基於二氧化鈦納米界面的細胞生物傳感器的製備方法

2023-07-20 03:37:31 2

專利名稱：基於二氧化鈦納米界面的細胞生物傳感器的製備方法
技術領域：
本發明涉及生化醫藥技術領域，特別涉及一種細胞生物傳感器的製備方法。
背景技術：
癌症，又稱惡性腫瘤，已經成為二十一世紀影響人類身體健康及生命的最大殺手。據統計顯示，癌症的死亡已位居我國各類死因的第一位(2004年)。因此，癌症的準確診斷及有效治療一直是生物學、醫學等相關領域的研究重點。近幾年，腫瘤切除和器官移植在癌症早期是比較有效的治療手段，但最大問題是癌症診斷出來時一般都已到晚期，此時已經沒有行之有效的治療方法。因此，要提高癌症患者的生存期，最好的方法就是早發現、早診斷。目前，癌症早期診斷的方法很多，但是大多數檢測手段繁瑣複雜，往往需要很多步才能完成。因此，尋找更簡便、快速的方法在癌症早期診斷中意義重大。 生物傳感技術是一門由生物、化學、物理、醫學、電子技術等多種學科互相滲透成長起來的高新技術，生物傳感器是一種將生物感應元件的專一性和一個能夠產生與待測物濃度成比例的信號傳導器結合起來的分析裝置。由於其具有選擇性好、靈敏度高、分析速度快、成本低、能在複雜體系中進行在線連續監測的特點，已在生物、醫學、環境監測、食品、醫藥、及軍事醫學等領域顯示出廣闊的應用前景。 納米結構所具有的小尺寸效應、表面與界面效應等使納米材料呈現出光學、光催
化、光電化學、力學、熱學等許多獨特的性能，在催化、濾光、光吸收、醫藥、磁介質及新材料
等方面有廣闊的應用前景。由於納米材料具有良好的生物相容性，耐腐蝕等優異的性能，受
到生物材料研究者廣泛關注，其作為一種有潛力的生物材料已經被廣泛地用於生物醫藥等
領域。納米生物技術把納米材料科學、化學與生物技術有機結合，在基因治療、生物醫學、生
物納米結構的構建及生物大分子結構與功能關係的研究方面具有重要作用。 近年來，將納米材料引入電化學生物傳感器成為這一領域研究的熱點。用於增強
電化學生物傳感器性能的納米材料的種類很多，如碳納米管、納米金、納米鉑等。二氧化鈦
納米顆粒由於具有化學性質穩定、光敏性高、生物相容性好等特點，已在汙染物降解、太陽
能電池、醫學、製藥等方面得到廣泛的應用。隨著化學修飾電極的發展，人們發現納米二氧
化鈦的高比表面積，很好的生物相容性，相對較高的導電率等優異性能均使得其適於作為
一種優良的電極修飾材料，並可通過溶膠凝膠法、磁控濺射法、電化學沉積法和複合法等途
徑製作成修飾電極，用於電化學生物傳感器領域。納米二氧化鈦用於修飾電極可以改善生
物分子氧化還原可逆性，其高的比表面積有利於酶的固定化，提高酶分子的相對活性，還能
促進酶活性中心與電極表面的電子傳遞。納米二氧化鈦這些特性對於提高生物檢測的靈敏
度和穩定性具有重大意義，為生物傳感器領域開闢了廣闊的前景。

發明內容
針對現有癌症診斷技術存在的解析度不夠高、診斷費用昂貴、檢測周期長等缺點，本發明提出了一種集合二氧化鈦納米顆粒與氧化銦錫導電玻璃製成的基於二氧化鈦納米
3界面的細胞生物傳感器的製備方法，這種傳感器具有操作簡便、檢測快速、靈敏度高、檢測限低等優點，可廣泛應用於生物分子識別和癌細胞檢測等生物醫學領域。 本發明提供了一種基於二氧化鈦納米界面的細胞生物傳感器的製備方法第一步，將二氧化鈦納米顆粒(P25)超聲分散於十六烷基三甲基溴化銨CTAB中，得到質量濃度為0. 33mg/ml的乳白色納米二氧化鈦溶膠；第二步，用微量進樣器取4 10 P L第一步製得的納米二氧化鈦溶膠，均勻滴塗於已超聲清洗過的氧化銦錫IT0導電玻璃的導電面，置於乾燥器中晾乾即得Ti02/IT0修飾電極；第三步，將白血病細胞用磷酸鹽緩衝溶液PBS洗滌並稀釋至1.6X104cells/ml 1. OX 107cells/ml，得到細胞懸浮液，取lOiiL細胞懸浮液並均勻塗覆於第二步製備的修飾電極表面，並於培養箱中37t:恆溫放置2h後即得基於二氧化鈦納米界面的細胞傳感器。 其中，基於二氧化鈦納米界面的細胞生物傳感器的製備方法中所述的白血病細胞可以為白血病敏感細胞K562/B.W.(以下簡稱K562)或白血病耐藥細胞K562/A匿(以下簡稱KA)。 有益效果 實驗研究結果表明，本發明採用分散法製備納米二氧化鈦溶膠以及使用滴塗法將二氧化鈦溶膠修飾在ITO導電玻璃上的方法均簡單且便於操作，在ITO表面形成了一層均勻緻密的納米顆粒薄膜，由此得到的基於二氧化鈦納米界面的細胞生物傳感器能顯著提高白血病細胞的檢測靈敏度；電化學探針在此修飾電極上的響應電流明顯大於修飾納米二氧化鈦之前裸電極上所得響應電流值，同時這種生物傳感器可以靈敏地檢測和區分白血病敏感與耐藥等不同種類的細胞；與一些常規生物學檢測方法(如MTT和流式細胞術等)相比，此方法操作簡單，檢測快速，整個檢測過程只需幾個小時即可完成，而常規方法一般需要幾十個小時甚至幾天，大大縮短了檢測周期，這對於白血病的早期診斷和早期治療十分有利。
我們通過接觸角檢測研究了 ITO電極表面在修飾納米二氧化鈦前後的親疏水性變化，又採用電化學法分析研究了白血病敏感和耐藥細胞在此界面上的行為，最後以白血病耐藥細胞為例，研究了此傳感器對癌細胞的高靈敏檢測。研究結果表明，修飾納米二氧化鈦之後，電極表面的親水性大大增加，進而加快了電子傳遞速率，提高了傳感器的檢測靈敏度，且在此界面上不同種類白血病細胞之間探針的電化學性質也有明顯的差異，從而可以達到快速檢測與識別敏感和耐藥等不同種類白血病細胞的目的。


下面結合

本發明的實施例。本發明保護範圍不以實施例為限。
圖l是電化學探針在納米二氧化鈦界面上的伏安圖圖1A為循環伏安圖；圖1B為
脈衝伏安圖。 圖2是修飾納米二氧化鈦前後，水滴在IT0電極表面上接觸角圖像。 圖3A是不同濃度白血病耐藥細胞KA在納米二氧化鈦界面上的交流阻抗譜圖；圖
3B是阻抗值與細胞濃度對數的關係曲線。
具體實施例方式
本發明的二氧化鈦納米顆粒(P25)購於Degussa公司，IT0導電玻璃購於金壇康
4達克應用薄膜中心，十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)購於國藥集團化學試劑有限公司，磷酸鹽緩衝溶液(磷酸二氫鈉5mM，磷酸氫二鈉15mM，氯化鉀0. 2M)pH = 7. 2。
本發明提供了一種基於二氧化鈦納米界面的細胞生物傳感器的製備方法
第一步，將二氧化鈦納米顆粒(P25)超聲分散於十六烷基三甲基溴化銨CTAB中，得到質量濃度為0. 33mg/ml的乳白色納米二氧化鈦溶膠； 第二步，用微量進樣器取4 10 L第一步製得的納米二氧化鈦溶膠，均勻滴塗於已超聲清洗過的氧化銦錫IT0導電玻璃的導電面，置於乾燥器中晾乾即得Ti02/IT0修飾電極； 第三步，將白血病細胞用磷酸鹽緩衝溶液PBS洗滌並稀釋至1. 6X104cellS/ml 1. OX 17cells/ml，取10 L均勻塗覆於第二步製備的修飾電極表面，並於培養箱中37°。恆溫放置2h後即得基於二氧化鈦納米界面的細胞傳感器。 電極表面的修飾方法種類很多，依其類型、功能和基底電極材料的性質和要求而不同。其中，滴塗法是製備薄膜修飾電極的最簡單方法之一。具體操作就是取幾微升修飾劑的溶液滴加到電極表面，使其揮發成膜。此法的主要優點在於修飾劑在電極表面的覆蓋量可從其濃度和滴加體積得知。 實施例1 一種基於二氧化鈦納米界面的細胞生物傳感器的製備將lmg 二氧化鈦納米顆粒(P25)溶於3ml十六烷基三甲基溴化銨(CTAB) (2mM)中，
超聲分散20min，得到乳白色納米二氧化鈦溶膠(質量濃度為0. 33mg/ml)。將ITO導電玻
璃按照使用要求的規格切割成條狀，並依次分別在丙酮、無水乙醇和二次超純水中超聲清
洗5min，取出後用超純水衝洗，氮氣吹乾。用微量進樣器取4 lOii L納米二氧化鈦溶膠均
勻滴塗於ITO導電面，置於乾燥器中晾乾即得修飾電極(Ti02/IT0)。其中，量取的二氧化鈦
溶膠的體積可以是4 10 L中的任一數值。 實施例2 —種基於二氧化鈦納米界面的細胞生物傳感器的製備將lmg 二氧化鈦納米顆粒(P25)溶於3ml十六烷基三甲基溴化銨(CTAB) (2mM)中，
超聲分散20min，得到乳白色納米二氧化鈦溶膠(質量濃度為0. 33mg/ml)。將ITO導電玻
璃按使用要求的規格切割成條狀，並依次在丙酮、無水乙醇和二次超純水中超聲清洗5min，
取出後用超純水衝洗，氮氣吹乾。用微量進樣器取6 L納米二氧化鈦溶膠均勻滴塗於ITO
導電面，置於乾燥器中晾乾即得修飾電極(Ti02/IT0)。 實施例3電化學探針在二氧化鈦納米界面上的電化學響應 採用三電極體系，以銀絲為參比電極，鉬絲為輔助電極，分別以修飾二氧化鈦納米顆粒前後的ITO電極為工作電極，用電化學方法研究鐵氰化鉀在這兩種界面上的電化學性質。結果發現，與ITO導電玻璃本身的氧化銦錫膜界面相比，該二氧化鈦納米界面能顯著加速電子傳遞速率，提高檢測靈敏度。圖1(A)和(B)分別為鐵氰化鉀的循環伏安圖和脈衝伏安圖，其中曲線a為ITO電極的、曲線b為TiO乂ITO修飾電極的，從圖1中可以看出與裸電極相比，鐵氰化鉀在二氧化鈦納米界面上的峰電流明顯增強，表明這種生物傳感器能夠有效促進電子傳遞，具有高靈敏性。
實施例4 二氧化鈦納米界面的親疏水性 ITO導電玻璃本身的氧化銦錫膜界面的疏水性很好，如圖2 (a)(接觸角大小為77° )，這限制了電化學探針與電極表面的接觸，而在此表面上進一步修飾一層納米二氧化鈦後，界面變得十分親水，如圖2(b)(接觸角大小為20° )，這就使得電化學探針與電極表面的接觸面積大大增加，從而大大提高檢測的靈敏度。 實施例5在基於二氧化鈦納米界面上白血病敏感和耐藥細胞的區分
本實施例中，分別將培養基中的白血病敏感細胞K562和白血病耐藥細胞KA以1200rpm的速度離心5min，取離心管底部細胞沉澱用0. 02M pH = 7. 2的磷酸鹽緩衝液(PBS)洗滌，再離心，如此重複操作2 3次後，用計數板計數，再根據細胞數目用PBS將兩種細胞均稀釋至5. OX 106cells/ml。分別取10 P L稀釋後的細胞懸浮液均勻塗覆在修飾納米二氧化鈦前後的ITO電極的導電面上，並於培養箱中37t:恆溫放置2h後在電極表面形成一層細胞膜，即得基於二氧化鈦納米界面的細胞傳感器。 採用三電極體系，以銀絲為參比電極，鉬絲為輔助電極，分別以覆蓋有K562和KA細胞的裸IT0電極和Ti02/IT0修飾電極(即KA/IT0和K562/IT0， KA/Ti02/IT0和K562/Ti02/IT0)為工作電極，用電化學方法測量電化學探針鐵氰化鉀在這幾種不同界面上的脈衝伏安圖。結果表明，由於修飾納米二氧化鈦前後界面性質發生了變化，進一步覆蓋上兩種細胞後，鐵氰化鉀的電化學性質也有了很大差異。在IT0導電玻璃本身的氧化銦錫膜界面上覆蓋兩種不同細胞後，鐵氰化鉀的峰電流大小基本相同，峰電位也基本一致；而在修飾有二氧化鈦納米界面的IT0電極上覆蓋兩種不同細胞後，鐵氰化鉀的峰電流均明顯增加，且在兩種細胞膜界面上增加的幅度有很大差異，白血病敏感細胞K562增加的幅度遠大於白血病耐藥細胞KA，並且鐵氰化鉀的峰電位也由在原來界面上的基本一致變為有明顯的位移。由於細胞膜不具有導電性，且與白血病敏感細胞相比，耐藥細胞由於其細胞表面P-糖蛋白(P-gp)的過度表達而更容易吸附在界面上，從而阻礙了鐵氰化鉀的電子傳遞，因此峰電流比覆蓋了敏感細胞後所得到的要小，進而細胞所吸附的界面的親水性越好，兩種細胞之間的這種差別也就越明顯。由此，就可以達到快速檢測與識別敏感和耐藥這兩種不同種類癌細胞的目的，從而達到對癌症的早期診斷。 實施例6基於二氧化鈦納米界面的細胞生物傳感器的高靈敏檢測研究
本實施例中，以白血病耐藥細胞KA作為研究對象，進一步研究該類細胞傳感器的檢測靈敏度。首先，將培養基中的白血病耐藥細胞KA以1200rpm的速度離心5min，取離心管底部細胞沉澱用0. 02M pH = 7. 2的磷酸鹽緩衝液(PBS)洗滌，再離心，如此重複操作2 3次後，用計數板計數，再根據細胞數目用PBS將其依次稀釋至5個不同的濃度。取各個濃度的10 ii L細胞懸浮液分別均勻塗覆在納米二氧化鈦修飾的IT0電極上，並於培養箱中37°C恆溫放置2h後在電極表面形成一層細胞膜，即得基於二氧化鈦納米界面的細胞傳感器。
採用三電極體系，以飽和甘汞電極為參比電極，鉬絲為對電極，分別以覆蓋有不同濃度KA細胞的納米二氧化鈦修飾電極(即KA/Ti02/IT0)為工作電極，用交流阻抗法測得覆蓋有不同濃度細胞的界面上阻抗譜如圖3A所示，圖中從a到f，納米二氧化鈦修飾電極上覆蓋的KA細胞濃度依次為0cells/ml， 1. 6X 104cells/ml，8. 0X 104cells/ml，4. 0X105cells/ml，2. 0X106cells/ml，l. 0X107cells/ml。由圖中高頻區半圓直徑的大小可以看出，在納米二氧化鈦修飾電極表面上，隨著細胞濃度的增加，阻抗值也隨之增加(圖3A中內插圖為此電極反應過程的等效電路圖)。為了更進一步得出定量關係，作了阻抗值R。t與細胞濃度對數值的線性關係(如圖3B)，它們之間的線性方程為R。t(Q)=505. Q81gC (cells/ml)-1543. 55 (R = 0. 996)，檢測限為1. 3 X 103cells/ml (S/N = 3)。由此可看出，我們製備的基於二氧化鈦納米界面的細胞傳感器實現了對癌細胞的高靈敏檢測， 對於臨床上實現癌症的早期診斷具有重要意義。
權利要求
一種基於二氧化鈦納米界面的細胞生物傳感器的製備方法，其特徵在於第一步，將二氧化鈦納米顆粒(P25)超聲分散於十六烷基三甲基溴化銨CTAB中，得到質量濃度為O.33mg/ml的乳白色納米二氧化鈦溶膠；第二步，用微量進樣器取4～10μL第一步製得的納米二氧化鈦溶膠，均勻滴塗於已超聲清洗過的氧化銦錫ITO導電玻璃的導電面，置於乾燥器中晾乾即得TiO2/ITO修飾電極；第三步，將白血病細胞用磷酸鹽緩衝溶液PBS洗滌並稀釋至1.6×104cells/ml～1.0×107cells/ml，得到細胞懸浮液，取10μL細胞懸浮液並均勻塗覆於第二步製備的TiO2/ITO修飾電極表面，並於培養箱中37℃恆溫放置2h後即得基於二氧化鈦納米界面的細胞傳感器。
全文摘要
本發明提供了一種基於二氧化鈦納米界面的細胞傳感器的製備方法。第一步，將二氧化鈦納米顆粒超聲分散於十六烷基三甲基溴化銨中，得到質量濃度為0.33mg/ml的納米二氧化鈦溶膠；第二步，用微量進樣器取4～10μL第一步製得的納米二氧化鈦溶膠，均勻滴塗於超聲清洗過的氧化銦錫導電玻璃的導電面，置於乾燥器中晾乾即得TiO2/ITO修飾電極；第三步，將白血病細胞用磷酸鹽緩衝液洗滌並稀釋至1.6×104～1.0×107cells/ml，得到細胞懸浮液，取10μL懸浮液均勻塗覆於第二步製備的修飾電極表面，並於培養箱中37℃恆溫放置2h即得基於二氧化鈦納米界面的細胞傳感器。其中，所述的白血病細胞可以為白血病敏感細胞K562/B.W.或白血病耐藥細胞K562/ADM。這種細胞生物傳感器製備簡單，檢測快速，靈敏度高。
文檔編號G01N27/327GK101776638SQ20101001831
公開日2010年7月14日 申請日期2010年1月13日 優先權日2010年1月13日
發明者吳春惠, 吳曉靜, 周研研, 姜暉, 李景源, 王雪梅, 趙娟 申請人:東南大學