利用微球中回音廊模式的生物傳感器的製作方法

2023-07-20 14:32:26

專利名稱：利用微球中回音廊模式的生物傳感器的製作方法
技術領域：
本發明總的涉及分析物檢測領域。更具體地，本發明涉及利用通過分析物結合顆粒上固定的結合配偶體而誘導的微球顆粒的回音廊模式(WGM)分布型的變化來檢測分析物的存在。本發明進一步涉及複合方案和通過WGM分布型變化檢測的分析物。
背景技術：
本說明書中提供的參考文獻的書目詳述列於說明書的結尾。
本說明書中對任何現有技術的參考不是並且不應該視為在對任何國家中該現有技術形成公知常識部分的認可或任何提示的形式。
基因組學和蛋白質組學的快速發展已突出了用於檢驗和檢測兩種分子之間相互作用的傳統勞動密集型方法的不適當。有必要設計用於不同分子之間相互作用的分析和樣本中分析物檢測的高度敏感的方法。使所述分析不需要標記一種或其他或兩種分析物和/或其結合配偶體的方法的開發將是特別理想的。
目前，利用固定至載玻片的寡核苷酸陣列的基因-晶片提供了高通量核酸分析的方法。然而，該技術依賴於至少一種分子的標記。
嘗試開發用於檢驗分子相互作用的方法和裝置(其不依賴標記一種或多種分子)包括生物傳感器，其基於光學方法最常用於檢驗DNA和/或蛋白質。參見例如，Baird和Myszka，J Mol Recognit 14261-268，2001，Rich和Myszka，J Mol Recognit 15352-376，2002，Li等.Science 299840-843，2003以及Lin等.Science 278840-843，1997，其描述了包括幹涉量度裝置的光學方法。Malmqvist，Nature 361186-187，1993公開了表面胞質團共振傳感器(SPR)。SPR檢測＜10pg.mm-2質量負荷的極限(Karlsson和Stahlberg，AnalBiochem 228274-280，1995)並且允許生物分子相互作用的實時檢測。然而，SPR需要特定的和昂貴的測試設備以及用於多路測量的能力是有限的。
本發明提供尤其用於分析物和其結合配偶體之間相互作用的檢測而無需任何一種分子標記的試劑和方法。

發明內容
本發明提供尤其用於檢測樣本中分子的方法和試劑。這些分子在此指分析物。分析物的存在或結構不必已知並且因此本方法可理想地用於檢測孤受體至今未知的結合配偶體以及核酸表達或蛋白質包括酶活性、摺疊、抗原性或功能的潛在調節劑。本發明的方法在某種程度上基於包埋於微球顆粒內或之上的光學可檢測標記物顯示特有的回音廊模式(WGM)特徵的現象。對「光學可檢測的」的引用包括對通過光譜測定方法的檢測的引用。當靶分析物與固定至微球顆粒的結合配偶體相互作用時，WGM分布型變化能進行即使十分罕見的結合事件很敏感的檢測。
WGM僅允許確定波長的光從顆粒發射。該現象的結果為例如來自螢光團的常見寬發射(10-100nm寬)波段受限制並且作為有效對應顆粒內光不變模式圖形的一系列尖銳峰而出現。根據本發明，已確定WGM分布型對微球顆粒表面的變化高度敏感並且當微球顆粒與其環境內的分析物或分子相互作用時WGM分布型改變。
因此，本發明的一個方面涉及檢測分析物的方法，所述方法包括將至少一組微球顆粒與推定包含所述分析物的樣本接觸，其中一組微球顆粒內的每一顆粒包括光學可檢測的標記物以及固定的所述分析物的假定結合配偶體，其中每一顆粒組具有確定的回音廊模式(WGM)特徵，其中所述分析物與所述固定結合配偶體的結合引起所述至少一組微球顆粒WGM分布型的變化，其為所述分析物存在的指示。
本發明的方法可應用於檢測微顆粒WGM分布型的調整，其中所述調整由樣本中分子與固定至微球顆粒表面的潛在結合顆粒的結合或其他締合的檢測而產生。基於WGM分布型靈敏變化的分析物和其結合配偶體之間結合反應的檢測能鑑定和分離分析物。
本發明的特徵為微球顆粒可用各種各樣的光源激發，利於許多不同WGM分布型的測量。
「光學可檢測標記物」可以是任何分子、原子或離子，其發射螢光、磷光和/或白熱。在本發明的一個優選實施方案中，光學可檢測標記物為螢光團，其可包括許多光學可檢測的標記物如化學螢光團和染料以及量子點。
本發明還提供如此處所述固定至固相支持物的微球顆粒，例如固相支持物可包括顯微鏡載玻片。
在一具體的實施方案中，本發明提供包含乳膠或二氧化矽顆粒的微球顆粒，其為1μm至100μm直徑，用光學可檢測標記物，如螢光團或量子點標記，該顆粒進一步包括所檢測分析物假定的結合配偶體。光學可檢測標記物在可見波長處為可檢測的並且微球顆粒呈現一種或多種WGM分布型。當分析物與顆粒上固定的結合配偶體相互作用時可檢測地調整了微球顆粒的一種或多種WGM分布型。WGM分布型的任何所述變化為已結合其結合配偶體的分析物存在的指示。
分析物和結合配偶體的實例包括化學分子、核酸分子、蛋白質、脂類、脂肪酸和碳水化合物。
本發明的主題方法不需要分析物存在、出現或結構的任何認識。例如，如果想發現與酶或酶的催化部位相互作用或位於或靠近酶或蛋白質抗原表位的分子(即分析物)，則本方法不需要知道所述分析物是否存在。在那種情況下，微球顆粒將攜帶在其表面上或附近的靶結合配偶體並且WGM分布型的變化用於檢測與靶結合配偶體相互作用的樣本如組合文庫、化學文庫或天然產物來源(例如環境樣本、血清、血漿或生物提取物)中的分析物。
本發明通過引入多組微球顆粒而能多路進行，其中每組包括不同尺寸和/或用不同螢光染料標記和/或不同靶結合配偶體的顆粒。
本發明進一步提供通過本方法和可用於實踐本方法的試劑盒鑑定的分析物。
貫穿本說明書，除非上下文另外需要，單詞「包含」或變體如「包括」或「含有」將理解為包括所述的要素或整體或要素組或整體組而不排除任何其他的要素或整體或要素組或整體組。
表1中提供此處所用的簡寫表。
表1-簡寫



圖1為顯示用於產生量子點標記的微球顆粒方法簡圖的圖示。
圖2為顯示呈現二氧化矽微球顆粒半徑極小的變化引起計算的微球顆粒WGM分布型清晰變化的計算曲線的圖示。
圖3為顯示包含量子點(QD)光學可檢測標記物的微球顆粒的圖示，其呈現清晰的特有螢光和確定的WGM分布型。
圖4為顯示當生物聚合物單層被吸附至微球顆粒時呈現觀察到的微球顆粒WGM分布型轉變的實驗光譜的圖示。QD＝無塗層微球顆粒的量子點對照；PSS＝具有吸附的聚苯乙烯磺酸鹽(PSS)單層的微球顆粒；PVP＝具有吸附的聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)單層的微球顆粒。
圖5為WGM分布型的圖示(a)DNA作為48-聚體偶聯至Q-Sand顆粒；(b)Q-Sand珠雜交Transprobe DNA，Transprobe的反向補體；和(c)Q-Sand珠雜交PCR產物。
優選實施方案的詳述本發明提供尤其用於檢測此處稱為能參加與稱為其結合配偶體的另一個分子結合作用的分析物的分子的方法，該結合配偶體固定至用光學可檢測標記物(其提供顆粒確定的WGM分布型)標記的微球顆粒表面。對「光學可檢測的」的引用包括對通過光譜測定方法的檢測的引用。分析物和結合配偶體之間的相互作用產生WGM分布型的變化。此處所述的方法可用於檢測樣本中的分析物和分析物之間的相互作用。重要的是，分析物和其結合配偶體均不需要標記物。該相互作用誘導微球顆粒的WGM分布型變化。本發明的方法在某種程度上以包埋在微球顆粒內或其上的螢光發射體產生確定的WGM分布型的現象為基礎。微球顆粒可由各種各樣的光源激發。此利於許多不同構型的測量並且利於多路復用。
WGM僅允許確定波長的光從顆粒發射。該現象的結果為來自螢光團的常見寬發射(10-100nm寬)波段受限制並且作為有效對應顆粒內光不變模式圖形的一系列尖銳峰而出現。
WGM分布型對與微球顆粒表面的相互作用或締合高度敏感。因此，由於WGM分布型的變化可檢測甚至十分罕見的結合事件。
除非另有說明，將理解本發明不限於具體的微球顆粒製劑、生產方法、診斷或測定方案等等，因為所述可以改變。還應理解此處所用的術語僅用於描述具體的實施方案而不試圖限制。對「分析物」和「結合配偶體」的引用不應推斷為分析物結構的任何知識為已知的或要求為已知的。
必須指出，除非上下文已另有規定，如本說明書中所用的，單數形式「一」、「一個」和「這個」包括複數方面。因此例如，「峰」或「特徵」的引用包括單個峰或特徵以及兩個或更多峰或特徵；「微球顆粒」包括單個顆粒以及兩個或更多顆粒等等。
在一個方面，本發明涉及檢測分析物的方法，所述方法包括將至少一組微球顆粒與推定包含所述分析物的樣本接觸，其中一組微球顆粒內的每一顆粒包括光學可檢測的標記物以及固定的所述分析物的假定結合配偶體，其中每一顆粒組具有確定的回音廊模式(WGM)特徵，其中所述分析物結合所述固定的結合配偶體引起所述至少一組微球顆粒WGM分布型的變化，其為所述分析物存在的指示。
本發明涉及的「微球顆粒」包括含任何材料，同質的或可基於其光學可檢測標記物產生一種或多種WGM分布型的顆粒。如對本領域技術人員顯而易見的，幾乎任何材料，同質的或不同的材料可用於該微球顆粒。此處涉及的微球顆粒還可包含一種以上物質，並且可包含殼、合金或有機和/或無機物的混合物。如果微球顆粒包含具有各向同性折射率的基本上同質的材料並且其還為不吸收的(而不是光學可檢測標記物，其如下進一步描述)，則有利於通過本發明方法產生的數據的定量。
可用於本發明並且代表本發明具體實施方案的尤其有用的材料包括選自下列的材料二氧化矽(例如石英或玻璃)、乳膠、二氧化鈦、二氧化錫、氧化釔、礬土和其他二元金屬氧化物(如ZnO)、鈣鈦礦和其他壓電金屬氧化物(如BaTiO3)、ZnS、蔗糖、瓊脂糖和其他聚合珠。在特別優選的實施方案中，「顆粒」和/或「微球顆粒」包含二氧化矽。
此外，本發明涉及的顆粒可以任何適當的規則或不規則3-維形狀產生。然而，雖然許多材料的形狀可維持WGM分布型，實際上通常合成小球體或類球形顆粒。所述球體或類球形顆粒在此也稱為「微球顆粒」或「微球體」。因此，在本發明的優選實施方案中，本發明的「顆粒」和「微球顆粒」基本上為球形的或類球狀的或包含「微球體」。
雖然本發明的顆粒可稱為「微球」，但微球顆粒的實際尺寸取決於各種因素並且顆粒事實上可能或可能不包括測微計範圍的度量單位。在一個優選實施方案中，本發明的微球顆粒包括約1μm至約100μm的直徑(或非-球形顆粒的同等尺寸)，包括1μm、2μm、3μm、4μm、5μm、6μm、7μm、8μm、9μm、10μm、11μm、12μm、13μm、14μm、15μm、16μm、17μm、18μm、19μm、20μm、21μm、22μm、23μm、24μm、25μm、26μm、27μm、28μm、29μm、30μm、31μm、32μm、33μm、34μm、35μm、36μm、37μm、38μm、39μm、40μm、41μm、42μm、43μm、44μm、45μm、46μm、47μm、48μm、49μm、50μm、51μm、52μm、53μm、54μm、55μm、56μm、57μm、58μm、59μm、60μm、61μm、62μm、63μm、64μm、65μm、66μm、67μm、68μm、69μm、70μm、71μm、72μm、73μm、74μm、75μm、76μm、77μm、78μm、79μm、80μm、81μm、82μm、83μm、84μm、85μm、86μm、87μm、88μm、89μm、90μm、91μm、92μm、93μm、94μm、95μm、96μm、97μm、98μm、99μm和100μm。這些微球尺寸的引用包括整數的分數。例如，1μm和2μm之間包括1.05、1.1、1.15、1.2、1.25、1.3、1.35、1.4、1.45、1.5、1.55、1.6、1.65、1.7、1.75、1.8、1.85、1.9、195或2.0。
具體的實施方案中，微球顆粒為微球體。
包含一組微球體的一組微球顆粒包括具有共同標記物或尺寸或固定的結合配偶體的多樣(即兩種或多種)顆粒或微球體。
如此處所用的，術語「光學可檢測標記物」指任何分子、原子或離子，其發射螢光、磷光和/或白熱。可選擇光學可檢測標記物以任何可很容易地分辯WGM分布型的波長發射。此取決於發射波長與顆粒半徑的比率。假定球體半徑為任意的，發射可適當地選自紫外線(約350nm至約3nm波長範圍)、可見光(約350nm至約800nm波長範圍)、近紅外線(NIR)(約800nm至約1500nm波長範圍)和/或紅外線(IR)(約1500nm至約10μm波長範圍)的範圍。然而，由於檢測的容易程度，尤其在一個優選實施方案中，該光學可檢測標記物在可見波長範圍中為可檢測的。
在一個具體的實施方案中，該光學可檢測標記物可以是響應紅外激發發射可見光輻射的光學可檢測標記物。所述光學可檢測標記物在此也稱為「上轉換器」。
因此，本發明的另一個方面提供檢測分析物的方法，所述方法包括將至少一組微球形顆粒與推定包含所述分析物的樣本接觸，其中一組微球形顆粒內的每一顆粒包括具有響應紅外激發而發射可見輻射的標記物以及固定的所述分析物的假定結合配偶體，其中每一顆粒組具有確定的回音廊模式(WGM)特徵，其中所述分析物結合所述固定的結合配偶體引起所述至少一組微球顆粒WGM分布型的變化，其為所述分析物存在的指示。
光學可檢測標記物的唯一限制為所選的標記物中的發射應產生空腔諧振模式發射。
本發明另外的實施方案中，該光學可檢測標記物包括選自螢光團、半導體顆粒、磷顆粒、摻雜顆粒或納米晶體和量子點的一種或多種標記物。此外，來自小金屬顆粒的散射光(表面胞質團發射)可用作光學可檢測標記物。
因此，本發明進一步的方面涉及檢測分析物的方法，所述方法包括將至少一組微球顆粒與推定包含所述分析物的樣本接觸，其中一組微球顆粒內的每一顆粒包括選自螢光團、半導體顆粒、磷顆粒、摻雜顆粒或納米晶體和量子點的光學可檢測標記物以及固定的所述分析物的假定結合配偶體，其中每一顆粒組具有確定的回音廊模式(WGM)特徵，其中所述分析物結合所述固定的結合配偶體引起所述至少一組微球顆粒的WGM分布型的變化，其為所述分析物存在的指示。
本發明的另一實施方案中，該光學可檢測標記物為螢光團。如此處所用的，術語「螢光團」指呈現螢光特徵的任何分子。為此，術語「螢光」可定義為分子吸收特定波長光並且再發射更長波長光的特徵。波長的改變與該過程中發生的能量損失有關。術語「螢光團」可包括多種光學可檢測標記物如化學螢光團和染料以及量子點。
在具體的實施方案中，本發明提供檢測分析物的方法，所述方法包括將至少一組微球顆粒與推定包含所述分析物的樣本接觸，其中一組微球顆粒內的每一顆粒包括量子點形式的螢光團以及固定的所述分析物的假定結合配偶體，其中每一顆粒組具有確定的回音廊模式(WGM)特徵，其中所述分析物結合所述固定的結合配偶體引起所述至少一組微球顆粒的WGM分布型的變化，其為所述分析物存在的指示。
可用於本發明的一種特別方便的光學可檢測標記物是將螢光顆粒包埋於微球顆粒上或中。這些光學可檢測標記物顆粒可以小至其特徵和發射變成尺寸依賴性的。如此小的光學可檢測標記物顆粒在本領域稱為半導體納米顆粒、量子點、量子線、量子棒或納米晶體或Q粒。然而如此處所用的，術語「量子點」或「QD」應理解為包括所有這樣的顆粒。此外，包括QD的光學可檢測標記物可包括近似球形或類球形的顆粒，或塗布的球形或類球形顆粒。然而，術語QD不應以任何方式認為限於球狀的、類球狀的、圓形的、圓柱的或「點」的任何其他形態。例如如此處所用的，QD還可包括其他的形態，尤其包括棒-樣、橢圓體的或塗布的棒-樣或橢圓體的顆粒。
QD包括半導體材料的納米比例的結晶核；生物學活性形式通常由防護殼和外塗層包圍。例如，QD可包括半導體微晶，其為約2nm至約30nm直徑(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30nm)並且可包含晶體內大約50-500,000個原子，包括發光晶體，所述發光晶體包括如ZnS、ZnSe、ZnTe、CdS、CdSe、CdTe、PbS、PbSe、PbTe、HgS、HgSe、HgTe、Si、ZnO的材料。
QD發出具有寬吸收光譜和窄發射光譜的螢光。不同於具有不同吸收光譜的其它螢光團，QD吸收超過寬光譜段的光，其允許量子點受多種光源，如雷射、弧光燈或LED的激發。此外，許多不同的QD的集合可用於僅利用單個激發光源的多路應用。然而，每個點的發射光譜通常非常窄，約為30nm量級，準確的顏色取決於顆粒的直徑和組成。此外，QD的窄發射光譜允許相鄰點的光譜解析度。除以上好處外，QD還相對耐光，甚至在強激發期間，並且比螢光團更亮。
根據上述，還應理解的是本發明包括使用不同尺寸QD以優化波長，在該波長可在微球顆粒中產生WGM分布型。
此外，本發明涉及用方法如熱處理、表面改性、合金、表面鈍化或用表面塗層加蓋處理而使QD能發射高量子產量並且長期改善光穩定性的QD。
QD也可從公司如Quantum Dot Corp.(QDC)購得，其生產QD如Qdot[商標]605鏈親和素共軛物，包含在605nm發射的鎘-硒化物核。還可得到在525、565、585和655nm發射的Qdot共軛物。然而，應理解本發明不以任何方式受QD的具體組成(或任何其他光學可檢測標記物)的限制並且任何QD(商品化的或另外的)可適於本發明。
還存在本領域可用的許多螢光染料，其可根據本發明用作螢光團。確定螢光染料或其他螢光團使用潛力的重要性質為螢光團的激發波長；其必須匹配光源的有效波長。然而，許多不同的螢光染料和其他螢光團對本領域技術人員來說是熟知的，並且對螢光標誌物的選擇決不限制本發明。
可用於微球顆粒標記的方便的「螢光團」包括任何螢光標誌物，其可利用選自以下的光源激發(i)氬離子雷射器-包括藍色，488nm系，其適於在綠色至紅色區域中發螢光的許多染料和螢光染料的激發。在波長範圍(其中458nm、488nm、496nm、515nm)發射的可調氬雷射器也是可用的。
(ii)二極體雷射器-具有635nm的發射波長。現有的其他二極體雷射器在532nm運行。該波長最佳地激發碘化丙錠(PI)。發射約476nm光的藍色二極體雷射器也是可用的。可方便地運用所述二極體雷射器在微球顆粒內激發WGM。
(iii)HeNe氣體雷射器-以紅色633nm系運行。可方便地運用所述雷射器在微球顆粒內激發WGM。
(iv)HeCd雷射器-在325nm運行。可方便地運用所述雷射器在微球顆粒內激發WGM。
(v)100W汞弧燈-用於UV染料如Hoechst和DAPI激發的最有效光源。
(vi)Xe弧光燈和石英滷素燈同樣可用作激發WGM並且因此利用顆粒作為傳感器的設備。
本發明具體的實施方案中，螢光標記物選自Alexa Fluor染料；BoDipy染料，包括BoDipy 630/650和BoDipy 650/665；Cy染料，尤其是Cy3、Cy5和Cy 5.5；6-FAM(螢光素)；螢光素dT；六氯螢光素(HEX)；6-羧基-4』，5』-二氯-2』，7』-二甲氧基螢光素(JOE)；Oregon綠染料，包括488-X和514；若丹明染料，包括若丹明綠、若丹明紅和ROX；羧基四甲基若丹明(TAMRA)；四氯螢光素(TET)；以及Texas紅。兩種染色技術通常用於螢光標記微球顆粒的內部染色和外部染色(表面-標記)。這兩種技術產生具有獨特性質的顆粒，每種有利於不同的應用。內部染色產生具有通常窄螢光發射的非常穩定的顆粒。這些顆粒常常呈現對光漂白更大的抗性。由於螢光團位於珠內部，表面基團可有效用於共軛配體(蛋白質、抗體、核酸等等)至珠表面。為此，內部標記的珠通常用於分析物-檢測和免疫測定應用。表面-標記包括螢光團共軛至微球顆粒表面。由於螢光團位於顆粒表面上，其能與其環境相互作用就像螢光團位於染色的細胞上一樣。結果為標準顆粒，其在各種不同條件如汙染物存在或pH改變下呈現如染色的細胞樣本一樣的激發和發射性質。表面-標記顆粒的「環境響應」性質使得其非常適於模擬生物樣本。外部標記的顆粒常常在許多利用螢光檢測的應用中用作對照和標準。然而，本發明涉及顆粒與螢光標記物通過任何方法的締合。
術語「磷光顆粒」、「磷顆粒」和「磷光體」在此可互換使用。本領域技術人員很容易理解什麼組成磷光光學可檢測標記物。然而作為舉例而決不限制本發明，合適的磷光體包括ZnS、ZnS:Cu、Eu氧化物和顯示設備中所用的其他磷光體的小顆粒。
包括「摻雜顆粒」的光學可檢測標記物可包括具有一種或多種稀土離子，如Eu、Y、Yb、Sm等等封閉量的顆粒。
如此處所用的，術語「光學可檢測標記物」應理解為還包括多個光學可檢測標記物、光學可檢測標記物的混合物、塗布的納米晶體、合金和其他的複雜混合物，其對於技術人員來說是顯而易見的。微球顆粒上所有所述光學可檢測標記物的用途被認為在此處所述方法和試劑的範圍內。
根據本發明，已表明任何具體標記物的發射取決於該標記物在微球顆粒中的分布，標記物的類型和標記物的濃度。然而，本發明的方法仍然可實行而不管光學可檢測標記物是否在微球顆粒表面、作為殼存在於微球顆粒內、位於微球顆粒的核或存在於一種以上的所述部位。
應當指出本發明的方法並不基於來自光學可檢測標記物發射的猝滅。然而本發明的方法在某種程度上基於作為分析物與固定至微球顆粒表面的結合配偶體相互作用或締合結果的光學可檢測標記物WGM分布型的調製(即改變)。
WGM，當用電磁輻射處理時為電磁諧振，其可在入射光與比其周圍介質具有更高折射率的顆粒相互作用時產生。對於給定的粒徑，WGM在特定的光共振波長出現，並且WGM的性質可尤其隨著包含WGM的顆粒的尺寸和顆粒以及周圍介質的折射率而改變。此外，顆粒的尺寸還可影響其中產生的WGM。當入射光在顆粒表面經歷全內反射時產生WGM。
全內反射(TIR)可在兩種非吸收性介質之間的界面處存在。當高折射率介質中傳播的一束光以超過臨界角的入射角接觸較低折射率介質的界面時，光在該界面全反射並且傳播返回高折射率介質。如對本領域技術人員顯而易見的，3-維介質中光可在高折射率顆粒內多次反射。WGM中，光集中接近顆粒周邊並且可為指定的模數和模式階次。模數n提供顆粒周邊的波長數目，而模式階次1提供顆粒內電磁場半徑依賴性的最大數目。
如此處規定的，包埋於顆粒上或內的螢光發射體呈現確定的WGM分布型。這些模式僅允許確定波長的光自顆粒發射。該現象的結果是光學可檢測標記物通常相對寬的發射光譜(例如，螢光團通常以10-100hm寬)受限制並且作為有效對應顆粒內光不變模式圖形的一系列尖銳「峰」而出現。作為本發明微球顆粒內WGM建立結果而產生的一系列峰在此稱為「回音廊模式分布型」或「WGM分布型」。
WGM分布型對包埋的光學可檢測標記物的位置及其濃度以及相互間的立體構型高度敏感。此外，在確定WGM分布型中所見的發射波長中粒徑和折射率同樣重要。
提示WGM分布型中一個或多個峰的位置和振輻可受微球顆粒與樣本或外界環境中分子的相互作用或締合的強烈影響。
在一個實例中，分子與微球顆粒的締合或結合改變微球顆粒的有效折射率，從而改變由微球顆粒產生的WGM分布型。
術語「折射率」可很容易由本領域技術人員所理解。簡而言之，介質的折射率為根據在真空中與在更大密度的第二種介質中光速的比率計算的值。在微球顆粒情況下，「有效折射率」的變化可以是全部微球顆粒的折射率變化，或者有效折射率的變化可以是微球顆粒的區域或部分的折射率的變化。例如微球顆粒的有效折射率的變化可包括微球顆粒表面和/或外周部折射率的改變。
在一個具體的實施方案中，本發明涉及用於檢測分子結合或締合至或者接近微球顆粒表面或亞-表面的方法，其中該分子與該分子固定的結合配偶體的結合或締合影響該微球顆粒表面有效折射率的改變。
「亞-表面」包括顆粒周圍的袋或孔或其在顆粒的內部環境和外部環境之間形成共-連續的界面。
在又一個方面，本發明涉及本發明的方法用於檢測微球顆粒形態、形狀或尺寸改變的應用，其中該微球顆粒包含用光學可檢測標記物標記的顆粒並且攜帶固定至該顆粒表面或亞-表面的分子，其中所述微球顆粒呈現一種或多種WGM分布型，並且其中基於所述微球顆粒標記物的一種或多種WGM分布型隨著分析物與固定的分子相互作用時微球顆粒形態、形狀或尺寸的變化的可檢測地改變；該方法包括(i)確定微球顆粒原始的WGM分布型；(ii)在分析物和固定的分子之間潛在的相互作用之後，使微球顆粒經歷假定的微球顆粒形態、形狀或尺寸的改變；(iii)確定微球顆粒一種或多種隨後的WGM分布型；其中相對原始的WGM分布型，微球顆粒的一種或多種隨後的WGM分布型的調製為微球顆粒的形態、形狀或尺寸的改變以及與固定的分子結合的分析物存在的指示。
如此處所指的微球顆粒的「形態、形狀或尺寸」指微球顆粒的空間尺寸。因此，微球顆粒形態、形狀或尺寸的改變包括微球顆粒任何空間尺寸的改變，包括但不限於高度、寬度、深度、半徑、直徑、周長等等的改變。
又一個方面中，本發明涉及包含用光學可檢測標記物標記的顆粒的微球顆粒，其中該微球顆粒呈現WGM分布型並且其中該微球顆粒的WGM分布型在分析物與固定至所述微球顆粒的分子相互作用時可檢測地調製。
如此處所用的，分子或固定至微球顆粒的結合配偶體或樣本中的分析物指任何化學體。所述化學體包括但不限於，小的化學分子；肽、多肽和蛋白質或其類似物、核酸分子或其類似物、金屬原子或離子或包含所述原子或離子的化合物。對於核酸分子，尤其涉及短的幹擾RNA(單或雙鏈)[siRNA]、幹擾RNA複合物(RNAi)和DNA以及RNA寡核苷酸。化合物包括組合文庫或化學文庫中產生的實體。此外，從生物源進行天然產物的篩選。其他來源中，提及的生物源包括環境樣本、生物提取物、植物或動物提取物、血清、尿、排洩物、精子、血漿、土壤樣本、河流或密封樣本、地球外樣本。
如此處所用的短語「結合，或與...締合」指分子與微球顆粒關聯的任何過程。介導所述關聯的例證性方式可包括但不限於共價鍵、氫鍵作用、範德華力、離子鍵、金屬鍵、極性鍵和配價鍵(共價的)等等。
包括結合配偶體的分子還可通過促進或提高該分子吸附或結合至該微球顆粒表面的試劑附著於微球顆粒，所述試劑在此稱為「接頭」。例如，多核苷酸可通過包含巰基、胺或羧基的接頭與微球顆粒連接。合適接頭的實例包括氨基-末端的矽烷如氨基-丙基三甲氧基矽烷或氨基-丙基三乙氧基矽烷。除矽烷外，化合物如非-共價附著於如玻璃表面和靜電吸附多核苷酸的磷酸基的聚L-賴氨酸也在本發明的範圍內。因此，適於促進多核苷酸、多肽或其他化合物結合或連接至微球顆粒表面的其他分子，包括其他的矽烷可由技術人員很容易地鑑定，並且本發明不受接頭選擇的限制。
在一實施方案中，本發明涉及包含用光學可檢測標記物標記的顆粒的微球顆粒，其中該微球顆粒呈現WGM分布型並且其中該微球顆粒的WGM分布型在分子例如通過包含結合至或與微球顆粒表面連接的核酸分子的分子與微球顆粒結合或連接時可檢測地調製。
如本領域技術人員很容易理解的，術語「核酸」、「核苷酸」和「多核苷酸」包括RNA、cDNA、基因組DNA、合成形式和混合的聚合物，正義鏈和反義鏈，並且可經化學或生物化學修飾或可包含非天然的或衍生的核苷酸鹼基。所述修飾包括例如，標記、甲基化、一種或多種天然存在的核苷酸用類似物(如嗎啉環)的取代、核苷酸內修飾如不帶電的鍵(如膦酸甲酯、磷酸三酯、磷酸醯胺、氨基甲酸鹽等等)、帶電荷的鍵(如硫代磷酯、二硫代磷酸酯等等)、懸掛部分(如多肽)、嵌入劑(如吖啶、補骨脂素等等)、螯合劑、烷化劑和修飾的鍵(如α-異頭核酸等等)。還包括模擬能通過氫鍵作用和其他的化學相互作用結合指定序列的多核苷酸的合成分子。所述分子在本領域已知並且包括例如，該分子主鏈中肽鍵以磷酸鹽鍵代替的那些。
本發明的另一個實施方案涉及如以上所述的微球顆粒，其中該微球顆粒進一步包括結合至或與微球顆粒連接的DNA。
本發明的還一個優選實施方案涉及如上所述的微球顆粒，其中該微球顆粒進一步包括結合至或與微球顆粒表面連接的RNA或RNA複合物(例如RNA-Rnase複合物)。
在可選擇的實施方案中，本發明涉及包含用光學可檢測標記物標記的顆粒的微球顆粒，其中該微球顆粒呈現WGM分布型並且其中該微球顆粒的WGM分布型在肽、多肽或蛋白質或其類似物結合至或與微球顆粒表面連接時可檢測地調製。
在一實施方案中，肽、多肽或蛋白質為酶。
在另一實施方案中，肽、多肽或蛋白質為抗體。
術語「抗體」指能與抗原結合、互相作用或締合的免疫球蛋白家族的蛋白質。因此抗體為抗原-結合分子。術語「抗原」在此以其廣義使用，指能與抗體的抗原結合部位反應或結合的物質。根據本發明，抗原還包括抗體的個體基因型。
術語「免疫球蛋白」在此用於指由基本上由免疫球蛋白基因編碼的一種或多種多肽組成的蛋白質。公認的免疫球蛋白分子包括κ、λ、α、γ(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、δ、ε、和μ恆定區、輕鏈(κ和1)，以及無數的免疫球蛋白可變區。免疫球蛋白的一種形式組成抗體的基本結構單元。該形式為四聚物並且由兩個免疫球蛋白鏈的相同對組成，每對具有一條輕鏈和一條重鏈。每對中，輕和重鏈可變區共同負責結合抗原，而恆定區負責抗體效應物功能。除抗體外，免疫球蛋白可以各種其他形式存在，包括例如，Fv、Fab、Fab』和(Fab』)2和嵌合抗體並且所有這些變體由此處所用的術語「抗體」所包括。此外，來自其他動物(如禽類、哺乳動物、魚、兩棲動物和爬行動物)的免疫球蛋白具有類似的功能，但具有不同的命名並且這些也認為是「抗體」。
本發明還涉及包含結合至或與此締合的抗-個體基因型抗體的微球顆粒。如此處所用的，術語「抗-個體基因型抗體」指識別和結合靶抗體可變區內，例如VH和/或VL結構域的抗原決定簇的抗體。這些抗體可變區內的抗原決定簇被稱為抗體的「個體基因型」。因此，這些區域的特異性抗體稱為「抗-個體基因型抗體」。
在此提及的肽、多肽和/或蛋白質的「類似物」包括但不限於包含側鏈修飾的肽、多肽或蛋白質，在合成和利用交聯劑和其他方法對肽、多肽或蛋白質強行構象限制期間引入非天然胺基酸的合成肽和/或其衍生物。
側鏈修飾的實例包括氨基的修飾，例如通過與醛反應隨後由NaBH4還原的還原性烷基化作用；用甲基亞氨逐乙酸酯(methylacetimidate)的脒基化(amidination)；用乙酸酐的醯化；用氰酸鹽的氨基的甲氨醯化；用2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)的氨基的三硝基苄基化；用琥珀酐和四氫鄰苯二甲酸酐的氨基的醯化；以及用吡哆醛-5-磷酸酯，接著用NaBH4還原的賴氨酸的吡哆醛化。
精氨酸殘基的胍基可通過與試劑例如2，3-丁二酮、苯乙二醛和乙二醛形成雜環縮合產物來修飾。
羧基可通過形成O-acylisourea進行碳化二亞胺活化，接著進行後來的衍生，例如形成相應的醯胺來修飾。
巰基可通過以下方法來修飾，例如用碘乙酸或碘乙醯胺羧甲基化；過甲酸氧化成磺基丙氨酸；與其它硫醇化合物形成混合二硫化物；與馬來醯亞胺、馬來酐或其它取代的馬來醯亞胺反應；利用對氯汞苯甲酸酯、4-氯汞苯磺酸、苯汞氯化物、2-氯汞基-4-硝基酚以及其它汞製劑形成汞衍生物；用氰酸鹽在鹼性pH下甲氨醯化方法。
色氨酸殘基可通過，例如用N-溴琥珀醯亞胺氧化或用2-羥基-5-硝基苄基溴或磺醯滷化物(sulphenyl halides)烷基化吲哚環來進行修飾。在另一方面，酪氨酸殘基，可通過四硝基甲烷硝化形成3-硝基酪氨酸衍生物加以改變。
組氨酸殘基的咪唑環的修飾可通過用碘乙酸衍生物進行烷基化或用焦碳酸二乙酯進行N-乙酯基化完成。
在肽合成期間摻入非天然胺基酸和衍生物的例子包括但不限於，利用正亮氨酸、4-氨基丁酸、4-氨基-3-羥基-5-苯基戊酸、6-氨基己酸、t-丁基甘氨酸、正纈氨酸、苯基甘氨酸、鳥氨酸、肌氨酸、4-氨基-3-羥基-6-甲基戊酸、2-噻吩基丙氨酸和/或胺基酸的D-異構體。本文考慮的非天然胺基酸列表在表3中顯示。
表2-非常規胺基酸編碼




交聯劑可被用來，例如，穩定三維構象，利用同基雙官能交聯劑如具有(CH2)n間隔基團，其中n＝1到n＝6的雙官能醯亞胺酯、戊二醛、N-羥基琥珀醯亞胺酯，以及異源雙官能試劑，該試劑通常具有氨基反應基元如N-羥基琥珀醯亞胺和其它基團特異性反應基元如馬來醯亞胺或二硫基基元(SH)或碳化二亞胺(C00H)。此外，肽可以從構象上被束縛，例如，通過摻入Cα和Nα-甲基胺基酸，在胺基酸的Cα和Cβ原子之間引入雙鍵以及通過引入共價鍵，如在N和C末端之間、在兩個側鏈之間、或者在側鏈和N或C末端之間形成醯胺鍵來形成環肽或類似物。
在又一個可選擇的實施方案中，本發明涉及包含用光學可檢測標記物標記的顆粒的微球顆粒，其中該微球顆粒呈現WGM分布型並且其中該微球顆粒的WGM分布型在碳水化合物分子或其類似物結合至或與微球顆粒表面連接時可檢測地調製。
一個尤其優選的實施方案中，碳水化合物分子為糖胺聚糖(GAG)分子或GAG-樣分子。
GAG普遍存在並且在人體內的許多炎性過程中起著關鍵作用。這些大分子量多糖促進如癌症轉移、關節炎、移植排斥和哮喘的過程並且因此更多對這些過程了解可引導改進用於所述病症最終治療的藥物。目前，一種最廣為人知的GAG為硫化多糖的肝素家族，並且充分了解了這些分子的抗凝劑活性。
肝素-樣GAG(HLGAG)為分子的異基因組(Conrad，Heparinbinding proteins.Academic Press，San Diego，1998；Lander和Selleck，J Cell Biol 148(2)227-232，2000)。肝素和硫酸乙醯肝素，與所有HLGAG一樣，為長的線性多糖(Sasisekharan和Venkataraman，Curr Opin Chem Biol 4(6)626-631，2000；Casu，Ann NY Acad Sci 5561-17，1989；Casu，Adv Carbohydr Chem Biochem4351-134，1985)。其作為包含葡糖醛酸(GIcA)和葡糖胺(GlcN)的重複二糖單元的非-硫化鏈而合成，其在高爾基體中在順著其長度的不同部位被修飾。肝素比硫酸乙醯肝素更廣泛地被修飾並且大多數GlcN單元通過硫化基團修飾而變成N-硫化GlcN以及大多數GlcA單元通過表異構酶作用轉變成艾杜糖醛酸(IdoA)而被修飾。由於對硫化鏈的修飾常常不完全，因此HLGAG為異基因的。結果為大量的中間體修飾區域。
因此例如，硫酸乙醯肝素鏈由高度硫化的結構柔性的結構域組成，所述結構域富集2-O-硫化的IdoA，與主要由N-乙醯GlcN和GlcA的低硫化區域(為剛性結構)交替。HLGAG的硫化模式是複雜的，尤其對於6-O-硫酸鹽的定位。因此，不是所有的HLGAG分子都相同。它是主要確定特定HLGAG的蛋白質結合特徵的硫化模式。
一些蛋白質僅結合HLGAG鏈內特定的結構基序，而反之，一些GAG僅結合蛋白質上的特定部位或區域。例如抗-凝血酶III結合呈現特定硫化基團排列的獨特的戊糖序列而肝素戊糖結合抗-凝血酶III蛋白上的特異性位點(Whisstock等.J Mol Biol 3011287-1305，2000)。基礎成纖維細胞-來源的生長因子(FGE-2)和肝細胞生長因子(HGF)均結合肝素，而結合必需的肝素結構對於每種很不相同並且不同於抗-凝血酶III結合需要的(Maccarana等.J Biol Chem 268(32)23898-23905，1993；Lyon等.J Biol Chem 26911216-11223，1994)。另外，已顯示肝素結合FGF-2上的特定區域(Faham等.Science 2711116-1120，1996)。
FGF-2識別在規定位置中包含單個IdoA 2-O-硫酸鹽的基序，而對於HGF，GlcN 6-O-硫酸鹽基團的定位很關鍵。製劑內的一些肝素分子將運載結合戊糖的抗-凝血酶III和結合基序的FGF-2，而其它將運載結合基序的HGF和FGF-2基序而非結合戊糖的抗-凝血酶III。實際上，平均起來肝素製劑內僅三分之一分子運載結合戊糖的抗-凝血酶III(Conrad，1998，上文)。
GAG-樣分子還可源自非-哺乳動物的來源。例如，來自大腸桿菌K5的莢膜多糖由α-N-乙醯基氨基葡萄糖(α-GlcNAc)和β-葡糖醛酸(β-GlcA)單元交替組成並且不包含硫酸鹽或其他帶電基團。肝素主鏈由具有不同程度硫化的下列基序o-GlcNAc、β-GlcA、α-GlcNAc、β-艾杜糖醛酸(β-IdoA)組成。GlcA和IdoA之間僅有的差異為C-5位羧酸基的構型，因此肝素主鏈和大腸桿菌K5主鏈結構非常相似。
在又一個方面，本發明提供檢測能參與固定至或與如上所述包含光學可檢測標記物的微球顆粒連接的分子和樣本中所述分子的假定的分析物結合配偶體之間結合相互作用的分子的方法，所述方法包括(i)確定包含固定至或與此關聯的分子的微球顆粒的原始WGM分布型；和(ii)將包含所述固定的或與此關聯的微球分子的微球顆粒與包含所述分子的假定的分析物結合配偶體的樣本接觸；其中相對原始WGM分布型，微球顆粒的WGM分布型的可檢測的改變為分子和該分子分析物結合配偶體之間結合或相互作用的指示。
如此處所用的「WGM分布型的可檢測的改變」可包括任何兩種WGM分布型之間可觀察到的任何差異。
在一個的優選實施方案中，該可檢測的改變可包括一種WGM分布型相對另一種WGM分布型的一個或多個峰的紅移或藍移。
如此處所用的術語「紅移」指WGM分布型的一個或多個峰最大振輻點移位至更長的波長。不管該名稱「紅」，紅移可存在於電磁波譜的任何部分並且不限於可見光。如此處所用的術語「紅移」包括峰至更長波長的任何移位。反之，術語「藍移」指峰至更短波長的任何移動。
在尤其優選的實施方案中，WGM分布型中峰的紅移或藍-移通常包括大約1至100nm峰的最大振輻的波長的改變。所述1至100nm包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、 29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99和100nm的波長。具體的實施方案中，WGM分布型中峰的紅移或藍移包括大約1至20nm峰最大振輻的波長的改變，其包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20nm的波長。雖然具體地舉例說明了可見光峰中相關的波長移位，但本發明還涉及電磁波譜的其他區域中同等的和/或成比例的紅移和藍移。
本發明另外的實施方案中，微球顆粒一種或多種WGM分布型的改變，其由微球顆粒上固定的分子與分析物的相互作用引起，可包括一種或多種WGM分布型中一個或多個峰的出現或一種或多種WGM分布型中一個或多個峰的消失。
在此所述的微球顆粒的WGM分布型可利用對本領域技術人員顯然的任何適當的方法確定。基本上可檢測電磁輻射的一個或多個波長的任何檢測方法都可用於檢測WGM分布型。優選，檢測方法足夠靈敏而使得其可區分WGM分布型中的峰，更優選該檢測方法可區分兩個峰，其為至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99和/或100nm相隔。可用於確定微球顆粒WGM分布型的尤其適當的方法包括流式-細胞計數器、陣列閱讀器和共聚焦顯微鏡。
如此處所用的術語「共聚焦顯微鏡」在其範圍內包括雷射掃描共聚焦顯微鏡(LSCM)和多光子共聚焦顯微鏡。
本發明還提供固定至固相支持物的微球顆粒。
因此，另一方面中，本發明提供包含用光學可檢測標記物標記的顆粒的微球顆粒，其中該微球顆粒呈現WGM分布型並且其中該微球顆粒的WGM分布型隨著所述微球顆粒固定於固相支持物上和/或分析物與固定顆粒上捕獲的結合配偶體相互作用而可檢測地調製。
如此處所用的該術語「固相支持物」指微球顆粒可固定於其上的任何固體基質。本發明優選的實施方案中，固相支持物包括允許待檢測的固定至其上的微球顆粒的WGM分布型的固相支持物。因此，優選的固相支持物為可用於固定用於利用共聚焦顯微鏡分析的微球顆粒的那些。在尤其優選的實施方案中，固相支持物為顯微鏡載玻片。
又一個方面中，本發明涉及其中包含一個或多個凹痕的顯微鏡載玻片，其中每個凹痕適於固定如此處所述的微球顆粒。優選，通過所述顆粒沉降入或包埋入所述載玻片的凹痕中，微球顆粒固定於所述載玻片上。
又一個方面中，本發明提供檢測假定在樣本中的分析物的方法，所述方法包括(i) 確定微球顆粒的原始WGM分布型，所述微球顆粒包含用光學可檢測標記物標記的顆粒和固定至或與此連接的分子的顆粒，其中該微球顆粒呈現WGM分布型並且其中該微球顆粒的WGM分布型在所述微球結合或與所述樣本中假定的分析物相互作用時可檢測地調製；(ii)將所述樣本施加至所述微球顆粒一段時間並且處於允許分析物與固定或連接至該微球顆粒的分子相互作用的條件下；(iii)隨後確定該微球顆粒的WGM分布型；
其中相對原始WGM分布型，WGM分布型可檢測的改變為所述樣本中所述分析物存在的指示，並且相對原始WGM分布型，WGM分布型可檢測改變的缺乏為所述樣本中所述分析物缺乏的指示。
在一實施方案中結合至或與所述微球顆粒表面關聯的分子和/或所述分析物包括核酸分子。更優選，該核酸分子為DNA或RNA。
本發明這方面的另一個優選實施方案中，結合至或與該微球顆粒表面關聯的分子和/或所述分析物包括如此處定義的肽、多肽或蛋白質或其類似物。
本發明這方面的又一個優選實施方案中，結合至或與該微球顆粒表面關聯的分子和/或所述分析物包括碳水化合物分子。更優選的實施方案中，碳水化合物分子為GAG分子。
本發明這方面的又一個優選實施方案中，結合至或與該微球顆粒表面關聯的分子和/或所述分析物包括結合至或與核酸、肽、多肽、蛋白質和/或碳水化合物分子相互作用的分子。
本發明的又一個方面中，提供鑑定目的分子結合配偶體的方法，所述方法包括(i)確定包含用光學可檢測標記物標記的顆粒和固定至或與此關聯的分子的微球顆粒的原始WGM分布型；(ii)將包含所述目的分子潛在結合配偶體的一種或多種樣本施加至微球顆粒一段時間並且處於允許目的分子與潛在的結合配偶體相互作用的條件下；
(iii)隨後確定該微球顆粒的WGM分布型；其中WGM分布型相對原始WGM分布型的調製指示所述樣本中一種或多種結合配偶體的存在，並且相對原始WGM分布型，WGM分布型可檢測改變的缺乏為所述樣本中一種或多種結合配偶體缺乏的指示。
在一優選實施方案中，結合至或與該微球顆粒表面關聯的分子和/或所述分析物包括核酸分子。更優選，該核酸分子為DNA或RNA。
本發明這方面的另一個優選實施方案中，結合至或與該微球顆粒表面關聯的分子和/或所述分析物包括如此處定義的肽、多肽或蛋白質或其類似物。
本發明這方面的又一個優選實施方案中，結合至或與該微球顆粒表面關聯的分子和/或所述分析物包括碳水化合物分子。更優選的實施方案中，碳水化合物分子為GAG分子。
本發明這方面的又一個優選實施方案中，結合至或與該微球顆粒表面關聯的分子和/或所述分析物包括結合至或與核酸、肽、多肽、蛋白質和/或碳水化合物分子相互作用的分子。
本發明的微球顆粒可用於下列應用環境監測，如水質(來源中的軍團桿菌屬、賈第蟲屬、隱孢子蟲屬)和護理診斷點、空氣傳播的病原體和毒素、蛋白質蛋白質相互作用篩選、蛋白質碳水化合物相互作用篩選和藥物篩選以及小分子文庫篩選。
由於具有兩組或更多組的微球顆粒，本發明能進行多路復用。任何一組中的顆粒可具有共同的光學可檢測標記物和/或共同的尺寸和/或共同的固定的結合顆粒。因此，可利用許多組微球顆粒檢測多種分析物。
本發明進一步提供通過本發明的方法檢測的分析物。
本發明還進一步提供包含標記的或預標記的微球顆粒的試劑盒。顆粒可用於產生檢測顆粒周圍環境改變的測定法。
本發明進一步通過下列非-限制性實施例描述實施例1量子點標記的微球顆粒的產生和標記通常，可通過用量子點塗覆任何所需組成或尺寸的商品化珠而製備微球顆粒。對於更耐用的材料，其應當用另一種矽氧層塗覆以最小化與介質或吸附物的相互作用。
不限制許多可能性，此處描述的為利用玻璃/二氧化矽珠製備微球顆粒的典型方法。
0.1g的5微米直徑的商品化二氧化矽珠置於20ml 2-丙醇中並且添加20微升巰基丙基矽烷(MPS)或氨基丙基矽烷(APS)。在80℃回流溶液以允許MPS或APS的化學吸附，其導致珠表面上硫醇或氨基的產生。通過離心除去過量MPS或APS。
除了矽烷功能化的珠以外，還可以通過吸附陽離子聚合物活化珠。例如不受限制並且僅為舉例說明該方法的目的，0.1g二氧化矽珠與20mL水相PEI(聚(吖丙啶)溶液(1g/L，0.5M NaCI)混合。反應一小時後，離心溶液以除去過量聚合物並且重懸浮於純水中。該過程重複3次。
通過添加QD的氯仿懸浮液至珠的幹2-丙醇懸浮液而將QD吸附於APS或PEI塗布的珠上。添加的量達到以約10個單層塗覆該珠的程度。珠和QD在旋轉平底玻璃杯中平衡10分鐘。隨後，通過離心分離塗布的珠。
QD標記的珠可進一步通過用更多的二氧化矽塗覆而穩定。以兩種方法完成此步驟第一種，鹼性水或氯仿(1mL)中的5μl APS添加至QD塗布的二氧化矽微球顆粒並且利用旋轉平底玻璃杯以0.2Hz攪拌下反應1小時。通過在鹼性水或氯仿中反覆的離心/重懸浮循環除去過量APS後，5mL「活性二氧化矽」(pH 8.7的5mL水中5μl 2w/w％的矽酸鈉)添加至該顆粒並且使其反應過夜。此產生約沉積在顆粒上的3-5nm二氧化矽。通過離心分離過量成核的游離二氧化矽並且顆粒再分散於2-丙醇∶水(4∶1)中。最後根據所需利用TEOS和氨增加二氧化矽層以獲得所需厚度。
第二種方法包括乙醇中直接的二氧化矽生長而無在水中的初步沉積步驟。此包括PVP的吸附以及隨後二氧化矽的生長。添加足夠的PVP(MW 30,000)以通過將其溶於氯仿∶2-丙醇中(9∶1)而提供每nm2表面60個PVP分子。此立即添加至微球體，混合物超聲處理並且攪拌下反應過夜。
離心微球體(對於5微米二氧化矽在3800rpm 5秒)並且再分散於2-丙醇中(第一次)。攪拌添加NH3(4.2％)隨後為TEOS(2-丙醇中10vol％)並且使其沉積12個小時。
顯示產生QD標記微球顆粒的方法的簡圖在圖1中呈現。該一般方案允許從1微米上至100微米的任何實際尺寸，用具有不同發射性質的一種或多種不同納米顆粒標記的耐光二氧化矽微球體的製備。
共聚焦顯微鏡下觀察到的QD標記的微球顆粒的實例在圖2中顯示。
實施例2DNA檢測Q-Sand珠共軛至DNA，形成具有Q-Sand珠和固定的48-聚體DNA的複合物。48-聚體的第五個鹼基位點為具有摻入胺的胸腺嘧啶核苷鹼基。此胺用於利用標準的縮合反應標記具有BODIPY.630/650 NHS酯的DNA。共軛至48-聚體DNA的Q-Sand珠的WGM分布型在圖5中顯示，a圖。
圖5的b圖顯示共軛至α-Transprobe DNA的該圖Q Sand珠的WGM分布型，所述o-Transprobe DNA雜交至與Q-Sand珠共軛的DNA的鹼基6-24。如圖5的b圖所示，得到的WGM分布型對於所有峰有大約2.4nm的位移。此外，Q-因子(微共振器性質的測量)降低大約5X。
最後，圖5的a圖中顯示的Q Sand珠雜交至包含與DNA 48-聚體的DNA鹼基25-48互補區域的PCR產物。PCR產物產生自HeLa細胞DNA並且通過Exo1和λExo酶切消化製備用於雜交。生成的WGM分布型對於所有峰都有2.4nm的位移。Q-因子從僅Q-Sand的對照下降大約10X。
實施例3二氧化矽微球顆粒的表面功能化二氧化矽微球顆粒的表面功能化可以用與原始二氧化矽微球顆粒的同樣的方式，通過在包含MPS或APS或其他矽烷的2-丙醇中回流QD-二氧化矽微球顆粒以活化表面並且添加與靶生物吸附物反應的官能團來完成。
共軛物的製備用在560nm發射的橙色QD標記並且塗有10nm二氧化矽的5微米微球顆粒用MPS處理、離心並且洗滌。微球體允許與共軛物，如核酸、多肽、抗體、碳水化合物等等在水中反應約1小時。隨後離心並且洗滌以產生生物活性的QD微球體(BQDM)。
結合測定一些BQDM置於共聚焦顯微鏡下的顯微鏡載玻片上。一滴參比溶液置於微球體上並且利用488nm雷射激發收集光譜。隨後包含假定與BQDM上的共軛物相互作用試劑的一微升溶液添加至該滴並且反應半小時以上。收集光譜並且檢測WGM分布型的任何改變，如一個或多個峰的紅移或藍移，其中觀察到的改變為微球顆粒上共軛物與外源添加試劑之間相互作用的指示。
實施例4利用WGM分布型區分微球顆粒通過尺寸的區分利用此處所述的方法產生不同尺寸的微球顆粒。利用共聚焦顯微鏡確定每一不同粒徑的WGM分布型。
如圖3所示，每一不同尺寸顆粒呈現的WGM分布型隨著微球顆粒的半徑改變。
複合表面化合物的區分利用此處所述的方法生產包含結合至其表面的不同分子的QD標記的微球顆粒。利用共聚焦顯微鏡確定每一不同微球顆粒的WGM分布型。
如圖4所示，QD指無複合物結合至表面的QD標記的微球顆粒，PSS指包含結合聚苯乙烯磺酸鹽(PSS)的微球顆粒，而PVP指具有聚乙烯吡咯烷酮(PVP)吸附單層的微球顆粒。
如根據數據顯而易見的，QD標記的微球顆粒對複合物結合其表面敏感。此外，觀察到的WGM分布型位移還表現出對結合至表面的複合物的性質敏感。
實施例5樣本中假定的結合配偶體的檢測通過5』聚丙烯酸酯(acrydite)分子將具有功能性表面巰基的二氧化矽微球體共軛至單鏈寡核苷酸，其之前用螢光染料標記。
具有附著的、標記的寡核苷酸的微球體隨後雜交至互補或無關的寡核苷酸或PCR產物。
雜交的和未雜交的微球體在Milli Q水中廣泛洗滌並且點樣於顯微鏡蓋玻片上使其風乾。
乾燥的微球體隨後在適於所使用的螢光染料的、具有雷射器和濾波器的共聚焦顯微鏡上檢驗。記錄和比較產生的回音廊模式以確定具有另外的DNA雜交於微球體表面上的微球體和僅具有附著的標記寡核苷酸的微球體之間回音廊模式模式的波長位移。
得到的回音廊模式的波長圖形的位移可用於確定測試樣本中互補DNA序列的存在或缺乏。
實施例6
檢驗複合物的篩選利用此處所述的方案產生微球顆粒。不同的珠可通過WGM分布型鑑定。即使特定類型珠之間存在一些可變性，但在規定尺寸的珠上具有既定螢光發射體的給定靶的WGM分布型幾乎等同。可同時檢驗至少50個不同的Q-Sand珠。
微球顆粒排列於反應載體中。這些載體為具有用於不同複合物的區域的網格載玻片。掃描網格並且計算和保存WGM。讀數為預複合對照WGM。
每個反應載體用一種或多種檢測分子檢驗。
通過洗滌步驟減少非特異性結合。
洗滌後再掃描反應載體。通過WGM位移與預檢測分子的對照WGM比較來鑑定陽性。
實施例7微球體合成方案材料(3-氨丙基)三甲氧基矽烷(APS 99％)、(3-巰丙基)三甲氧基矽烷(MPS，95％)、四乙基原矽酸酯(TEOS，98％)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP，MW 40,000)、氫氧化銨(29.1％wt％NH3水)(Sigma-Aldrich)。5μm二氧化矽顆粒(Bangs Laboratories，Inc.)氯仿(CH3Cl3)和2-丙醇(AnalaR，Merck，Kilsyth，Victoria)。
儀器Olympus螢光顯微鏡(Olympus，Bonn，Germany)，機械迴轉輪，Shake和Stack(Thermohybaid，Glochester UK)，超聲波清潔器(Cole-Parmer Instrument Company，Illinois，USA)。
常規的重要注意點*用乙醇滅菌所有玻璃-小瓶和磁性攪拌器並且使其完全乾燥。
*利用過濾的槍頭用於所有的移液。
*所有玻璃小瓶必須為1.5-5ml體積之間平底的和有螺旋帽。
*當反應需要攪拌-過夜時用石蠟膜封閉所有玻璃螺旋帽的反應小瓶。
*如Brendan Toohey指示的進行二氧化矽珠的表面功能化。
*洗滌步驟和PVP的溶解期間的超聲處理不是必需的。
表面功能化二氧化矽珠1.用1次丙酮和2次2-丙醇充分清潔圓底燒瓶。
2.添加20ml 2-丙醇至清潔的圓底燒瓶並且置於加熱罩中，利用塑料蓋夾使得任何蓋扣緊並且開始通過shlenk line推進水。
3.為了最佳反應進行，2-丙醇需要在恆定的攪拌下加熱至80℃，因此用溫度計不斷監測2-丙醇的溫度直至其達到該溫度，確保溫度計在每次溫度檢查之前用乙醇擦拭。
4.一旦達到溫度，添加20μl APS和0.1g未處理的Bang’s珠，其等同於1ml廠家的珠漿液並且在恆定攪拌下處理2小時。
5.處理後轉移瓶的內容物至合適的瓶，用於洗滌。
6.2-丙醇中洗滌2次隨後重懸浮於10ml Milli-Q水並且用石蠟膜封瓶。
A部分製備PVP

B部分鈍化納米晶體以功能化5μm的二氧化矽珠


C部分TEOS塗敷PVP加帽的摻雜納米晶體的微球


本領域技術人員將理解此處所述的本發明可易於進行不同於具體所述的那些改變和改進而不是局限於具體所述。應理解本發明包括所有這樣的改變和改進。本發明還包括本說明書中分別或總體涉及的或指明的所有步驟、特徵、組成和複合，以及任何更多所述步驟或特徵的任何及所有組合。
參考文獻Baird and Myszka，J Mol Recognit 14261-268，2001；Casu，Ann NY Acad Sci 5561-17，1989；Casu，Adv Carbohydr Chem Biochem 4351-134，1985；Conrad，Heparin binding proteins Academic Press，San Diego，1998；Faham等.Science 2711116-1120，1996；Karlsson and Stahlberg，Anal Biochem 228274-280，1995；Lander and Selleck，J Cell Biol 148(2)227-232，2000；Li等.Science 299840-843，2003；Lin等.Science 278840-843，1997；Lyon等.J Biol Chem 26911216-11223，1994；Maccarana等.J Biol Chem 268(32)23898-23905，1993；Malmqvist，Nature 361186-187，1993；Rich and Myszka，J Mol Recognit 15352-376，2002；Sasisekharan and Venkataraman，Curr Opin Chem Biol 4(6)626-631，2000；Vollmer等.Biophysical Journal 851974-1979，2003；Whisstock等.J Mol Biol 3011287-1305，2000；
權利要求
1.檢測分析物的方法，所述方法包括將至少一組微球顆粒與假定包含所述分析物的樣本接觸，其中一組微球顆粒內的每一顆粒包括光學可檢測的標記物以及固定的所述分析物的假定結合配偶體，其中每一顆粒組具有確定的回音廊模式(WGM)分布型，其中所述分析物結合所述固定的結合配偶體引起所述至少一組微球顆粒WGM分布型的變化，其為所述分析物存在的指示。
2.權利要求1的方法，其中該光學可檢測標記物為螢光團。
3.權利要求2的方法，其中每種微球顆粒組用不同的螢光團標記。
4.權利要求1的方法，其中每種微球組用不同的、固定的所述分析物的假定結合配偶體標記。
5.權利要求1的方法，其中每種微球顆粒組的顆粒尺寸不同。
6.權利要求1的方法，其中每種微球顆粒組具有兩種或多種a.不同的光學可檢測標記物；b.不同尺寸；和/或c.不同的固定的分析物的結合配偶體。
7.權利要求1的方法，其中所述微球顆粒包括選自以下的材料二氧化矽、乳膠、二氧化鈦、二氧化錫、氧化釔、礬土、其他二元金屬氧化物、鈣鈦礦和其他壓電金屬氧化物、蔗糖、瓊脂糖和其他聚合物。
8.權利要求7的方法，其中所述顆粒包括二氧化矽。
9.權利要求1至8任何一項的方法，其中所述顆粒基本上為球形或類球形顆粒。
10.權利要求5的方法，其中所述顆粒包括約300nm至約30μm的直徑。
11.權利要求1的方法，其中所述光學可檢測標記物為發射螢光的分子、原子或離子。
12.權利要求1的方法，其中所述光學可檢測標記物為發射磷光的分子、原子或離子。
13.權利要求1的方法，其中所述光學可檢測標記物為發射白熱的分子、原子或離子。
14.權利要求1的方法，其中所述光學可檢測標記物在任何一種或多種紫外線、可見光、近紅外線(NIR)和/或紅外線(IR)波長範圍中為可檢測的。
15.權利要求11的方法，其中所述光學可檢測標記物在可見波長範圍中為可檢測的。
16.權利要求1的方法，其中所述光學可檢測標記物包括選自下列的標記物螢光團、半導體顆粒、磷顆粒、摻雜顆粒或納米晶體和量子點。
17.權利要求16的方法，其中所述光學可檢測標記物為螢光團。
18.權利要求16或17的方法，其中所述光學可檢測標記物為量子點。
19.權利要求1的方法，其中所述核酸分子包括核酸分子。
20.權利要求19的方法，其中所述核酸分子包括DNA。
21.權利要求19的方法，其中所述固定的結合顆粒包括RNA。
22.權利要求1的方法，其中所述固定的結合顆粒包括肽、多肽或蛋白質。
23.權利要求22的方法，其中所述肽、多肽或蛋白質為酶。
24.權利要求22的方法，其中所述肽、多肽或蛋白質為抗體。
25.權利要求1的方法，其中所述固定的結合顆粒包括碳水化合物分子。
26.權利要求25的方法，其中所述碳水化合物為糖胺聚糖分子。
27.權利要求1的方法，其中所述WGM分布型的調製包括所述分布型中一個或多個峰的紅移。
28.權利要求1的方法，其中所述WGM分布型的調製包括該分布型中一個或多個峰的藍移。
29.權利要求27或28的方法，其中所述紅移或藍移包括所述峰或多個峰的波長1和100nm之間的改變。
30.權利要求29的方法，其中所述紅移或藍移包括所述峰或多個峰的波長的1和20nm之間改變。
31.權利要求1的方法，其中所述WGM分布型的調製包括一種或多種所述WGM分布型中一個或多個峰的出現。
32.權利要求1的方法，其中所述WGM分布型的調製包括一種或多種所述WGM分布型中一個或多個峰的消失。
33.權利要求1的方法，其中所述WGM分布型通過利用共聚焦顯微鏡結合分光計而確定。
34.權利要求1的方法，其中所述WGM分布型通過利用陣列掃描儀結合分光計而確定。
35.權利要求1的方法，其中所述WGM分布型通過測量來自單個顆粒的光的裝置結合分光計而確定。
36.權利要求35的方法，其中所述裝置為流式細胞儀。
37.通過權利要求1的方法檢測的分析物。
全文摘要
本發明公開了用於檢測靶分析物存在的生物傳感器。該生物傳感器由微球顆粒組成，所述微球顆粒具有固定於其表面的靶分析物的結合配偶體。該結合配偶體可以是核苷酸；肽、蛋白質、酶、抗體等等。當分析物結合其配偶體時，微球顆粒回音廊模式(WGM)分布型改變而使得該分布型的峰經歷紅或藍－移。固定的結合配偶體可包括螢光團等等以使其發射螢光、磷光、白熱等等。這些螢光團可採取納米晶體或量子點的形式。
文檔編號G01N21/63GK101027546SQ200580020502
公開日2007年8月29日 申請日期2005年5月26日 優先權日2004年5月26日
發明者卡爾·珀特, 布蘭丹·圖希, 保羅·馬爾瓦尼 申請人:傑納羅生物系統有限公司, 保羅·馬爾瓦尼