈衍生物的混合物用5-羥色胺(serotonin)親合柱色鐠法進行處理的工序。2.上述1記載的糖鏈衍生物的製造方法，其中在(b)工序之後具備(c)採用氨基柱或者醯氨基柱的正相色譜法進行處理的工序。3.上述記栽的糖鏈衍生物的製造方法，其中，在(c)工序之前，具備(d)用糖水解酶進行處理的工序。4.糖鏈的結構解析方法，是解析糖鏈混合物中的糖鏈的結構的方法，其特徵在於，具備以下工序(a)在糖鏈混合物中的糖鏈上導入脂溶性基，得到糖鏈衍生物的混合物的工序、(b)將該糖鏈衍生物的混合物用5-羥色胺親合柱色鐠法進行處理的工序、以及(e)用質鐠分析法進行處理的工序。5.上述記栽的糖鏈的結構解析方法，其特徵在於，在(b)工序之後，具備(c)通過採用氨基柱或者醯氨基柱的正相色譜法進行處理的工序。6.上述記載的糖鏈的結構解析方法，其中，在(c)工序之前具備(d)用糖水解酶進行處理的工序。7，上述4記載的糖鏈的結構解析方法，其中，質鐠分析法是利用MALDI-T0FMS的質鐠分析法。8.後述的式(1)~(6)表示的糖鏈衍生物[式中W表示2-羧基苯基、3-羧基苯基、4-羧基苯基、p-乙氧基羰基苯基、或者2-吡啶基。R2表示羥基、基-Asn或者基-Asn-R3。在此，Asn表示天冬醯胺基，R3表示氨基甲酸酯系或者醯胺系保護基。Ac表示乙醯基。]。9.由式(l)~(6)表示的糖鏈衍生物衍生的癌標記物。本發明人等經過深入研究，結果發現在糖鏈上導入脂溶性基成為糖鏈衍生物後，釆用把對唾液酸有親合性的5-羥色胺作為配基的親合柱色鐠法進行處理，由此可以進行無唾液酸糖鏈和唾液酸糖鏈的分離，還可以利用唾液酸殘基的數目對唾液酸糖鏈中的單唾液酸、二唾液酸、三唾液酸以及四唾液酸糖鏈等進行分離。進一步還發現，把利用該親合柱色鐠法分離的級分，分別供給使用氨基柱或者醯氨基柱的色譜，將分枝結構不同的糖鏈衍生物可以進行詳細分離，可以大量地製造單一結構的糖鏈。另外還發現，使分離的各糖鏈衍生物與適當的糖水解酶作用，供給採用氨基柱或者醯氨基柱的色鐠進行分離，對得到的糖鏈衍生物用質譜分析法進行處理，由此可以高精度且綜合地解析糖鏈結構，進而完成了本發明。在本發明的製造方法中使用的糖鏈混合物的糖鏈沒有特別的限制，包括天冬醯胺鍵合型糖鏈(N-葡糖戒鍵合型糖鏈)、mucin型糖鏈(0-葡糖戒鍵合型糖鏈)、游離型糖鏈、進一步還包括像糖鏈鍵合天冬醯胺那樣的結合了胺基酸的糖鏈。這些糖鏈也可以是利用化學的手法調製的糖鏈，例如，從天然的物，優選使用這些糖鏈的混合物。此外，優選使用含有在糖鏈殘基上具有唾液酸殘基的糖鏈的糖鏈混合物。作為天然糖鏈的混合物，可舉出天然原料、例如乳汁、牛由來胎球蛋白、卵或者生體的組織或細胞由來的糖鏈混合物。特別地，使用癌組織或者癌細胞由來的糖鏈混合物可以期待特別濃厚興趣的結果。作為本發明中可以使用的天然糖鏈的混合物，可優選以下所示的糖鏈混合物，特別優選含有唾液酸糖鏈的糖鏈混合物。可以使用下述獲得的混合物，即，從該天然原料中利用公知的方法獲得糖蛋白質以及/或者糖肽的混合物，使當該混合物與蛋白質分解酶等作用，切斷肽部分，利用釆用凝膠過濾柱或者離子交換柱等的色譜法進行精製獲得的糖鏈鍵合天冬醯胺的混合物。另外，可以使用下述獲得的混合物，即，釆用例如生體的組織或者細胞、特別是培養組織或培養細胞，將培養液中的組織或者細胞勻化，然後將離心分離獲得的細胞膜級分，用2-巰基乙醇處理後，使作用於N-聚糖酶(glycanase)，得到的糖鏈的混合物。另外，可以使用將培養組織或培養細胞勻化，採集離心分離的上清液獲得的游離糖鏈的混合物。在這些的糖鏈之中由於含有作為中性糖鏈的高甘露糖型糖鏈和多種唾液酸糖鏈，所以適用於各種糖鏈的製造。在獲得的糖鏈的混合物中的糖鏈上導入脂溶性基使其成為糖鏈衍生物的混合物。脂溶性基是與糖鏈的還原末端的開環醛、糖鏈鍵合天冬醯胺的天冬醯胺氨基或者羧基反應形成的、具有脂溶性的取代基，例如2-、3-或者4-羧基苯基氨基、p-乙氧基羰基苯基氨基、2-吡咬基氨基等作為通常螢光標記使用的取代基、或者9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)基、叔-丁氧基羰基(B0C)基、苄基、烯丙基、烯丙氧羰基、乙醯基等的作為氨基曱酸酯系或者醯胺系保護基使用的取代基。這些脂溶性基的導入可以利用公知的方法進行導入，從操作的簡便、得到的糖鏈衍生物的穩定性、激發光與水銀光源或者雷射光源對應等方面出發，可以優選使用2-羧基苯基氨基、Fmoc基或者BOC基。例如，採用2-氨基苯甲酸，在氰基硼氫化鈉或者二甲基氨基化硼等的還原劑的存在下，使其與糖鏈反應，由此可以成為氨基醛糖醇衍生物。另外，例如採用9-芴基甲基-N-琥珀醯亞胺基碳酸酯，在碳酸氫鈉存在下，使與糖鏈鍵合天冬醯胺反應，可以在天冬醯胺的氨基導入氨基曱酸酯樣上鍵合的Fmoc基。根據以上的操作，可以得到導入了脂溶性基的糖鏈衍生物的混合物。把獲得的糖鏈衍生物的混合物用5-羥色胺親合柱色譜法進行分離。本發明中的5-羥色胺親合柱色譜法可以採用把與唾液酸具有親合性的5-羥色胺作為配基的親合柱。作為5-羥色胺親合柱，可以將5-羥色胺固定在填充劑上製成，也可以採用市售的柱。作為市售的柱，可舉出LA-5-羥色胺柱(林式會社J-才4》糹/UX制)等。色鐠的分離條件可以適當設定，如果舉出其一例，釆用螢光檢測器，設定激發波長350nm、螢光波長425nm，流速0.5ml/min、流動相使用超純水和醋酸銨水溶液，進行直線梯度洗脫，可以達到分離。通過5-羥色胺親合柱色鐠法，將糖鏈衍生物的混合物，根據糖鏈衍生物的唾液酸殘基的數目可以進行分離，沒有唾液酸殘基的無唾液酸糖鏈衍生物最早洗脫，接著按單唾液酸糖鏈衍生物、二唾液酸糖鏈衍生物這樣地與唾液酸殘基的數目增加成比例地進行分離洗脫。把利用以上的5-羥色胺親合柱分離的糖鏈衍生物，用採用聚合物基質的氨基柱或者二氧化矽基質的醯氨基柱的正相HPLC進行處理，由此可以很好地進行糖鏈衍生物間的分離。所謂正相色鐠法，是將氨基、氨基丙基、丙烯醯胺基等極性固定相作為填充劑使用的色鐠法，其特徵在於，根據相對於試料成分的固定相-流動相的試料成分的分配度的差別達到分離。基本上是基於糖鏈的親水性而分離的模式，還可以優選用在結合了唾液酸的糖鏈的異構體的分離中。另外，還可以利用在採用稀酸或者唾液酸苷酶處理的無唾液酸型的糖鏈的分離中。作為使用的聚合物基質的氨基柱，是將把氨基結合在聚乙烯醇系基材凝膠等的聚合物上的固定相作為填充劑使用的柱子，可以使用自製的柱子、也可以使用市售的柱子。作為市售的氨基柱，可舉出AsahiShodexNH2P-504E(昭和電工林式會社制)。作為二氧化矽基質的醯氨基柱，是將把丙烯醯胺等的醯胺基與把二氧化矽作為固定相的填充劑進行化學鍵合而導入的柱子，可以使用自製的柱子、也可以使用市售的柱子。作為市售的醯氨基柱，可舉出TSK-GELAmide-80(TOSOHCorp制)。色譜的分離條件進行適宜地設定，如果舉出其一例，通過釆用螢光檢測器，激發波長350nm、螢光波長425nm,流速lml/min，流動相採用含有醋酸的乙腈和醋酸以及含有三乙胺的水溶液，進行線性梯度洗脫可以進行分離。以上那樣分離獲得的糖鏈衍生物通過採用糖水解酶、利用質鐠分析法進行分析，可以將其糖鏈結構解析。作為糖水解酶，可以採用^>知的酶，例如可舉出唾液酸酶、半乳糖苷酶、甘露糖苷酶、N-乙醯葡糖胺糖普酶(acetylglucosamidase)、巖藻糖苷酶等。作為質譜分析方法，利用採用現有公知的質譜分析法的質鐠分析裝置進行，近年特別優選採用用於糖鏈分析的MALDI-TOFMS進行測定。為了解析糖鏈結構，與特定的糖水解酶作用後，通過釆用聚合物基質的氨基柱或者二氧化矽基質的醯氨基柱的正相HPLC處理，將得到的級分質鐠分析，考慮到消失的質量分和水解酶的特性，可以通過進一步反覆該操作進行糖鏈結構解析。獲得的糖鏈衍生物通過將其脂溶性基除去，可以人工容易地且大量地獲得各種的糖鏈。脂溶性基的除去可以使用現有公知的方法。例如，2-羧基苯基氨基的除去通過在醋酸中與過氧化氫在室溫進行反應而達到，可以容易地作為游離型糖鏈回收。另夕卜，Fmoc基的除去通過在N，N-二曱基甲醯胺中、糖鏈衍生物中加入嗎啉進行反應來達到，為了除去B0C基，通過與弱酸反應來達到。糖鏈是糖鏈鍵合天冬醯胺的場合，通過與無水肼反應後乙醯化的方法，在鹼性水溶液中加熱回流後乙醯化的方法等，可以除去天冬醯胺殘基。該糖鏈類，在醫藥品開發等領域中非常有用，可舉出例如癌的疫苗合成，將得到的糖鏈類組合利用化學反應或糖轉移酶的反應等鍵合新的糖殘基而衍生物化，可以開發新的疫苗。本發明人等通過本發明的結構解析方法以及製造方法，成功地分離出在各種癌細胞中迄今為止沒有發現的下述式(1)~(6)表示的糖鏈。formulaseeoriginaldocumentpage12(1)formulaseeoriginaldocumentpage13formulaseeoriginaldocumentpage14這些新的糖鏈認為是在癌細胞中特異表達的物質，將這些糖鏈作為癌標記物可以利用。例如，製作與這些癌細胞中的特異的糖鏈特異識別的多克隆抗體或者單克隆抗體，利用免疫學的手法進行檢測該糖鏈而達到。多克隆抗體可以將該糖鏈或者該糖鏈的半抗原與蛋白質等的高分子化合物(載體)鍵合的鍵合體作為抗原，對小鼠、倉鼠、豚鼠、雞、大鼠、兔子、狗、山羊、綿羊、牛等的哺乳動物進行免疫致敏，從該哺乳動物採集血液，可以調製含有多克隆抗體的抗血清。單克隆抗體例如通過調製從由抗體產生細胞和骨髓瘤細胞林的細胞融合獲得的雜交瘤得到。培養這樣得到的雜交瘤，精製產生的單克隆抗體即可。附圖的簡單說明圖l表示實施例l獲得的糖鏈衍生物的親合柱色譖圖。圖2表示實施例2獲得的糖鏈衍生物的親合柱色譜圖。圖3表示實施例3獲得的糖鏈衍生物的HPLC的色譜圖。圖4表示實施例3獲得的糖鏈衍生物的HPLC的色譜圖。圖5表示實施例3獲得的糖鏈衍生物的HPLC的色譜圖。圖6表示實施例3獲得的糖鏈衍生物的HPLC的色語圖。圖7表示實施例3獲得的糖鏈衍生物的HPLC的色譜圖。圖8表示實施例4獲得的糖鏈衍生物的親合柱色譜圖。圖9表示實施例5獲得的糖鏈衍生物的HPLC的色謙圖。圖IO表示實施例6獲得的糖鏈衍生物的親合柱色鐠圖。圖ll表示實施例7獲得的糖鏈衍生物的親合柱色諳圖。圖12表示實施例7獲得的糖鏈衍生物的HPLC的色譜圖。具體實施例方式以下表示參考例以及實施例，本發明並不受到下述實施例的限定。實施例1利用5-羥色胺親合色謙分離來自人血清[1-酸性糖蛋白質(AGP)]的糖鏈將來自人血清的AGP(*夕*7TV"卜'y'7f-々^y制)lmg溶解在20mM磷酸緩沖溶液(pH7.5)50^1中，加入N-glycanaseF(2單位，4^1)，在37。C反應12小時。反應後在IOOX:煮沸3分鐘，回收離心分離後的上清。在回收的上清中加入分別使2-氨基苯甲酸(2-AA)和氰基硼氫化鈉為3%地溶解在2%硼酸、4%醋酸鈉混液(500|n1)中的溶液10Oji1，在80X:反應1小時。把反應混合物用50%甲醇水溶液平衡化的SephadexLH-20柱(0.7cmi.d.，30cm)進行分級，採用分光光度計(日立制、F-4010型)，利用激發波長335nm、螢光波長410nm測定各級分，把最初洗脫出的熒旋光性級分回收，作為糖鏈衍生物的混合物。把得到的混合物供給5-羥色胺親合柱色i普柱，得到分離的糖鏈衍生物。採用親合柱色語法的分離結果如圖1所示。5-羥色胺親合柱色鐠法的條件柱LA-Serotonin柱(4.6xl50mm，JapanOilmills制)泵JASCOPU-980型流速0-5ml/min檢測器JASCOFP-920型螢光檢測器激發波長350nm螢光波長425nm流動相溶液A釆用超純水、溶液B釆用40mM醋酸銨水溶液。梯度條件試料注入後，2分鐘為溶液B5%，37分鐘後醋酸銨濃度30mM,進行線性梯度洗脫，其後10分鐘醋酸銨濃度40mM的進行。予以說明，5-羥色胺親合色鐠的分離條件在以下的實施例也相同。實施例2(人癌細胞由來糖鏈利用5-羥色胺親合色諉的分離)細胞培養採用人腎上腺癌細胞ACHN、人肺癌細胞A549、人胃癌細胞MKN45以及人組織血細胞性淋巴瘤U937。通過ACHN以及A549預先在50^C加熱30分鐘，將非滅活的含有牛血清[NEWBORNCALFSERUM(NCS)、，>夕*7卜''J、7f夕弋戸7制]10%的DMEM(Dulbecco'sModifiedEagleMedium、夕/r7》卜*卩，7f'〉'弋Z》制)，U937以及MKN45採用含有10o/oNCS的RPMI-1640(,〉夕*^7^卜*!i'7f';弋^7制)，在5%(:02存在下，在37C在組織培養皿中培養。除去了U937的細胞在80%鋪滿狀態下，將培養中的細胞用等張化磷酸緩衝液(PBS)洗滌後，加入胰蛋白酶溶液，在37"C處理5分鐘後，回收剝離的細胞，用PBS洗滌後傳代培養。細胞膜級分的調製為了調製細胞膜級分，採用80%鋪滿狀態的細胞，利用刮削器(scraper),從培養器回收。回收的細胞用PBS洗滌後，在含有1%的蛋白酶抑制劑的10mMNa2HP04(pH7.5)中使用玻璃勻漿機勻漿後，使濃度為1x18cell/5ml，加入含有0.5M的蔗糖的20mM的Tris-HCl緩衝液(pH7.5)10ml,在4t:、3000rpm15分鐘離心分離後回收上清，然後，在4t:、19000rpm離心分離，將得到的沉澱作為細胞膜級分。從細胞膜級分游離糖鏈在細胞膜級分(1x107cell)中加入1%SDS溶液4(^1，加入2-巰基乙醇，使其為1%後，在ioox:的沸騰水浴上加熱5分鐘，由此進行可溶化。將含有膜級分的溶液冷卻到室溫，加入NP-40，使其為1%，加入磷酸緩衝液(pH7.5)，使終濃度為20mM。進一步，加入N-glycanaseF4^1(2單元、Rochediagnostics制)，在37^C下培養一晚，在IOOX:的沸騰水浴上煮沸5分鐘，加入95%乙醇，使其終濃度為75%，然後在41C、15000rpm下離心分離，將上清減壓千固，作為細胞膜由來的糖鏈。在調製完的各細胞膜由來的糖鏈中與上述實施例1相同地導入2-AA後，用5-羥色胺親合柱色鐠法處理，得到各糖鏈衍生物級分。釆用柱色鐠的分離結果表示在圖2中。實施例3(採用正相型醯氨基柱分離癌細胞由來的糖鏈以及結構解析)把實施例2得到的各級分的癌細胞由來的糖鏈衍生物(相當lx107cell)溶解在20mM醋酸緩衝液(pH5.0)20^1中，加入唾液酸酶4^1(2mU,7A《；/y《4才制)，在37C反應24小時。反應後在IOOX:煮沸3分鐘，回收離心分離後的上清。將得到的上清供給釆用醯氨基柱的正相HPLC，分取出糖鏈衍生物。用HPLC分離結果表示在圖3~7中。HPLC條件柱TSK-GELAmide-80(TOSOHCORPORATION,Japan;4.6x250mm)柱溫度40匸泵JASC0PU-980型流速lml/min檢測器JASCOFP-920型螢光檢測器激發波長350nm螢光波長425nm流動相溶液A採用含有0.2%醋酸的乙腈溶液，溶液B採用含有0.1%醋酸以及0.1%三乙胺的水溶液。梯度條件試料注入後2分鐘間溶液B為30%，60分後溶液B為65%，進行線性梯度洗脫。利用糖水解酶和質諉分析法的結構解析將U937由來的峰31的糖鏈衍生物溶解在20mM檸檬酸緩沖液(pH3.5)20jil中，加入P-半乳糖普酶25mU、生化學工業社制)，在37。C反應24小時。反應後在IOOTC沸煮3分鐘，回收離心分離後的上清。將得到的上清供給採用醯氨基柱的正相HPLC，將得到的級分的一部分利用MALDI-TOFMS分析。結果，得到分子量2718的糖鏈衍生物("將該糖鏈衍生物(a)溶解在20mM檸檬酸緩衝液(pH5.0)20|iil中，加入p-N-乙醯己糖胺酶(acetylhexaminidase)lpl(10mU,生化學工業社制)，在37C反應24小時。反應後在IOOX:沸煮3分鐘，回收離心分離後的上清，將得到的上清與上述相同地分析，結果，得到分子量1906的糖鏈衍生物(b)。進一步，將糖鏈衍生物(b)用P-半乳糖苷酶處理，結果，得到分子量1582的糖鏈衍生物(c)。根據以上的結果，判斷出峰31為下述式表示的糖鏈衍生物。formulaseeoriginaldocumentpage19相同地，峰35的糖鏈衍生物也用P-半乳糖苷酶、P-N-乙醯己糖胺酶、然後用P-半乳糖普酶，判斷出是下述式表示的糖鏈衍生物。formulaseeoriginaldocumentpage19對於其它的峰的衍生物，也適當採用水解酶，進行MALDI-TOFMS分析等，將相當於圖3~7所示的峰的糖鏈結構表示在表1~5中。予以說明，表1~14中的分子量表示在糖鏈還原末端結合2-氨基苯曱酸的狀態下的分子量(MW)，記號表示以下的物質。Gal:D-半乳糖、GlcNAc:N-乙醯己糖胺、Man:D-甘露醇、Fuc:巖藻糖、2-AA:2-氨基苯甲酸、NeuAc:唾液酸。這裡，在糖鏈還原末端結合了2-氨基苯甲酸的糖鏈，例如，下式表示的糖鏈部分結構表示成-4GlcMcPl-4GlcNAc-2-AA。formulaseeoriginaldocumentpage20MALDI-TOFMS分析裝置釆用VoyagerDE-PR0(PEBiosystems，Framingham，MA)，通過線性/陰離子模式，在加速電壓20kV、柵極電壓96.3%、停滯時間(Delaytime)1000nsec、透鏡偏移量(LensOffset)1.25、雷射強度(氮雷射)2700下測定。混合水中溶解的樣品0.5jiL和2，5-二羥基苯曱酸(DHB)的20mg/mL甲醇溶液0.5pL，乾燥後，作為測定用試樣使用。表1tableseeoriginaldocumentpage21表2tableseeoriginaldocumentpage22tableseeoriginaldocumentpage23tableseeoriginaldocumentpage24表5tableseeoriginaldocumentpage25實施例4(細胞內存在的游離糖鏈1)將人胃癌細胞MKN45用PBS洗滌後，使濃度為1x108cell/5ml，採用玻璃勻漿機在含有1%的蛋白酶抑制劑的10mMNa2HP04(pH7.5)中勻漿後，加入含有0.5M蔗糖的20mM的Tris-HCl緩衝液(pH7.5)10ml，在4X:、3000rpm下離心分離15分鐘後，收集上清，進一步在4匸、19000rpm離心分離，將其上清減壓幹固，得到游離型糖鏈混合物。在得到的游離型糖鏈混合物中，與實施例l記載的方法相同地導入2-AA,得到游離型糖鏈衍生物的混合物，用5-羥色胺親合柱色謙法分級，得到游離型糖鏈衍生物。利用親合柱色鐠法的分離結果表示於圖8。將得到的各級分通過釆用氨基柱的正相HPLC分離，得到游離型糖鏈矛汴生物。HPLC條件柱AsahiShodexNH2P-504E(ShowaDenko，Tokyo,Japan;4.6x250mm)柱溫度50匸泵JASC0PU-980型流速1ml/min檢測器JASCOFP-920型焚光檢測器激發波長350nm螢光波長425nm流動相溶液A釆用含有2%醋酸的乙腈溶液，溶液B採用含有5%醋酸以及3%三乙胺的水溶液。梯度條件試料注入後，2分鐘溶液B為30。/。，80分後溶液B為95%，進行線性梯度洗脫，直到100分鐘，將溶液B保持為95。/0。將得到的游離型糖鏈衍生物適當與糖水解酶(唾液酸酶、oc-甘露糖苷酶、p-半乳糖苷酶、P-N-乙醯己糖胺酶等)作用，通過釆用上述氨基柱的正相HPLC分離後，將得到的級分冷凍乾燥後，通過MALDI-TOFMS分析，對游離型糖鏈衍生物的結構進行解析。予以說明，用ot-甘露糖苷酶的處理通過下述進行，即，把糖鏈衍生物溶解在20mM檸檬酸緩衝液(pH4.5)20^11,加入ot-甘露糖苷酶2^1(iomu，生化學工業社制)，在37x:反應24小時，反應後在ioox:煮沸3分鐘，回收離心分離後的上清。用其它的糖水解酶的處理如前述實施例中的記載相同。得到的糖鏈衍生物表示於表6以及7中。表6以及7的游離型糖鏈是新的化合物，例如No.1的分子量1321的糖鏈衍生物是下述式表示的。formulaseeoriginaldocumentpage27tableseeoriginaldocumentpage28表7tableseeoriginaldocumentpage29實施例5(存在於細胞內的游離糖鏈2)代替人胃癌細胞MKN45，採用人T細胞淋巴瘤Jurkat27(導入糖鏈的細胞林)，除此以外，與實施例4相同地操作，得到游離型糖鏈混合物。在得到的游離型糖鏈混合物中與實施例1記載的方法相同地導入2-AA，得到游離型糖鏈衍生物的混合物，用5-羥色胺親合柱色鐠法分級，得到游離型糖鏈衍生物。將得到的各級分通過使用醯氨基柱的正相HPLC分離，得到游離型糖鏈衍生物。HPLC條件柱TSK-GELAmide-80(TOSOHCORPORATION,Japan;4,6x250mm)柱溫度40^泵JASC0PU-980型流速lml/min檢測器JASC0FP-920型螢光檢測器激發波長350nm螢光波長425nm流動相溶液A採用含有0.1%醋酸的乙腈溶液、溶液B釆用含有0.2%醋酸以及0.2%三乙胺的水溶液。梯度條件試料注入後2分鐘，溶液B為30%,60分後溶液B達到65%，進行線性梯度洗脫。用HPLC分離結果表示在圖9中。將得到的游離型糖鏈衍生物，與實施例4相同地操作，對游離型糖鏈衍生物的結構進行解析。得到的糖鏈衍生物表示於表8。表8tableseeoriginaldocumentpage30實施例6(人子宮頸部癌細胞的糖鏈)將人子宮頸部癌細胞HeLa預先在50匸加熱30分鐘，採用含有非滅活的NCS10。/。的DMEM進行培養。在80°/。鋪滿狀態下，把培養中的細胞用PBS洗滌後，加入胰蛋白酶溶液，在37匸處理5分鐘後，回收剝離的細胞，用PBS洗滌後傳代培養，與實施例2記載的細胞膜級分的調製、從細胞膜級分游離糖鏈相同地進行處理，得到細胞膜由來的糖鏈混合物，與上述實施例1相同地導入2-AA後，用5-羥色胺親合柱色i普法處理，得到各糖鏈衍生物級分。採用柱色鐠的分離結果表示在圖10中。將得到的無唾液酸基糖鏈衍生物級分、單唾液酸糖鏈衍生物級分以及二唾液酸糖鏈衍生物級分用唾液酸酶處理後，用採用氨基柱的正相HPLC分離，得到糖鏈衍生物。HPLC條件與實施例4相同。將得到的糖鏈衍生物適當地與糖水解酶(唾液酸酶、oc-甘露糖苷酶、p-半乳糖苷酶、P-N-乙醯己糖胺酶等)作用，用釆用上述氨基柱的正相HPLC分離後，將得到的級分冷凍乾燥後，用MALDI-TOFMS分析，解析糖鏈衍生物的結構。得到的糖鏈衍生物表示在表9~12中。表9tableseeoriginaldocumentpage31表10單唾液酸糖鏈衍生物tableseeoriginaldocumentpage32表lltableseeoriginaldocumentpage33表12二唾液酸糖鏈衍生物-2tableseeoriginaldocumentpage34實施例7(癌細胞特異性抗原CD98的糖鏈)利用免疫沉降法調製CD98-HC把蛋白質A-瓊脂糖50^1(少夕'T7Vk卜'！；少f'〉'*川》制)用PBS20(V1洗滌後，加入PBS50jli1以及10jng/l(Vl的抗CD98抗體，在室溫反應60分鐘。反應後，用PBSlml除去非吸附成分，得到抗CD98抗體固定化瓊脂糖，抗CD98抗體固定化瓊脂糖中，加入通過l%NP-40(400jtl)溶化的HeLa細胞的膜級分(2x107cell),採用旋轉搖床，在4。C培養一晚。然後，用PBSlml洗滌，除去非吸附成分，離心分離後，在抗CD98抗體固定化瓊脂糖中加入解離溶液(250mMTris-HCl緩衝液pH6.8/4.6%SDS，20%丙三醇)和2-巰基乙醇的9:1混液20^1，煮沸5分鐘，在15000rpm下離心的上清作為CD98-HC，供給SDS-PAGE。SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳凝膠電泳裝置以及電源都使用BioRad制的。泳動凝膠釆用7.5%凝膠。作為泳動緩衝液，使用25mMTris，198mM甘氨酸，1%(w/v)SDS進行。最初的1小時每1枚凝膠在5mA，然後在10mA下進行泳動，直到凝膠下邊部分。考馬斯亮藍(CoomassieBrilliantBlue)染色SDS-Page結束後，用40%(v/v)甲醇，10%(v/v)醋酸/0.2%CoomassieBrilliantBlueR250中進行蛋白質的染色。1小時後，採用甲醇醋酸水(=4:1:5)脫色。蛋白質印跡法(WesternBlot)將SDS-PAGE後的凝膠用BIO-RAD制半乾式印跡裝置(transblotSDcell)，將凝膠中的蛋白質試樣轉印到PVDF膜上。PVDF膜採用預先浸漬在曱醇中60秒，然後浸漬在48mMTris，39mM甘氨酸，20%曱醇(pH9.0)中1小時的膜，用100mA定電流失加1小時電壓，進行轉印。轉印後，將PVDF膜用含有5%脫脂乳以及0.05。/。Tween20的PBS掩蔽操作後，加入含有抗CD98抗體5jig的0.05%Tween20/PBS(5ml)，反應一晚。反應後，將PVDF膜用含有0.05%Tween20的PBS(20ml)洗滌4回後，加入含有HRP標記的蛋白質A5jnl的0.05%Tween20/PBS(5ml)，反應1小時。反應後，將PVDF膜用含有0.05%Tween20的PBS(20ml)'冼滌4回，加入含有0.05%DAB(3,3'-Diaminobenzidrine,tetrahydrochloride)的lOOmMTris-HCl緩衝液pH7.5，0.0031%過氧化氫溶液20ml，使其發色。利用N-glycanaseF進行凝膠內消化利用CBB染色確認條帶後，將脫色液置換為水，切出目的物的條帶，放入Eppendorf離心管中。然後，加入乙腈100^1，放置30分鐘，由此將凝膠脫水，除去乙腈後，加入含有2單位的N-glycanaseF的Tris-HCl緩沖液pH7.5100^1，在37'C培養一晚，切出糖鏈。然後，回收提取液，進一步加入水20(^1,攪拌30分鐘，從凝膠得到糖鏈混合物。對以上那樣得到的糖鏈混合物，用和上述實施例1相同地導入2-AA後，利用5-羥色胺親合柱色鐠法處理，得到各糖鏈衍生物級分。採用柱色譜的分離結果表示在圖11中。將得到的單唾液酸糖鏈衍生物級分以及二唾液酸糖鏈衍生物級分用唾液酸酶處理後，用採用氨基柱的正相HPLC分離，得到糖鏈衍生物。HPLC條件與實施例4相同。用HPLC的分離結果表示在圖12中。得到的糖鏈衍生物適當地與糖鏈水解酶(唾液酸酶、oc-甘露糖普酶、p-半乳糖苷酶、P-N-乙醯己糖胺酶等)作用，用採用上述氨基柱的正相HPLC分離後，將得到的級分冷凍乾燥後，用MALDI-TOFMS分析，由此解析糖鏈衍生物的結構。得到的糖鏈衍生物表示在表1314中。tableseeoriginaldocumentpage37表14tableseeoriginaldocumentpage38產業上的可利用性根據本發明的方法，可以詳細地對特別是細胞或者組織中的糖鏈混合物進行分離，可以綜合地解析該糖鏈結構，由此可以尋求現有未知的糖鏈以及其功能，在今後的糖鏈研究中可以期待大的貢獻。權利要求1.糖鏈衍生物的製造方法，是從糖鏈混合物製造糖鏈衍生物的方法，其特徵在於，包括下述工序(a)在糖鏈混合物中的糖鏈上導入脂溶性基，得到糖鏈衍生物的混合物的工序、以及(b)將該糖鏈衍生物的混合物用5-羥色胺親合柱色譜法進行處理的工序。2.權利要求1記載的糖鏈衍生物的製造方法，其中在(b)工序之後具備(c)通過採用氨基柱或者醯氨基柱的正相色譜法進行處理的工序。3.權利要求2記載的糖鏈衍生物的製造方法，其中，在(c)工序之前，具備(d)用糖水解酶進行處理的工序。4.權利要求1記載的糖鏈衍生物的製造方法，其中，脂溶性基為2-羧基苯基氨基或者芴基曱氧基羰基。5.權利要求2記載的糖鏈衍生物的製造方法，其中，氨基柱是聚合物基質的氨基柱。6.權利要求2記載的糖鏈衍生物的製造方法，其中，醯氨基柱是二氧化矽基質的醯氨基柱。7.權利要求1記載的糖鏈衍生物的製造方法，其中，糖鏈混合物是天然糖鏈的混合物。8.權利要求1記載的糖鏈衍生物的製造方法，其中，糖鏈混合物是細胞由來的糖鏈的混合物。9.權利要求1記載的糖鏈衍生物的製造方法，其中，糖鏈混合物是含有唾液酸糖鏈形成的糖鏈混合物。10.糖鏈的結構解析方法，是解析糖鏈混合物中的糖鏈的結構的方法，其特徵在於，具備以下工序(a)在糖鏈混合物中的糖鏈上導入脂溶性基，得到糖鏈衍生物的混合物的工序、(b)將該糖鏈衍生物的混合物用5-羥色胺親合柱色鐠法進行處理的工序、以及(e)用質讒分析法進行處理的工序。11.權利要求IO記載的糖鏈的結構解析方法，其中，在(b)工序之後，具備(C)利用釆用氨基柱或者醯氨基柱的正相色譜法進行處理的工序。12.權利要求IO記載的糖鏈的結構解析方法，其中，在(c)工序之前，具備(d)用糖水解酶進行處理的工序。13.權利要求IO記載的糖鏈的結構解析方法，其中，質語分析法是利用MALDI-T0FMS的質鐠分析法。14.式(l)~(6)表示的糖鏈衍生物，(1)formulaseeoriginaldocumentpage3formulaseeoriginaldocumentpage4formulaseeoriginaldocumentpage5(6)式中r表示2-羧基苯基、3-羧基苯基、"羧基苯基、對-乙氧基羰基苯基、或者2-吡啶基，W表示羥基、基-Asn或者基-Asn-R3，在此，Asn表示天冬醯胺基，W表示氨基曱酸酯系或者醯胺系保護基，Ac表示乙醯基。15.由式(l)~(6)表示的糖鏈衍生物衍生的癌標記物。全文摘要本發明涉及糖鏈衍生物的製造方法，是從糖鏈混合物製造糖鏈衍生物的方法，其特徵在於，具備下述工序(a)在糖鏈混合物中的糖鏈上導入脂溶性基，得到糖鏈衍生物的混合物的工序，以及(b)將該糖鏈衍生物的混合物用5-羥色胺親合柱色譜法處理的工序。文檔編號C08B37/00GK101223194SQ20068002617公開日2008年7月16日申請日期2006年7月19日優先權日2005年7月19日發明者掛樋一晃,木下充弘,松野裕樹申請人:大塚化學株式會社