黃瓜亞硝酸鹽主效qtl緊密連鎖的分子標記方法

2023-07-20 12:26:11

專利名稱：黃瓜亞硝酸鹽主效qtl緊密連鎖的分子標記方法
技術領域：
本發明涉及黃瓜育種及分子生物學領域，尤其是選擇利用與黃瓜亞硝酸鹽主效 QTL緊密連鎖的分子標記進行輔助育種，以提高黃瓜品質育種效率。
背景技術：
亞硝酸鹽是影響蔬菜質量的重要因素之一，在人體內會引起高鐵血紅蛋白症，還能與人體次級胺結合，形成亞硝胺，有致癌作用(張夫道，200 。有研究表明，中國大部分地區蔬菜中亞硝酸鹽的汙染已不容忽視。蔬菜中亞硝酸鹽含量國家標準，以NaNO2彡4. Omg kg-1 (GB184061-2001)。為了人民群眾的安全健康，應加快選育低亞硝酸鹽含量的黃瓜品種。但是黃瓜中亞硝酸鹽含量的測定，要等果實發育到成熟期才能進行；且測量方法比較繁瑣；況且表現型與基因型之間缺乏明確的對應關係，選擇效率不高。近年來分子標記輔助育種技術，有效地解決了這一問題。通過構建遺傳連鎖圖譜和數量位點(QTL)分析，能夠檢測到與黃瓜亞硝酸鹽主效QTL緊密連鎖的分子標記。使用與這一特定親本的亞硝酸鹽主效QTL緊密連鎖的分子標記，可以對該特定親本的後代或其衍生品種(品系)在苗期進行早世代篩選，淘汰高亞硝酸鹽的品種(品系)，節約生產成本， 提高育種效率。黃瓜分子標記成功申請專利已有很多先例。例如徐向麗等發明了一種與黃瓜雌性性狀相關的分子標記(公告號CN101113469)，潘俊松發明了與黃瓜單性花基因M共分離的分子標記(公告號CN101580876)，劉龍洲等發明了與黃瓜白粉病抗性主效QTL緊密連鎖的分子標記(公告號CN101240342)，關媛等發明了與黃瓜有毛基因Gl緊密連鎖的分子標記 (公告號:CN101250523)。D0327是東北農業大學園藝學院黃瓜課題組選育的優良親本(果皮綠色均勻、光皮、無刺瘤、果柄極短)，其亞硝酸鹽含量經3年5點測驗低於4. Omg · kg—1。目前尚未有與其主效QTL相連鎖分子標記的報導。

發明內容
本發明目的是提供一種方法，用以檢測與黃瓜亞硝酸鹽主效QTL緊密連鎖的分子標記，並通過這些分子標記來預測黃瓜亞硝酸鹽的水平，提高育種速度和加快育種進程。本發明提供的與黃瓜亞硝酸鹽主效QTL緊密連鎖的分子標記，是通過以下方法獲得a亞硝酸鹽含量低的黃瓜品種D0327 (2. 56mg · kg—1)作父本與亞硝酸鹽含量高的黃瓜品種1058(8. 92mg · kg—1)作母本進行雜交，得到雜種F1 ；b由雜種F1代自花授粉獲得F2代；c分離每個單株黃瓜葉片的DNA，採用簡單重複序列標記(SSR)引物進行PCR擴增，6 %丙烯醯胺凝膠上電泳分離，獲得分子標記數據；
d基於遺傳連鎖交換定律，對分子標記分析資料構建黃瓜遺傳連鎖圖；e在果實收穫以後，測定F2代每個單株果實的亞硝酸鹽，2. 6mg · kg-1以上為高亞硝酸鹽型，2. 6mg · kg-1以下為低亞硝酸鹽型，f將F2代每個單株果實的亞硝酸鹽與黃瓜遺傳連鎖圖譜進行連鎖和QTL分析，將 LOD彡3. 0作為QTL存在的闕值，確定與黃瓜亞硝酸鹽主效QTL連鎖的分子標記CSWTA17。與黃瓜亞硝酸鹽主效QTL緊密連鎖的分子標記的應用包括將分子標記SCSWTA17 應用於黃瓜品種和品系的基因檢測，以判斷該品種和品系亞硝酸鹽的水平。a以D0327及其衍生品種或品係為父母本與其他黃瓜品種雜交並繁衍至F2以上，b對通過步驟a獲得黃瓜單個植株，分離葉片DNA，檢測分離的DNA中是否存在與黃瓜亞硝酸鹽主效QTL緊密連鎖的分子標記，如果分子標記出現，則可預測黃瓜亞硝酸鹽含量在2. 6mg · kg-1以下。所用D0327及其衍生品種或品系，是指以D0327為親本，通過常規雜交方法獲得的黃瓜品種或品系。本發明能夠克服黃瓜亞硝酸鹽含量只能在果實成熟期進行檢測的缺點，在苗期就能夠通過分子標記對黃瓜品種和品系的亞硝酸鹽水平進行預測和篩選，淘汰高含量植株，減少人力和物力的浪費，提高育種效率。


附圖1是構建的黃瓜遺傳連鎖圖，標記間的距離已用數字標出。此連鎖組共含有 4個SSR標記，亞硝酸鹽QTL記為Ni，位於連鎖組的CSWTA04-CSWTA17區間內，距標記的最近距離1. 8cM。
具體實施例方式實例與黃瓜亞硝酸鹽主效QTL緊密連鎖的分子標記的獲得(I)F2群體的構建及亞硝酸鹽含量的測定採用亞硝酸鹽含量低的黃瓜品種D0327 (2. 56mg · kg—1)作父本與亞硝酸鹽含量高的黃瓜品種1058(8. 92mg · kg—1)作母本進行雜交，得到雜種F1 ；由雜種F1代自花授粉獲得 F2代；產生240個單株。摘取相同開花期相同節位的成熟商品瓜，洗淨吸乾水分後切段，用勻漿機攪碎。準確稱取5. Og,裝入25毫升刻度試管中，加去離子水IOml，蓋上玻璃塞，置於沸水浴中提取30 分鐘，冷卻後過濾並用去離子水定容至25ml。吸取提取液2. Oml，加1 %磺胺溶液4ml，搖勻。 反應5min後，加4. OmlO. 02%鹽酸萘乙二胺後搖勻，室溫下放置30min後在540nm的波長下比色。比色階段進行三次重複。(2)分子標記分析，遺傳圖譜構建及QTL分析選取在父母本間具有擴增多態性的SSR引物對240個單株進行分析，根據SSR條帶在群體中的分離情況，將有母本類型條帶的個體記為「A」，有父本類型條帶的個體記為 「B」，雜合類型條帶的個體記為「H」，缺失不清的記為「_」。
利用Mapmaker/EXP3. 0作圖軟體，構建分子標記連鎖圖譜。應用Group命令進行連鎖分析和分組(L0D = 5. 0)，連鎖標記少於8個的用Compare命令進行優化排序，多於8 個的用Ripple命令排序，錯誤檢測水平設為1 %，利用Kosambi函數將重組率轉化為遺傳圖距(cM)。將LOD彡3. O作為QTL存在的闕值，用WinQTLcartograph V2. O進行QTL定位。與黃瓜亞硝酸鹽主效QTL緊密連鎖的分子標記CSWTA17 採用引物CSWTA17進行 PCR擴增，擴增在6%的聚丙烯凝膠(100毫升聚丙烯凝膠含有5. 7克丙烯醯胺，0. 3克雙丙醯胺)電泳上分離後，獲得分子標記，所得片段為198bp。
權利要求
1.與黃瓜亞硝酸鹽主效QTL緊密連鎖的分子標記，是通過以下方法獲得的a亞硝酸鹽含量低的黃瓜品種D0327(2.56mg· kg—1)與亞硝酸鹽含量高的黃瓜品種 1058(8. 92mg · kg-1)作母本進行雜交，得到雜種F1 ； b由雜種F1代自花授粉獲得F2代；c分離每個單株黃瓜葉片的DNA，採用簡單重複序列標記(SSR)引物進行PCR擴增，6% 丙烯醯胺凝膠上電泳分離，獲得分子標記數據；d基於遺傳連鎖交換定律，對分子標記分析資料構建黃瓜遺傳連鎖圖； e在果實收穫以後，測定F2代每個單株果實的亞硝酸鹽，2. 6mg -kg-1以上為高亞硝酸鹽型，2. 6mg · kg-1以下為低亞硝酸鹽型，f將F2代每個單株果實的亞硝酸鹽與黃瓜遺傳連鎖圖譜進行連鎖和QTL分析，將 LOD彡3. 0作為QTL存在的闕值，確定與黃瓜亞硝酸鹽主效QTL連鎖的分子標記CSWTA17。
2.權利要求1所述與黃瓜亞硝酸鹽主效QTL緊密連鎖的分子標記，其特徵在於用黃瓜葉片，採用引物CSWTA17進行PCR擴增，擴增在6 %的聚丙烯凝膠(100毫升聚丙烯凝膠含有 5. 7克丙烯醯胺，0. 3克雙丙醯胺)電泳上分離後，獲得分子標記，所得產物為198bp。
3.如權利1和2所述的分子標記的應用，其特徵在於a以D0327及其衍生品種或品係為父母本與其他黃瓜品種雜交並繁衍至F2以上， b對通過步驟a獲得的黃瓜單個植株，分離葉片DNA，檢測分離的DNA中是否存在與黃瓜亞硝酸鹽主效QTL緊密連鎖的分子標記，如果分子標記出現，則可預測黃瓜亞硝酸鹽在 2. 6mg · kg-1 以下。
4.根據權利3所述的分子標記的應用，其特徵在於將分子標記用於黃瓜品種或品系的基因檢測，以判斷該品種或品系的亞硝酸鹽是否在2. 6mg · kg-1以下。
5.根據權利3和4所述的分子標記的應用，其特徵在於所用D0327及其衍生品種或品系，是指以D0327為親本，通過常規雜交方法獲得的黃瓜品種或品系。
全文摘要
本發明是一種黃瓜亞硝酸鹽主效QTL緊密連鎖的分子標記方法，屬於黃瓜育種和分子生物學領域。將亞硝酸鹽含量低的黃瓜品種D0327(2.56mg·kg-1)作父本與亞硝酸鹽含量高的黃瓜品種1058(8.92mg·kg-1)作母本進行雜交，對F2的每個單株的基因型與每個單株的果實亞硝酸鹽數據進行遺傳連鎖分析，獲得與D0327亞硝酸鹽主效QTL緊密連鎖的分子標記CSWTA17。通過檢測D0327及其衍生品種(品系)的DNA是否含有分子標記CSWTA17，可預測亞硝酸鹽水平，從而加快低亞硝酸鹽黃瓜新品種的選育速度。
文檔編號C12N15/10GK102311949SQ20101022182
公開日2012年1月11日 申請日期2010年7月9日 優先權日2010年7月9日
發明者周秀豔, 王桂玲, 秦智偉 申請人:東北農業大學