一種增強多肽藥物從細胞內體逃離的蛋白載藥系統及其應用的製作方法
2023-07-20 10:03:16 1
專利名稱：一種增強多肽藥物從細胞內體逃離的蛋白載藥系統及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及抗腫瘤多肽藥物，更具體地講，涉及一種增強多肽藥物從細胞內體逃離的蛋白載藥系統。
背景技術：
多肽作為藥物治療腫瘤是一個新興研究領域。多肽用於治療疾病具有一些重要的優點:1、與小分子化學藥相比，多肽分子容易設計成幾乎任何多肽序列；2、多肽分子容易製備，並且它們的序列容易利用化學合成和分子生物學技術進行修飾。目前利用多肽治療腫瘤主要存在的瓶頸:多肽在血液循環系統中快速地被降解，並且它的較大分子量和帶電荷性質使它很難穿過細胞膜。目前的方法是通過與大分子載體結合增加多肽的穩定性，與細胞穿膜肽(CPPs)結合克服其穿膜差的缺點。TAT是一種細胞穿膜肽(CPPs)，來自於HIV TAT蛋白的第49_57位胺基酸序列。目前有人利用TAT轉運鐵納米顆粒和螢光量子點進入細胞，還將TAT融合蛋白和多肽轉運到活體小鼠的細胞中研究治療腫瘤模型小鼠。早期報導TAT的轉運是通過一個非內吞作用機制，類似於像其他CPPs直接通過瓦解細胞膜進入細胞。但是近些年被廣泛接受的是TAT通過大胞飲作用的細胞內吞機制進入細胞。雖然TAT能攜帶融合物從內體逃離，但是人們發現還是有90%的TAT融合物被困在內體中無法逃脫最終被溶酶體降解。因此，增強TAT逃離內體的能力將是提高其轉運效率的關鍵所在。內吞作用是細胞攝取胞外物質的一種方式。但是經歷內吞途徑的藥物本身逃離內體的能力都很弱。目前有多種方法可以幫助藥物逃離內體，都是基於已經比較清楚地內體逃離機制，如在內體膜上形成小孔，PH緩衝效應，內體逃離增強子的構象改變和光敏劑瓦解膜結構。 流感病毒的血細胞凝集素(HA)的亞基HA2是一個帶負電的雙極性多肽。在低pH值時，其穀氨酸和天冬氨酸的質子化導致其構象改變成螺旋結構，進而與膜融合，導致內體的膜穩定性變差，從而逃離內體。因此，HA2在多個研究中已經被用來作為內體逃離的融合多肽。另一個由HA2改進而來的多肽INF7逃離內體能力更強，並且在轉運SiRNA，蛋白和利用多聚物轉運基因中都已經得到應用。
發明內容
本發明的第一個目的，在於提供一種增強多肽藥物從細胞內體逃離的蛋白載藥系統，提高TAT轉運多肽藥物的效率，使藥物快速從內體中釋放，進而促進其藥效充分地發揮。本發明的第二個目的，在於提供編碼所述增強多肽藥物從細胞內體逃離的蛋白載藥系統的核酸序列。本發明的第三個目的，在於提供含有所述核酸序列的表達質粒構建體。
本發明的第四個目的，在於提供所述增強多肽藥物從細胞內體逃離的蛋白載藥系統在運載藥物中的應用。為實現上述第一個目的，本發明公開以下技術方案:一種增強多肽藥物從細胞內體逃離的蛋白載藥系統，其特徵在於，包括細胞穿膜肽TAT，內體逃離增強子INF7，泛素蛋白和多肽藥物，所述TAT，INF7，泛素蛋白和多肽藥物依次連接。作為一個優選方案，所述多肽藥物包括Bak BH3多肽，Survivin生存素及其變體和WlO多肽中的一種或幾種。作為一個優選方案，所述泛素蛋白來源於人。為實現上述第二個目的，本發明公開以下技術方案:編碼增強多肽藥物從細胞內體逃離的蛋白載藥系統的核酸，其序列如下所示(SEQ ID N0.1),CATATGCACCACCACCACCACCACGGTCGTAAAAAACGTCGTCAAC GCCGTCGTGGTAGCGGTGGTAGTGGTGGTAGCGGCGGTAGCGGTGGCAG TGGTGGTTCAGGTGGTTATTGGGGTGACATTATGGGCGAATGGGGCAATG AAATTTTCGGCGAAATTGCCGAATTCCTGGGCGGTAGCGGTGGTAGCGGT GGCAGCGGCGGTAGTGGCGGCAGTGGCGGCTCGGGCGGCAGCTTGTAGA TTTTTGTGAAAACCCTGACCGGCAAAACCATTACCCTGGAAGTGGAACC GAGCGATACCATTGAAAACGTGAAAGCGAAAATTCAGGATAAAGAAGGC ATTCCGCCGGATCAGCAGCGCCTGATTTTTGCGGGCAAACAGCTGGAAG ATGGCCGCACCCTGAGCGATTATAACATTCAGAAAGAAAGCACCCTGCAT CTGGTGCTGCGCTCAAAAGGCGGCCAGGTGGGTCGTCAGCTGGCAATCA TCGGTGACGACATTAACCGTTGATAATAGCTCGAG。為實現上述第三個目的，本發明公開以下技術方案:含有所述核酸序列的表達質粒構建體。 為實現上述第四個目的，本發明公開以下技術方案:增強多肽藥物從細胞內體逃離的蛋白載藥系統在運載藥物中的應用，其特徵在於，所述載藥系統增強多肽藥物從細胞內體逃離。本發明的優點在於:提供一種增強多肽藥物從細胞內體逃離的蛋白載藥系統，通過含有多個功能域的蛋白載藥系統來增強多肽藥物從細胞內體中釋放，提高TAT轉運多肽藥物的效率，使藥物快速從內體中釋放，進而促進其藥效充分地發揮。
圖1顯示了蛋白載藥系統轉載模式蛋白紅色突光蛋白mCherry表達載體以及其它對照蛋白表達載體的構建示意圖。TIU-mCherry代表:蛋白載藥系統Tat-1NF7-Ub (Ubiquitin)後直接連接mCherry蛋白；TIUV_mCherry代表:蛋白載藥系統Tat-1NF7-Ub中的Ubiquitin是個突變體，即最後一個甘氨酸(G)變為纈氨酸(V)，意味著這個突變體不會被去泛素酶酶切；TU-mCherry代表:蛋白載藥系統Tat_INF7_Ub中缺失內體逃離增強子INF7 ;T1-mCherry代表:蛋白載藥系統Tat_INF7_Ub中缺失泛素蛋白；Tat-mCherry代表:mCherry蛋白由TAT穿膜肽介導轉運；mCherry代表:紅色突光蛋白。圖2顯示了蛋白載藥系統轉載mCherry蛋白的誘導表達SDS-PAGE電泳圖。泳道1:空表達載體pET20b轉入BL21(DE3)，30°C誘導；泳道2_4:30°C誘導，分別為誘導O小時，誘導6小時的上清，誘導6小時的沉澱。圖中顯示大部分表達的蛋白載藥系統轉載mCherry蛋白在菌體中是可溶性的，只有少部分蛋白是以包涵體形式存在在菌體中。
圖3顯示了咪唑濃度梯度洗脫目的蛋白曲線圖。藍線:UV值；綠線:咪唑濃度增長值；A峰:上清液流穿柱子峰；B峰:目的蛋白洗脫峰。說明目的蛋白在咪唑濃度為220mM左右可以被洗脫。圖4顯示了各個純化後的融合mCherry蛋白。TIUC: TIU-mCherry蛋白；TIUvC:TIUV-mCherry 蛋白；TUC:TUnCherry 蛋白；TIC:TInCherry 蛋白；TC:TatnCherry蛋白。圖5顯示了 TIUC，TIC和TC蛋白孵育不同細胞繫結果圖。橫坐標，A549, HeLa, HCTl 16分別代表不同細胞系；縱坐標，TIUC, TIC和TC分別代表TIUiCherry蛋白，ΤΙ-mCherry蛋白和Tat-mCherry蛋白。在A549細胞和HCTl 16細胞中，與TC蛋白孵育後細胞內的紅色螢光信號只分布在細胞內局部區域相比較，TIUC蛋白和TIC蛋白孵育的細胞內螢光信號能分布得更廣泛。這說明內體逃離增強子INF7在融合蛋白中促進了 TAT介導的蛋白轉運過程中內體逃離作用。因為INF7幫助TAT融合蛋白進入細胞質然後在細胞中擴散；雖然TAT有較弱的內體逃離能力，但是大部分的TC融合蛋白還是被困在內體中無法逃脫，造成TC蛋白被限制在細胞內的局部區域。圖6顯示了用Western Blot方法檢測蛋白載藥系統的可行性。a) INF7促進轉運和DUBs酶切結果,泳道mCherry:天然mCherry蛋白樣品；泳道TIU-Δ:純化的TIUC蛋白樣品與收集的A549和HCT116細胞一起混合製備的樣品，為了確認在樣品製備過程中不會影響蛋白的完整性；泳道TU- Δ和TIUV- Δ:1μ MTIUC, TUC和TIUvC蛋白分別與Α549和HCTl 16細胞孵育的樣品；b)去泛素酶切對照實驗結果，泳道mCherry和TIU-Λ:分別是天然mCherry蛋白和純化的TIUC蛋白樣品j}dtTIU-A，TIU-Λ+NEM和TIUV-Λ:分別是TIUC和TIUvC蛋白與A549細胞的細胞質粗提液和含有DUBs抑制劑N-ethylmaleimide (NEM)孵育的樣品；c)TIUC蛋白進入細胞後被DUBs酶切結果，泳道mCherry:天然mCherry蛋白樣品；泳道4h-24h:1 μ M的TIUC蛋白與Α549細胞在無血清的培養基中孵育4個小時後，洗去未進入細胞的蛋白，再加入含血清的培養基繼續孵育不同時間的樣品；d)是a)部分的泳道TU-Δ和TIU-Λ的TUC和TIUC蛋白分別與Α549和HCT116細胞孵育後去泛素的灰度值統計結果；e)是c)部分去泛素的統計結果。
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圖7顯示了蛋白載藥系統分別轉載Bak BH3和WlO兩個多肽表達載體以及其它對照蛋白表達載體的構建示意圖。TIU-WlO代表:蛋白載藥系統轉載WlO多肽；TIU-BH3代表:蛋白載藥系統轉載Bak BH3多肽；T1-BH3代表:缺失泛素的蛋白載藥系統轉載Bak BH3多肽；Tat-BH3代表:TAT穿膜肽介導轉運Bak BH3多肽。圖8顯示了蛋白載藥系統轉載Bak BH3多肽的誘導表達SDS-PAGE電泳圖。泳道1:誘導前全菌體樣品；泳道2-3:25°C誘導10小時的上清和沉定；泳道M:蛋白分子量標準。圖9顯示了孵育TIU-BH3後A549細胞經Annexin V-FITC染色後的顯微圖。未孵育蛋白的細胞(untreated)的細胞膜沒有被染成綠色，而孵育了 TIU-BH3融合蛋白的細胞(treated)的細胞膜被染成綠色並呈現凋亡狀態。與未孵育TIU-BH3融合蛋白的細胞相比較，孵育24小時TIU-BH3融合蛋白的細胞，其大部分的細胞膜上被染為綠色，並且出現明顯地凋亡的形態學特徵:細胞皺縮，細胞個體變小和變圓。這些結果表明TIU-BH3融合蛋白能夠誘導A549細胞凋亡。圖10顯示了不同融合蛋白誘導細胞凋亡的流式分析及統計圖。a)細胞處理後流式細胞儀檢測圖，A549細胞與不同蛋白和試劑孵育24小時後，用Annexin V-FITC試劑盒染色，然後利用流式細胞儀去檢測，利用紫杉醇作為陽性對照山)流式細胞儀檢測統計結果，經流式細胞檢測後發現，相比於Tat-BH3融合蛋白誘導A549細胞出現20.45±2.89%的凋亡率，TIU-BH3 融合蛋白能誘導 A549 細胞出現 46.15±4.86%(p<0.001，Tukey - Kramer)的
凋亡率。
具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Samtoook等人，分子克隆:實驗室手冊(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件,或按照製造廠商所建議的條件。儘管特定的實施例描述了蛋白載藥系統的構建，對於本領域的技術人員來說很顯然任意的穿膜肽，內體逃離增強子及其蛋白藥物可在所提供方法中被取代。實施例1.蛋白載藥系統轉載模式蛋白紅色螢光蛋白mCherry表達載體的構建含有TAT，INF7，泛素及mCherry蛋白表達載體及對照表達載體通過下述來產生:首先，將編碼TAT，INF7,泛素及mCherry蛋白的核酸序列通過PCR擴增，其利用含有NdeI位點的5，引物，以及帶有XhoI位點的3，引物。其次，PCR產物從NdeI和XhoI位點之間克隆到表達載體pET20b中。其他對照表達載體同樣以類似方法克隆到表達載體pET20b的NdeI和XhoI位點之間。所有的融合蛋白在其C末端含有聚組氨酸標記(圖1)。編碼載藥系統的核 酸序列如下所示(SEQ ID N0.1):CATATGCACCACCACCACCACCACGGTCGTAAAAAACGTCGTCAAC GCCGTCGTGGTAGCGGTGGTAGTGGTGGTAGCGGCGGTAGCGGTGGCAG TGGTGGTTCAGGTGGTTATTGGGGTGACATTATGGGCGAATGGGGCAATG AAATTTTCGGCGAAATTGCCGAATTCCTGGGCGGTAGCGGTGGTAGCGGT GGCAGCGGCGGTAGTGGCGGCAGTGGCGGCTCGGGCGGCAGCTTGTAGA TTTTTGTGAAAACCCTGACCGGCAAAACCATTACCCTGGAAGTGGAACC GAGCGATACCATTGAAAACGTGAAAGCGAAAATTCAGGATAAAGAAGGC ATTCCGCCGGATCAGCAGCGCCTGATTTTTGCGGGCAAACAGCTGGAAG ATGGCCGCACCCTGAGCGATTATAACATTCAGAAAGAAAGCACCCTGCAT CTGGTGCTGCGCTCAAAAGGCGGCCAGGTGGGTCGTCAGCTGGCAATCA TCGGTGACGACATTAACCGTTGATAATAGCTCGAG。編碼載藥系統轉載指示蛋白mCherry的核酸序列如下所示(SEQ ID N0.2):CATATGCGTAAAAAACGTCGTCAACGCCGTCGTGGTAGCGGTGGTAG TGGTGGTAGCGGCGGTAGCGGTGGCAGTGGTGGTTCAGGTGGTTATTGG GGTGACATTATGGGCGAATGGGGCAATGAAATTTTCGGCGAAATTGCCGA ATTCCTGGGCGGTAGCGGTGGTAGCGGTGGCAGCGGCGGTAGTGGCGGC AGTGGCGGCTCGGGCGGCAGCTTGTAGATTTTTGTGAAAACCCTGACCG GCAAAACCATTACCCTGGAAGTGGAACCGAGCGATACCATTGAAAACGT GAAAGCGAAAATTCAGGATAAAGAAGGCATTCCGCCGGATCAGCAGCGC CTGATTTTTGCGGGCAAACAGCTGGAAGATGGCCGCACCCTGAGCGATTA TAACATTCAGAAAGAAAGCACCCTGCATCTGGTGCTGCGCTCAAAAGGC GGCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGGATAACATGGCCATCATCAAGGAGT TCATGCGCTTCAAGGTGCACATGGAGGGCTCCGTGAACGGCCACGAGTT CGAGATCGAGGGCGAGGGCGAGGGCCGCCCCTACGAGGGCACCCAGAC CGCCAAGCTGAAGGTGACCAAGGGTGGCCCCCTGCCCTTCGCCTGGGAC ATCCTGTCCCCTCAGTTCATGTACGGCTCCAAGGCCTACGTGAAGCACCC CGCCGACATCCCCGACTACTTGAAGCTGTCCTTCCCCGAGGGCTTCAAGT GGGAGCGCGTGATGAACTTCGAGGACGGCGGCGTGGTGACCGTGACCC AGGACTCCTCCCTGCAGGACGGCGAGTTCATCTACAAGGTGAAGCTGCG CGGCACCAACTTCCCCTCCGACGGCCCCGTAATGCAGAAGAAGACCATG GGCTGGGAGGCCTCCTCCGAGCGGATGTACCCCGAGGACGGCGCCCTGA AGGGCGAGATCAAGCAGAGGCTGAAGCTGAAGGACGGCGGCCACTACG ACGCTGAGGTCAAGACCACCTACAAGGCCAAGAAGCCCGTGCAGCTGC CCGGCGCCTACAACGTCAACATCAAGTTGGACATCACCTCCCACAACGA GGACTACACCATCGTGGAACAGTACGAACGCGCCGAGGGCCGCCACTCCACCGGCGGCATGGACGAGCTGTACAAGCTCGAGomCherry為示範，克隆在pET20b載體上進行表達利用性研究，獲得了預期的結果。蛋白載藥系統轉載mCherry及對照蛋白的表達與純化首先，將表達質粒轉化入表達菌株E.coli BL21(DE3)中；從轉化的平板上挑選單菌落接種到含氨苄抗性的5ml LB液體培養基中培養過夜，然後取Iml過夜培養的菌液轉接到含氨苄抗性的IOOml LB液體培養基中，370C，180rpm培養到菌液OD6tltl值在0.6左右；接著添加誘導劑IPTG至終濃度0.5mM, 30°C誘導6小時；誘導表達結束後，4°C，7000g離心15分鐘收集菌體，取部分菌體檢測蛋白誘導表達情況(圖2);接著用IOml蛋白純化平衡緩衝液(4.94g K2HPO4.3Η20，0.4559g KH2PO4,14.61gNaCl, 1.70g 咪唑溶解於 500mL 雙蒸水中至澄清，調PH到7.4)重懸菌體，進行超聲破碎。接著離心取上清液，並上樣到蛋白純化系統的聚組氨酸蛋白純化柱子上；然後利用蛋白純化系統用蛋白純化洗脫緩衝液(4.94gK2HPO4.3Η20，0.4559g KH2PO4,14.61gNaCl, 12.21g 咪唑溶解於 500mL 雙蒸水中至澄清，調pH到7.4)進行線性洗脫目的蛋白(圖3)。由於所有融合有mCherry的蛋白在波長為587nm處消光係數都為 .2X IO4M-1Cm-1,因此蛋白濃度可以通過可見分光光度計在587nm處測定吸收值計算出來。每個純化後的融合蛋白分裝後_80°C保存(圖4)。蛋白載藥系統的可行性檢測首先用螢光顯微鏡觀 察蛋白載藥系統轉載mCherry蛋白進入細胞；將細胞接種到6孔的細胞培養板，控制每孔細胞數大約是I X IO6個，過夜培養後，用預冷的PBS漂洗數次細胞，在無血清的培養基中分別孵育I μΜ的蛋白載藥系統蛋白及其它對照融合蛋白，孵育4小時後，用預冷的含20U ml/1肝素的PBS漂洗數次細胞去除與細胞膜非特異性結合的蛋白，之後消化細胞，200g離心10分鐘收集細胞，然後用HEPES細胞成像緩衝液重懸細胞，滴加到載玻片上，在561nm激發光波長下觀察並拍照(圖5)。接著驗證蛋白載藥系統能被去泛素酶專一性酶切；孵育蛋白方法同上，孵育結束後用預冷的含20U ml/1肝素的PBS漂洗數次細胞去除與細胞膜非特異性結合的蛋白，之後消化細胞，200g離心10分鐘收集細胞，用RIPA裂解液裂解細胞進行Western Blot分析(圖6，a);同時，融合蛋白與肺癌細胞A549細胞質粗提液孵育，即收集A549細胞，用lmlNP-40溫和裂解液(選擇該裂解液的目的不使去泛素酶失活)重懸細胞，冰上孵育10分鐘，4°C，13，OOOg離心20分鐘，取上清，製得細胞質粗提液，將融合蛋白與細胞質粗提液37°C孵育I小時，或將融合蛋白與添加有IOmM N-順丁烯二醯亞胺的細胞質粗提液37°C孵育I小時，隨後取樣進行Western Blot分析(圖6，b)。然後檢測蛋白載藥系統轉載蛋白效率；孵育蛋白方法同上，孵育4小時後用預冷的含20U mL_1肝素的PBS漂洗數次細胞去除與細胞膜非特異性結合的蛋白，之後補加含血清(5%)培養基繼續孵育到4，6，12，24個小時不等時間，隨後取樣進行Western Blot分析(圖 6, C)。根據圖6Western Blot分析，a)泳道3_4和8_9都有融合蛋白與細胞孵育後出現了一條大小與純化的mCherry蛋白相一致的條帶；但是在泳道5和10上，融合了Ubiquitin(G76V)突變體的蛋白TIUvC與細胞孵育後沒有出現這樣大小的條帶；說明出現大小與mCherry蛋白相一致的條帶不是由融合蛋白TIUC和TUC在細胞內被蛋白酶非特異性酶切造成，而是由DUBs酶對融合蛋白專一性酶切的結果。並且純化的TIUC蛋白樣品(泳道2與7)與收集的細胞一起混合製備樣品也沒有出現mCherry蛋白大小的條帶,這說明融合蛋白的去泛素作用不是來自於樣品製備過程中與細胞質中的DUBs酶接觸造成，而是蛋白孵育細胞後進入細胞質被DUBs酶切的結果。另外根據b)，TIUC蛋白與A549細胞的細胞質新鮮粗提液在37°C孵育I小時能將其完全去泛素作用，但是在含有IOmM的DUBs酶抑制劑N-順丁烯二醯亞胺的細胞質新鮮粗提液中相同條件下孵育沒有出現mCherry蛋白大小的條帶，這說明去泛素作用被完全抑制。這就進一步說明了 TIUC蛋白的去泛素作用是來自於DUBs酶專一性酶切作用。對c)進行灰度值分析，結果顯示融合蛋白進入細胞24小時內能被細胞質中的DUBs酶 完全去泛素；當蛋白進入細胞12小時後有87.36 土4.85%被去泛素。同時分別對a)泳道3-4和8-9進行灰度值分析，結果TIUC蛋白在A549細胞中被去泛素率為65.75±5.26%(p<0.001, Tukey - Kramer)，但是缺失了內體逃離增強子INF7的TUC融合蛋白的去泛素率只有32.01 ±2.56%;相似地是，TIUC蛋白在HCTl 16細胞中被去泛素率為60.14±5.30%，但是TUC蛋白的去泛素率只有28.10±2.25%。根據結果得出內體逃離增強子INF7能使TAT逃離內體的能力增強到大約原來的兩倍。因此，該蛋白載藥系統能高效轉載蛋白進入細胞質。實施例2.基於蛋白載藥系統轉載的多肽誘導細胞凋亡蛋白載藥系統轉載Bak_BH3多肽表達載體的構建首先，將編碼TAT，INF7，泛素及Bak_BH3多肽的核酸序列通過PCR擴增，其利用含有NdeI位點和編碼聚組氨酸標記序列的5』引物，以及帶有終止密碼子TGA和XhoI位點的3』引物。其次，PCR產物從NdeI和XhoI位點之間克隆到表達載體pRSETb中。其他對照表達載體同樣以類似方法克隆到表達載體PRSETb的NdeI和XhoI位點之間(圖7)。蛋白載藥系統轉載Bak_BH3多肽及對照蛋白的表達與純化首先，將表達質粒轉化入表達菌株E.coli BL21(DE3)中；從轉化的平板上挑選單菌落接種到含氨苄抗性的5ml LB液體培養基中培養過夜，然後取Iml過夜培養的菌液轉接到含氨苄抗性的IOOml LB液體培養基中，370C，180rpm培養到菌液0D_值在0.6左右；接著添加誘導劑IPTG至終濃度0.5mM, 25°C誘導10小時；誘導表達結束後，4°C，7000g離心15分鐘收集菌體，取部分菌體檢測蛋白誘導表達情況(圖8);接著按照實施例1中的方法純化蛋白。蛋白載藥系統轉載Bak_BH3多肽誘導細胞凋亡的檢測首先，將A549細胞與TIU-BH3蛋白孵育24小時，然後用含血清的培養基漂洗細胞一次，接著進行凋亡試劑盒進行染色，在免疫螢光顯微鏡下觀察(圖9);接著，將A549細胞分別與TIU-BH3，T1-BH3, Tat_BH3和TIU融合蛋白孵育24小時，然後用含血清的培養基漂洗細胞一次，收集細胞，接著進行凋亡試劑盒進行染色，利用流式細胞儀進行凋亡檢測(圖10)。根據圖10分析，與TIU蛋白孵育組和對照組相比，孵育Tat-BH3融合蛋白的A549細胞出現20.45±2.89%的凋亡(ρ〈0.001，Tukey - Kramer);但是，孵育TIU-BH3融合蛋白的A549細胞出現的凋亡率升高到46.15±4.86%。同時，當A549細胞與10 μ M和20 μ M的TIU-BH3融合蛋白孵育，其凋亡率呈劑量依賴型模式。由於基於TAT轉運的Tat-BH3融合蛋白，在進入細胞過程中大部分的融合蛋白困在內體，隨後胞內的溶酶體中的蛋白酶消化，抑制了 Tat-BH3融合蛋白的生物活性的發揮；而基於TIU的融合蛋白中的內體逃離增強子INF7增強了 TIU-BH3從內體逃離進入細胞質的能力，使大部分的BH3多肽發揮出生物學功倉泛。當T1-BH3融合蛋白與A549細胞孵育時，相比於TIU-BH3融合蛋白，細胞凋亡率稍微有下降(p〈0.05)。由於TAT具有核定位作用，而T1-BH3融合蛋白中的BH3多肽不會與TAT分離，並且BH3多肽的目標分子都在細胞質中，因此TAT的核定位作用限制了 BH3多肽的生物功能。因此，認為蛋白載藥系統與TAT相比提高了轉運效率，進而促進了 BH3多肽誘導A549細胞凋亡。以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對於本技術領域的普通技術人員，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護 範圍。
權利要求
1.一種增強多肽藥物從細胞內體逃離的蛋白載藥系統，其特徵在於，包括細胞穿膜肽TAT,內體逃離增強子INF7，泛素蛋白和多肽藥物，所述TAT，INF7，泛素蛋白和多肽藥物依次連接。
2.根據權利要求1所述的一種增強多肽藥物從細胞內體逃離的蛋白載藥系統，其特徵在於，所述多肽藥物包括Bak BH3多肽，Survivin生存素及其變體和WlO多肽中的一種或幾種。
3.根據權利要求1所述的一種增強多肽藥物從細胞內體逃離的蛋白載藥系統，其特徵在於，所述泛素蛋白來源於人。
4.編碼權利要求1所述增強多肽藥物從細胞內體逃離的蛋白載藥系統的核酸，其序列如 SEQ ID N0.1 所示。
5.含有權利要求4所述核酸序列的表達質粒構建體。
6.權利要求1所述增強多肽藥物從細胞內體逃離的蛋白載藥系統在運載藥物中的應用，其特徵在於， 所述載藥系統增強多肽藥物從細胞內體逃離。
全文摘要
本發明公開一種增強多肽藥物從細胞內體逃離的蛋白載藥系統及其應用，包括細胞穿膜肽TAT，內體逃離增強子INF7，泛素蛋白和多肽藥物，所述TAT，INF7，泛素蛋白和多肽藥物依次連接。通過含有多個功能域的蛋白載藥系統來增強多肽藥物從細胞內體中釋放，提高TAT轉運多肽藥物的效率,使藥物快速從內體中釋放，進而促進其藥效充分地發揮。
文檔編號C12N15/63GK103230599SQ20131017835
公開日2013年8月7日 申請日期2013年5月14日 優先權日2013年5月14日
發明者馬興元, 林南靜, 鄭文雲, 李林鳳, 劉蕙 申請人:華東理工大學