一種固定化酒用酸性脲酶的製備方法及應用的製作方法
2023-07-20 09:18:16
專利名稱：一種固定化酒用酸性脲酶的製備方法及應用的製作方法
技術領域：
—種固定化酒用酸性脲酶的製備方法及應用，具體地說是將從腸桿菌9043(:12中分離純化的游離酶，經海藻酸鈉和氯化鈣包埋，殼聚糖吸附，微量戊二醛交聯，得固定化酒用酸性脲酶，屬於酶製劑、釀酒添加劑技術領域。
背景技術：
氨基甲酸乙酯(或稱尿烷，簡稱EC) ，2005年被國際癌症研究機構(InternationalAgency for Research on Cancer, IARC)劃入2B (對人有致癌嫌疑物質)組。其致癌機理通過對體內氨基甲酸乙酯的代謝途徑的研究可知有3種途徑第一超過90%的氨基甲酸乙酯可被分解為乙醇、氨和碳水化合物等(這種途徑是無毒性的)；第二約0.5%的氨基甲酸乙酯被細胞色素P450氧化成DNA加聚物，造成DNA雙鏈破壞，可導致癌變；第三種途徑較為普遍，即約0. 1 %的氨基甲酸乙酯被細胞色素P450氧化為N-羥基-氨基甲酸乙酯，後者能夠誘導Cu"調控的DNA損傷，這種損傷多發生於胸腺嘧啶(T)和胞嘧啶(C)的殘基上。大多數認為第三種途徑是氨基甲酸乙酯的主要致癌途徑。 國內外對酒中氨基甲酸乙酯的研究表明，酒中氨基甲酸乙酯形成的主要途徑為尿素途徑，我國黃酒及日本清酒中90%以上的氨基甲酸乙酯是來源於酒中所含尿素與乙醇的反應H2NC0NH2+C2H50H — C2H50C0NH2+NH3 而酒中尿素的主要來源為由微生物代謝產生，即由精氨酸代謝產生的尿素和原輔材料和釀造過程的培養液成分中所含的尿素。 在研究了影響氨基甲酸乙酯形成的因素後發現，尿素濃度、乙醇濃度等是最主要的因素。各國學者們對降低酒中氨基甲酸乙酯的方法進行了深入的研究，通過去除或降低酒中的尿素含量，可以達到控制氨基甲酸乙酯含量的目的。 向酒中添加酒用酸性脲酶可以降低尿素含量，但游離酶在溶液中不穩定，容易變性和失活，反應後酶難以分離回收，無法重複使用，利用固定化酶可避免以上的不足，擴大了酶的使用範圍和使用次數。將游離酶製成固定化酶，向酒中添加固定化酒用酸性脲酶不影響黃酒正常的生產工藝，在勾兌，澄清酒的過程中，添加固定化酒用酸性脲酶，就可以降低尿素含量，且固定化酒用酸性脲酶易於與酒分離，可以重複利用，減少酸性脲酶的用量。
我國是世界上年產酒量最大的國家，有著十分悠久的釀酒歷史，不僅產量大，而且品種多，許多產品在國際上享有較高的聲譽。我國的紹興黃酒在日本及東南亞擁有廣泛的市場，但在1987年，日本有關部門提出紹興黃酒中氨基甲酸乙酯含量超標(大於100 yg/L)，近年來，又在紹興黃酒出口貿易上遇到了氨基甲酸乙酯的問題，為了降低酒中氨基甲酸乙酯的含量，紹興黃酒集團至今仍需從日本進口酒用酸性脲酶。因此，為了人民的身體健康，也為了能更多的出口創匯，研究和生產我國自己的酒用酸性脲酶已成為當務之急。
發明內容
本發明的目的是提供一種固定化酒用酸性脲酶的製備方法，將從腸桿菌9043C12 中分離純化的游離酶，經海藻酸鈉和氯化鈣包埋，殼聚糖吸附，微量戊二醛交聯，得固定化 酒用酸性脲酶，該固定化酸性脲酶的最適溫度為40°C ，最適pH為4，貯存半衰期為71天；本 發明還涉及這種固定化酒用酸性脲酶的應用，在黃酒中加入該固定化酒用酸性脲酶後尿素 去除率能達到80%左右，連續使用21次後，尿素去除率仍可達51.6%。本發明可以不改變 原釀造酒的工藝條件，不改變酒的風味，且固定化酒用酸性脲酶可以重複利用，是目前較為 理想的去除酒中尿素的方法。 本發明的技術方案一種固定化酒用酸性脲酶的製備方法，將從腸桿菌9043C12中 分離純化的游離酶，經海藻酸鈉和氯化鈣包埋，殼聚糖吸附，微量戊二醛交聯，得固定化酒 用酸性脲酶，其工藝為
A、游離酶提取 (1)菌種採用腸桿菌(Enterobacter sp. )9043C12 ;中國專利ZL200610096635. 1
已公開。 (2)種子培養 種子培養基組成種子培養基以g/L計葡萄糖20，蛋白腖IO，牛肉膏IO，酵母膏 5， KH2P04 2， NaC15， NaAc 2，尿素5， pH7. 0 (用NaOH調pH);
培養條件接種量5%，35°。恆溫靜置培養16 18h ;
(3)發酵培養 發酵培養基組成以g/L計葡萄糖20，蛋白腖IO，牛肉膏5，酵母膏5， KH2P04 2，
NaCl 5， NaAc 2，尿素5，四水硫酸錳0. 05，六水硫酸鎳0. 05， pH5. 5 (HC1調pH); 發酵液培養條件接種量6%，35°。恆溫靜置培養28 32h ; (4)收集菌體將發酵液8000r/min、4t:離心10min後，棄上清，將菌體用去離子水
洗滌兩次，pH5. 5的檸檬酸一檸檬酸鈉緩衝液洗滌一次，每升發酵液離心後所得菌體復溶於
pH5. 5的35mL檸檬酸一檸檬酸鈉緩衝液中； (5)超聲波破碎超聲波功率300w，破碎時間10min，處理量35mL ;將破碎液於4°C 下13000r/min離心20min，收集上清液，即為游離酶酶液；
B、固定化過程 (1)將海藻酸鈉溶入游離酶酶液中，控制海藻酸鈉的質量/體積濃度達2%，充分
攪勻，4t:冷藏靜置至無氣泡； (2)用注射器將步驟(1)的含海藻酸鈉的游離酶酶液逐滴滴入其5倍體積的溶有 質量/體積濃度0. 25%殼聚糖和5%氯化鈣的溶液中，磁力攪拌3h，去離子水洗滌，去除遊 離殼聚糖和氯化鈣，瀝乾，得固定化小球； (3)將步驟(2)所得固定化小球置於體積濃度0. 1%戊二醛中，固定化小球質量/ 戊二醛體積控制為2g/mL，微波3min後，置於磁力攪拌器上磁力攪拌2. 5h，去離子水洗滌， 去除游離戊二醛，瀝乾，冷藏備用，得固定化酒用酸性脲酶。 製備的固定化酒用酸性脲酶的應用該固定化酸性脲酶的最適溫度為4(TC，最適 pH為4，貯存半衰期為71天； 在黃酒中加入該固定化酒用酸性脲酶後，加酶量固定化酶重量/黃酒體積為100g/L，在動態的條件下，溫度35°C ，作用時間18h，去除酒樣中80%的尿素，連續使用21次 後，尿素去除率達51.6%。 該固定化酒用酸性脲酶的性質最適溫度、最適pH及貯存半衰期的確定 在25-85t:範圍內，每隔5。C，分別測定酶活力，以最高酶活力為100%，計算相對
酶活力，最適溫度為40°C。 在不同pH條件下分別測定酶活，以最高酶活力為100X，計算相對酶活力，最適pH 為4。 將固定化酸性脲酶放於4t:冰箱內，每隔三天測定固定化酸性脲酶的酶活，貯存半 衰期為71天。 該固定化酒用酸性脲酶的應用 (1)在動態的條件下，溫度35t:左右，加酶量100g/L(固定化酶重量/黃酒體積)， 作用時間18小時，去除酒樣中80%左右的尿素。 (2)將50g固定化酸性脲酶置於柱子中，在恆流泵的帶動下，80mL黃酒以0. 5mL/ min的速度流過柱子，黃酒在柱子中循環一次後測定其尿素濃度，計算尿素去除率，首次使 用尿素去除率為83. 4%，然後再加入80mL的黃酒重複試驗，重複21次後尿素去除率為 51. 6%。 酶活測定方法 游離酶活測定方法採用靛酚藍反應(Berthelot reaction)比色法。 酶活力定義在常壓，37t:， pH5. 5條件下，每分鐘分解底物產生1 P mol氨為一個
酶活力單位。 固定化酶活測定方法 固定化酒用酸性脲酶活性的測定是測定固定化前酶的活性和固定化後上清液酶 的活性，然後計算固定化酶活性。 固定化酶活性=(固定化前酶的活性_固定化後上清液酶的活性)
尿素含量的測定方法二乙醯一肟法。
蛋白含量測定方法考馬斯亮藍G-250法。
戊二醛含量的測定紫外分光光度法。 本發明的有益效果游離酶的提取方法可以用工業生產方法代替，固定化酶的制 作過程可以用機器製作代替，實現工業化生產。該固定化酸性脲酶能在酒中穩定發揮作用， 尿素去除率高，在黃酒中加入固定化酒用酸性脲酶後尿素去除率能達到80%左右，且固定 化酒用酸性脲酶便於回收，可重複利用21次。本發明可以不改變原釀造酒的工藝條件，不 改變酒的風味，在勾兌，澄清酒的過程中，添加固定化酒用酸性脲酶，就可以降低尿素含量， 是目前較為理想的去除酒中尿素的方法。
圖1固定化酒用酸性脲酶製備工藝示意圖。
具體實施例方式
實施例1 :將2g海藻酸鈉溶於100mL游離酸性脲酶酶液中，用玻璃棒充分攪拌，攪勻後置於4t:冰箱中冷藏至溶液中無氣泡為止，用注射器逐滴滴入500mL溶有0. 25%殼 聚糖和5X氯化鈣的溶液中，置於磁力攪拌器上磁力攪拌3h，用去離子水充分洗滌，去除遊 離殼聚糖和氯化鈣，瀝乾，將固定化小球置於0. 1%戊二醛中，固定化小球質量/戊二醛體 積控制為2g/mL，微波3min後，置於磁力攪拌器上磁力攪拌2. 5h(用不透明容器蓋住，以防 戊二醛見光變色)，去離子水洗滌，去除游離戊二醛(紫外分光光度法檢測)，瀝乾，冷藏備 用，得固定化酒用酸性脲酶50. 31g，裝入流動裝置，在內徑2. 5cm，長20cm的柱子中，裝入 50. 31g固定化酒用酸性脲酶，調節流速為0. 5mL/min，使200mL的黃酒流過柱子，在每次循 環後測定黃酒中的尿素含量，計算出尿素去除率，在循環3次後尿素含量從23. 9mg/L降至 4. 82mg/L，尿素去除率為79.8%。 實施例2 :將3. 6g海藻酸鈉溶於180mL游離酸性脲酶酶液中，用玻璃棒充分攪拌， 攪勻後置於4t:冰箱中冷藏至溶液中無氣泡為止，用注射器逐滴滴入900mL溶有0. 25%殼 聚糖和5X氯化鈣的溶液中，置於磁力攪拌器上磁力攪拌3h，用去離子水充分洗滌，去除遊 離殼聚糖和氯化鈣，瀝乾，將固定化小球置於0. 1%戊二醛中，固定化小球質量/戊二醛體 積控制為2g/mL，微波3min後，置於磁力攪拌器上磁力攪拌2. 5h(用不透明容器蓋住，以防 戊二醛見光變色)，去離子水洗滌，去除游離戊二醛(紫外分光光度法檢測)，瀝乾，冷藏備 用，得固定化酒用酸性脲酶89. 58g，裝入流動裝置，在內徑3. 5cm，長30cm的柱子中，裝入 89. 58g固定化酒用酸性脲酶，調節流速為0. 5mL/min，使500mL的黃酒流過柱子，在每次循 環後測定黃酒中的尿素含量，計算出尿素去除率，在循環3次後尿素含量從24. 6mg/L降至 3. 96mg/L，尿素去除率為83. 9% 。 實施例3 :將2g海藻酸鈉溶於100mL游離酸性脲酶酶液中，用玻璃棒充分攪拌， 攪勻後置於4t:冰箱中冷藏至溶液中無氣泡為止，用注射器逐滴滴入500mL溶有0. 25%殼 聚糖和5X氯化鈣的溶液中，置於磁力攪拌器上磁力攪拌3h，用去離子水充分洗滌，去除遊 離殼聚糖和氯化鈣，瀝乾，將固定化小球置於O. 1%戊二醛中，固定化小球質量/戊二醛體 積控制為2g/mL，微波3min後，置於磁力攪拌器上磁力攪拌2. 5h(用不透明容器蓋住，以防 戊二醛見光變色)，去離子水洗滌，去除游離戊二醛(紫外分光光度法檢測)，瀝乾，冷藏備 用，得固定化酒用酸性脲酶50. 56g，裝入流動裝置，在內徑2. 5cm，長20cm的柱子中，裝入 50. 56g固定化酒用酸性脲酶，使80mL黃酒以0. 5mL/min的速度流過柱子，黃酒在柱子中循 環一次後測定其尿素濃度，計算其尿素去除率，首次使用尿素去除率為83.4%，然後再加入 80mL的黃酒重複試驗。重複21次後尿素去除率為51. 6% 。
權利要求
一種固定化酒用酸性脲酶的製備方法，其特徵為將從腸桿菌9043C12中分離純化的游離酶，經海藻酸鈉和氯化鈣包埋，殼聚糖吸附，微量戊二醛交聯，得固定化酒用酸性脲酶，其工藝為A、游離酶提取(1)菌種採用腸桿菌(Enterobacter sp.)9043C12；(2)種子培養種子培養基組成種子培養基以g/L計葡萄糖20，蛋白腖10，牛肉膏10，酵母膏5，KH2PO4 2，NaCl 5，NaAc 2，尿素5，pH7.0；培養條件接種量5％，35℃恆溫靜置培養16～18h；(3)發酵培養發酵培養基組成以g/L計葡萄糖20，蛋白腖10，牛肉膏5，酵母膏5，KH2PO42，NaCl 5，NaAc 2，尿素5，四水硫酸錳0.05，六水硫酸鎳0.05，pH5.5；發酵液培養條件接種量6％，35℃恆溫靜置培養28～32h；(4)收集菌體將發酵液8000r/min、4℃離心10min後，棄上清，將菌體用去離子水洗滌兩次，pH5.5的檸檬酸-檸檬酸鈉緩衝液洗滌一次，每升發酵液離心後所得菌體復溶於pH5.5的35mL檸檬酸-檸檬酸鈉緩衝液中；(5)超聲波破碎超聲波功率300w，破碎時間10min，處理量35mL；將破碎液於4℃下13000r/min離心20min，收集上清液，即為游離酶酶液；B、固定化過程(1)將海藻酸鈉溶入游離酶酶液中，控制海藻酸鈉的質量/體積濃度達2％，充分攪勻，4℃冷藏靜置至無氣泡；(2)用注射器將步驟(1)的含海藻酸鈉的游離酶酶液逐滴滴入其5倍體積的溶有質量/體積濃度0.25％殼聚糖和5％氯化鈣的溶液中，磁力攪拌3h，去離子水洗滌，去除游離殼聚糖和氯化鈣，瀝乾，得固定化小球；(3)將步驟(2)所得固定化小球置於體積濃度0.1％戊二醛中，固定化小球質量/戊二醛體積控制為2g/mL，微波3min後，置於磁力攪拌器上磁力攪拌2.5h，去離子水洗滌，去除游離戊二醛，瀝乾，冷藏備用，得固定化酒用酸性脲酶。
2. 用權利要求l方法製備的固定化酒用酸性脲酶的應用其特徵是該固定化酸性脲酶 的最適溫度為4(TC，最適pH為4，貯存半衰期為71天；在黃酒中加入該固定化酒用酸性脲酶後，加酶量固定化酶重量/黃酒體積為100g/L， 在動態的條件下，溫度35°C ，作用時間18h，去除酒樣中80%的尿素，連續使用21次後，尿素 去除率達51.6%。
全文摘要
一種固定化酒用酸性脲酶的製備方法及應用，屬於酶製劑、釀酒添加劑技術領域。本發明涉及將從腸桿菌9043C12中分離純化的游離酶，經海藻酸鈉和氯化鈣包埋，殼聚糖吸附，微量戊二醛交聯，得固定化酒用酸性脲酶，該固定化酸性脲酶的最適溫度為40℃，最適pH為4，貯存半衰期為71天；本發明還涉及這種固定化酒用酸性脲酶的應用，在黃酒中加入該固定化酒用酸性脲酶後尿素去除率能達到80％左右，連續使用21次後，尿素去除率可達51.6％。本發明可以不改變原釀造酒的工藝條件，不改變酒的風味，且固定化酒用酸性脲酶可以重複利用，是目前較為理想的去除酒中尿素的方法。
文檔編號C12N11/10GK101705221SQ200910233289
公開日2010年5月12日 申請日期2009年11月23日 優先權日2009年11月23日
發明者呂園園, 吳召慧, 田亞平 申請人:江南大學