一種聚乙二醇-乳糖酸修飾的氨基化鋰皂石納米顆粒及其製備和應用的製作方法

2023-08-11 12:50:41

一種聚乙二醇-乳糖酸修飾的氨基化鋰皂石納米顆粒及其製備和應用的製作方法
【專利摘要】本發明涉及一種聚乙二醇-乳糖酸修飾的氨基化鋰皂石納米顆粒及其製備和應用，包括：(1)用一端是氨基另一端是羧基的聚乙二醇與乳糖酸反應，得到聚乙二醇化乳糖酸；(2)用（3-氨基丙基）二甲基乙氧基矽烷修飾在鋰皂石使其表面帶有一定數量的氨基；（3)用聚乙二醇化乳糖酸修飾納米粘土鋰皂石，得到乳糖酸修飾的功能化鋰阜石納米複合材料；該材料可用於製備具有乳糖酸靶向功能的納米載藥體系。本發明不僅提高了納米顆粒的穩定性和生物相容性，而且對去唾液酸糖蛋白受體高表達的肝癌細胞具有特異性的靶向作用，因此合成的納米載藥複合材料可應用於_巴向輸送抗癌藥物。本發明的製備方法簡單，反應條件溫和，易於操作，具有產業化實施的前景。
【專利說明】一種聚乙二醇-乳糖酸修飾的氨基化鋰皂石納米顆粒及其 製備和應用

【技術領域】
[0001] 本發明屬於納米載藥材料及其製備和應用領域，特別涉及一種聚乙二醇-乳糖酸 修飾的氨基化鋰皂石納米顆粒及其製備和應用。

【背景技術】
[0002] -直以來，腫瘤都是危害人類生命的頭號殺手，腫瘤具有死亡率高、難治療以及惡 化迅速等特點。據世界衛生組織報告，每年全球癌症新發病例1000多萬，死亡700多萬，佔 總死亡人數的12%。腫瘤已經成為困擾人類健康的一大難題。隨著社會生產力的發展與社 會的進步，人類對於治癒惡性腫瘤的要求更加迫切；雖然治療腫瘤的藥物很多，但是許多藥 物都或多或少存在缺陷，最明顯的是藥物作用周期短和藥物不能特異性地作用於腫瘤細胞 這兩個問題。因此，尋找一種能夠使藥物緩慢釋放並且靶向作用於腫瘤細胞的藥物輸送系 統顯得尤為重要。
[0003] 理想的藥物載體應具有很好的生物相容性、生物可降解性、理化及生物穩定性和 較高的藥物負載能力。近年來隨著藥物載體研究的不斷發展，具有良好吸附性能、無毒、生 物相容性好的無機材料已經成為藥物載體的研究熱點。天然粘土礦物鋰阜石（laponite, 簡稱LAP)就是其中之一。鋰皂石是屬於蒙皂石族的一種礦物，分散在水中能形成扁平狀晶 體。鋰皂石具有特殊空間夾層結構並且表面帶有大量的負電荷，可以有效地包載藥物，在疏 水性藥物依曲康唑、抗腫瘤藥物阿黴素等的負載與輸送中體現了優勢。
[0004] 但是，尋找合適的載體還遠遠不夠，許多抗癌藥物不能穿過細胞膜，即使藥物載體 將藥物載至腫瘤細胞表面，仍缺乏有效的內化機制。隨著對腫瘤細胞研究的深入，研究者發 現腫瘤細胞具有一系列過量表達的受體，可將與受體相關的配體或抗體連接在藥物或藥物 載體表面，通過受體介導的內吞作用將所載藥物靶向轉運到特定的組織和腫瘤細胞，這個 方法的特異性和對腫瘤細胞的親和性都非常高，大大提高了藥物的靶向性和轉運效率。
[0005] 去唾液酸糖蛋白受體（Asialo-glycoprotein receptors，ASGPR)是一種藥物投遞 系統的靶點。ASGPR在人肝癌細胞表面大量存在，並能夠特異性識別含有半乳糖基寡糖或半 乳糖化的載體，並與之穩定結合利於細胞內吞。乳糖酸（LA, Lactobionic acid)在化學結 構上具有半乳糖的結構，修飾到納米載體表面後能夠通過LA上半乳糖殘基與肝癌細胞表 面的ASGPR受體的相互作用實現靶向性輸送。聚乙二醇（PEG)是一種具有良好生物相容性 的鏈狀聚合物，修飾到納米材料表面能夠顯著提高材料在水中的穩定性與生物相容性。查 閱相關文獻可以發現，如果將靶向分子LA連結到PEG末端得到PEG-LA，然後再修飾到合適 的納米載體表面，不僅可以利用PEG分子鏈的修飾提高材料的穩定性，降低毒性，還能夠通 過LA增強藥物在腫瘤部位的富集，提高治療效果。
[0006] 因此，利用LAP的自身結構特點負載抗腫瘤藥物鹽酸阿黴素，再通過表面修飾 PEG-LA的方式賦予載體靶向性，將有望提高阿黴素的抗腫瘤效果、降低毒副作用，具有重要 的理論意義和實用價值。


【發明內容】

[0007] 本發明提供了一種聚乙二醇-乳糖酸修飾的氨基化鋰皂石納米顆粒及其製備和 應用，以克服現有技術存在的缺陷，滿足有關領域發展的需要。
[0008] 本發明所述的一種聚乙二醇-乳糖酸修飾的氨基化鋰皂石納米顆粒，其特徵 在於：所述的氨基化鋰皂石納米顆粒為（3_氨基丙基）二甲基乙氧基矽烷修飾的鋰皂 石；聚乙二醇-乳糖酸的質量分數在49. 17-51. 09%左右，聚乙二醇與乳糖酸的摩爾比為 1 : 0· 68-1 : 0· 76。
[0009] 本發明所述的一種聚乙二醇-乳糖酸修飾的氨基化鋰皂石納米顆粒用於抗腫瘤 藥物的負載，聚乙二醇-乳糖酸修飾的氨基化鋰皂石納米顆粒和阿黴素鹽酸鹽的質量比為 4 : 1-2 : 1，在此條件下藥物的負載效率為91. 3%。
[0010] 一種聚乙二醇-乳糖酸修飾的氨基化鋰皂石納米顆粒的製備方法，包括：
[0011] (1)用少量的溶劑溶解一定量的乳糖酸（LA)，加入一定量的活化劑活化羧基3h， 然後在攪拌的情況下逐滴加入一端是氨基另一端是羧基的聚乙二醇溶液，反應72h後，將 反應產物轉移到透析袋中，在磷酸鹽緩衝液和蒸餾水中分別透析共72h，冷凍乾燥得到聚乙 二醇化乳糖酸（LA-PEG-C00H);
[0012] (2)配置一定濃度的LAP分散液，取一定量的（3-氨基丙基）二甲基乙氧基矽烷逐 滴加入到LAP分散液中，然後50°C水浴中靜置16h，將反應產物轉移到透析袋中，在磷酸鹽 緩衝液和蒸餾水中分別透析共72h，製得氨基化的鋰皂石溶液（LM-NH 2)。
[0013] (3)取（1)中所得的LA-PEG-C00H配成一定濃度溶液，經活化劑活化過3h後，邊攪 拌邊逐滴加入步驟（2)所得一定濃度的LM-NH 2溶液中，反應72h後，將反應產物轉移到透 析袋中，在磷酸鹽緩衝液和蒸餾水中分別透析共72h，最後得到純化的聚乙二醇-乳糖酸修 飾的氨基化鋰皂石納米顆粒LM-PEG-LA ;
[0014] 步驟⑴中所述的溶解乳糖酸和⑶中聚乙二醇-乳糖酸的溶劑為pH = 6的磷 酸鹽緩衝液。
[0015] 所述步驟⑴中乳糖酸溶液濃度為6-8mg/mL。
[0016] 所述步驟（1)中的聚乙二醇PEG為NH2-PEG-C00H，分子量大小為2000。
[0017] 所述步驟⑴中得到的PEG-LA中PEG和LA的摩爾比為1 : 0. 68-1 : 0. 76。
[0018] 所述步驟⑴和步驟（3)中活化劑為1-乙基-(3-二甲基氨基丙基）碳醯二亞胺 (EDC)和N-羥基丁二醯亞胺（NHS)，步驟（1)中EDC、NHS與羧酸基團的摩爾比為1 : 1 : 1， 步驟（3)中EDC、NHS與羧酸基團的摩爾比為5 : 5 : 1-10 : 10 : 1。
[0019] 所述步驟（2)中鋰皂石納米顆粒的水溶液濃度為8-10mg/mL。鋰皂石和矽烷偶聯 劑的質量比2 : 1-3 : 1。
[0020] 所述步驟⑶中氨基化鋰皂石與聚乙二醇-乳糖酸的用量摩爾比為 1 : 1.25-1 : 1.5。
[0021] 所述步驟（3)中所得到的LM-PEG-LA中，PEG-LA的質量分數在49. 17-51. 09 %。
[0022] 所述步驟⑴和步驟⑶中所述的攪拌為磁力攪拌，攪拌速度為100-150r/min。
[0023] 所述步驟⑴中所述的透析袋截留分子量為1000。步驟（2)和步驟（3)中所述的 透析袋截留分子量為8000-14000。
[0024] -種聚乙二醇-乳糖酸修飾的氨基化鋰皂石納米顆粒的應用，其特徵在於：將阿 黴素（D0X)水溶液逐滴加入聚乙二醇-乳糖酸修飾的氨基化鋰皂石納米顆粒水溶液，攪拌 12_24h，離心，洗滌並分散，得到負載阿黴素的聚乙二醇-乳糖酸修飾的氨基化鋰皂石納米 顆粒 LM-PEG-LA/D0X。
[0025] 所述抗腫瘤藥物阿黴素的濃度為l_2mg/mL，聚乙二醇-乳糖酸修飾的氨基化鋰皂 石納米顆粒和阿黴素的質量比為4 : 1-2 : 1。
[0026] 藥物包裹所述攪拌為磁力攪拌，攪拌時間為12_24h攪拌速度為100-150r/min ;離 心的速率為5000r/min，離心的時間為lOmin。
[0027] 所得到的LM-PEG-LA/DOX中，LM-PEG-LA納米顆粒對D0X的負載效率為9L 3%。
[0028] 本發明採用矽烷偶聯劑修飾LAP表面得到氨基化的納米顆粒LM_NH2，再化學鍵合 PEG-LA得到了乳糖酸修飾的LM-PEG-LA。這一載體不僅可以通過乳糖酸的靶向作用被腫 瘤細胞主動攝取，同時引入的長鏈聚合物PEG可以延長載體在體內的循環時間，降低材料 毒性，提高材料穩定性，改善藥物釋放特性，並且可以有效減少乳糖酸與去唾液酸糖蛋白受 體結合時的空間位阻，提高LM-PEG-LA/DOX與去唾液酸糖蛋白受體表達的腫瘤細胞的親和 力。本發明的LM-PEG-LA載體用於抗腫瘤藥物負載，對去唾液酸糖蛋白受體高表達的腫瘤 細胞具有良好的靶向效果，可作為理想的靶向納米載體，實現藥物、基因或診斷分子探針的 負載與祀向輸送。
[0029] 本發明使用1Η核磁分析、紅外分析等方法表徵本發明製備的靶向修飾的鋰皂石納 米顆粒，紫外-可見光譜測試可以驗證藥物的成功負載。同時用ΜΤΤ細胞毒性法、流式細胞 術分析和雷射共聚焦顯微鏡來檢驗本發明的LM-PEG-LA/DOX對表面去唾液酸糖蛋白受體 表達的人肝癌細胞（HepG2細胞）的毒性與靶向性。具體測試結果如下：
[0030] (1)核磁分析
[0031] 附圖 1 中（a)，（b)和（c)分別為 PEG-LA、LM-mPEG 和 LM-PEG-LA 的1Η 核磁圖譜。 圖（a)中可以看出，在3. 5ppm處有較強的吸收峰為PEG中亞甲基的特徵峰，在3.6-4. 3ppm 處的一系列弱峰為LA的特徵峰，證明LA已經成功連接到PEG分子鏈上。通過積分可以算 出，連接上的PEG與LA的比值為1 : 0.72。在圖（b)與（c)中出現了在3. 5ppm處的吸收 峰，說明PEG已經連接到LAP表面。與圖（b)相比，圖（c)在3. 8ppm處的峰為LA的特徵峰， 證明PEG-LA已經成功修飾到了 LM-NH2表面。
[0032] (2)紅外分析
[0033] 在附圖2所示的紅外測試結果中，1260CHT1處為Si-Ο鍵的伸縮振動，證明矽烷偶聯 劑已成功修飾到LAP表面，製備得到了 LM-NH2。在PEG-LA的紅外光譜中，2884,1466,1341， 1282和1242CHT 1分別為PEG中CH2拉伸振動和亞甲基醚鍵的彎曲振動，在1148和1105CHT1 有一個強的振動峰，為C-0-C的特徵振動峰。在LM-PEG-LA中，在2880,1460和1097CHT1處 出現新的振動峰，為PEG分子鏈中-CH 2和C-0-C鍵的峰，證明PEG-LA已經接在了 LM-NH2上。
[0034] (3)紫外-可見光譜測試
[0035] 在附圖3所示的紫外-可見光譜測試結果中，載藥前LM-PEG-LA在200到800nm 波長範圍內均沒有明顯的吸收峰。在負載D0X之後，LM-PEG-LA/DOX材料在480nm附近顯 示出一個明顯的吸收峰。根據文獻報導，這個吸收峰為D0X的紫外特徵吸收峰。因此，表 面修飾的鋰皂石納米顆粒仍然能夠負載抗腫瘤藥物D0X。通過紫外定量分析，在投料比為 LM-PEG-LA : DOX = 3 : 1 的條件下，LM-PEG-LA 的載藥效率為 91. 3%。
[0036] (4)體外釋放試驗
[0037] 附圖4為LM-PEG-LA/D0X的體外累積釋放曲線。在100小時中，D0X在pH = 5. 4 的弱酸性環境中從LM-PEG-LA/D0X中累計釋放比在pH = 7. 4的中性環境中累計釋放量高。 這說明基於鋰皂石的載藥體系均具有pH響應性，即在與腫瘤組織類似的弱酸性環境中的 釋放速度快，累積釋放率高，而在正常組織的中性環境中釋放速度慢，累積釋放率低，說明 這一體系可以有效減少D0X在體內循環過程中在正常組織處的釋放，將藥物集中在腫瘤組 織部位釋放，減少了 D0X對正常組織的毒性，提高對腫瘤細胞惡性增殖的抑制效果。
[0038] (5) MTT細胞毒性試驗
[0039] 為評價載體的生物相容性，選擇人肝癌細胞Η印G2細胞作為模型，通過MTT比色法 測定Η印G2細胞與不同濃度的LM-PEG-LA和LM-mPEG納米顆粒共培養後的細胞活力，如圖 5 (a)。與PBS對照組相比，LM-PEG-LA和LM-mPEG在實驗濃度0. 5到64 μ g/mL範圍內對細 胞的存活率沒有顯著性差異（細胞存活率均在88%以上），表明材料具有良好的生物相容 性。為了驗證載藥納米顆粒的抗腫瘤效果，通過MTT比色法測定了與不同濃度的單純D0X， LM-PEG-LA/D0X和LM-mPEG/DOX共培養24h的Η印G2細胞的活力，如圖5 (b)。在相同的藥物 濃度條件下，經LM-PEG-LA/D0X處理的Η印G2的細胞活性明顯低於經純藥D0X和LM-mPEG/ D0X處理的細胞活性。這一結果表明本發明所述的靶向材料LM-PEG-LA/D0X具有良好的生 物相容性，並且表現出優於非靶向材料和裸藥的抗腫瘤效果。
[0040] (6)細胞吞噬實驗
[0041] !fepG2細胞經PBS、LM-PEG-LA/DOX和LM-mPEG/DOX處理後的共聚焦顯微鏡觀察，如 圖6。其中細胞核經染色顯示藍色螢光，D0X具有紅色螢光。對比LM-PEG-LA/D0X和LM-mPEG/ D0X處理的Η印G2細胞發現，乳糖酸修飾的材料具有更強的紅色螢光，表明LM-PEG-LA/D0X 更容易被ASGPR高表達的HepG2細胞攝取。！fepG2細胞經PBS、LM-PEG-LA/DOX和LM-mPEG/ D0X處理後的流式細胞儀檢測結果如圖7所示。！fepG2細胞分別經LM-PEG-LA/D0X和 LM-mPEG/DOX處理後，乳糖酸修飾的材料更容易被ASGPR高表達的Η印G2細胞攝取，其螢光 強度值明顯高於LM-mPEG/DOX處理後的Η印G2細胞。共聚焦顯微鏡觀察圖片和流式細胞儀 數據充分說明乳糖酸修飾的載體材料顯著提高藥物輸送體系的特異性結合能力，促進癌細 胞對載藥複合物的攝取，賦予了載藥體系主動靶向腫瘤的特性。
[0042] 綜上所述，本發明所述的LM-PEG-LA/D0X可以明顯提高腫瘤細胞對D0X的攝取，改 善了 D0X的抗癌效果，具有良好的應用前景。
[0043] 有益效果
[0044] (1)本發明的LM-PEG-FA/D0X載藥納米顆粒具有良好的藥物緩釋效果與pH響應性 釋放特性，對高葉酸受體表達的腫瘤細胞具有靶向性和明顯的抑制效果，可用於癌細胞的 靶向治療；
[0045] (2)本發明製備方法簡單，反應條件溫和，易於操作，具有產業化實施的前景。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0046] 圖 1 為（a) PEG-LA，（b) LM-mPEG 和（c) LM-PEG-LA 的1Η 核磁共振譜圖；
[0047] 圖 2 為 LM-NH2, LM-PEG-LA 和 PEG-LA 的紅外光譜圖；
[0048] 圖 3 為 LM-PEG-LA，D0X 和 LM-PEG-LA/D0X 的紫外吸收光譜圖；
[0049] 圖4為在不同pH條件下D0X從LM-PEG-LA/DOX中釋放的累積釋放曲線；
[0050] 圖5為MTT法測定的Η印G2細胞經不同濃度的LM-mPEG和LM-PEG-LA (a)，純D0X， LM-mPEG/DOX 和 LM-PEG-LA/DOX (b)處理 24h 後的細胞活力（*p <0· 05, #p <0· 005, ***p < 0. 001)；
[0051] 圖6為Η印G2細胞經PBS、LM-mPEG/DOX和LM-PEG-LA/DOX處理4h後的細胞內熒 光分布，其中材料中D0X濃度2 μ g/mL，細胞核用Hoechst 33342染成藍色；
[0052] 圖7為流式細胞術測定的經PBS、LM_mPEG/D0X和LM-PEG-LA/DOX處理4h後，！fepG2 細胞對D0X的吞噬情況（縱坐標為細胞內吞D0X後的平均螢光強度，與吞噬量成正比，*p < 0· 05, **p < 0· 005, ***p < 0· 001)。

【具體實施方式】
[0053] 下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明 而不用於限制本發明的範圍。此外應理解，在閱讀了本發明講授的內容之後，本領域技術人 員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定 的範圍。
[0054] 實施例1
[0055] (1)用20mL的pH = 6的緩衝溶液溶解32mg的乳糖酸（LA)(購於國藥集團化學試 劑有限公司），加入lmL濃度為16. 9mg/mL的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基）碳醯二亞胺 (EDC)攪拌0· 5h，然後加入lmL濃度為10. lmg/mL N-羥基丁二醯亞胺（NHS)活化3h，緩慢 加入含有2mL濃度為44. 20mg/mL的NH2-PEG-C00H(MW = 2000)溶液，反應72h後，將反應 產物用1000的透析袋在磷酸鹽緩衝液中透析24h，然後再用蒸餾水透析48h，最後將純化的 產物冷凍乾燥得到乳糖酸修飾的聚乙二醇固體產物（LA-PEG-C00H);
[0056] (2)取一定質量的LAP粉末分散於一定體積的超純水中，製得濃度為10mg/mL的分 散液，取40 μ L (3-氨基丙基）二甲基乙氧基矽烷邊振蕩邊滴加入10mL LAP分散液中，然後 置於50°C水浴中16h，將反應產物用8000-14000透析袋在磷酸鹽緩衝液中透析24h，然後再 用蒸餾水透析48h，製得氨基化的鋰皂石（LM)溶液。
[0057] (3)稱取2mg的PEG-LA粉末溶於lmL的pH = 6緩衝溶液中，向其中加入lmL濃度 為2. 2mg/mL的EDC，攪拌均勻，然後加入lmL濃度為L 32mg/mL的NHS溶液，磁力攪拌3小 時。將活化後的PEG-LA溶液緩慢加入lmL濃度為4mg/mL的氨基化鋰皂石LM-NH 2水溶液 中，磁力攪拌反應3天。反應結束後，將反應液全部轉移到截留分子量大小為8000-14000 的透析袋中，在磷酸鹽緩衝液中透析24h，然後再用蒸餾水透析48h。透析結束後，將透析袋 內產品轉移到15mL離心管，4°C保存。
[0058] 實施例2
[0059] 配置濃度為lmg/mL的D0X水溶液，取2mL D0X水溶液加入到取2mL濃度為3mg/ mL的LM-PEG-LA水溶液中，在避光的條件下磁力攪拌反應24小時。反應結束後，將溶液轉 移到15mL離心管中，在轉速為5000rpm條件下離心（10min)，得到的沉澱用去離子水洗漆3 次，即可得到載藥納米顆粒LM-PEG-LA/DOX。
[0060] 實施例3
[0061] 將LM-PEG-LA/D0X分別用pH = 7· 4和pH = 5· 4的緩衝液配置成D0X濃度為lmg/ mL的溶液，取lmL上述溶液放入透析袋中，置於含有9mL的相同pH緩衝液中，放在37°C搖 床中振蕩。開始的12h內每隔2h取一次樣，以後每隔24h取一次樣。每次取透析袋外液體 lmL,再向透析袋外加入對應的緩衝溶液lmL。測量取出的透析液在480nm處的吸光度值，計 算得到體外不同pH條件下D0X從LM-PEG-LA/D0X中釋放的釋放曲線。（圖4)
[0062] 實施例4
[0063] 收集對數生長期Η印G2細胞，具體條件是：HepG2細胞採用DMEM培養基，培養基均 含10%胎牛血清，1%雙抗。培養箱溫度為37°C，二氧化碳濃度為5%。取配製一定濃度的 PBS溶液，並用紫外照射過夜殺菌。然後在超淨工作檯用新鮮培養基配製濃度分別為0. 5、 1、2、4、8、16、32和64 μ g/mL的LM-PEG-LA和LM-mPEG納米顆粒懸浮液。！fepG2細胞種植於 96孔板後分別與含有LM-PEG-LA和LM-mPEG納米顆粒的新鮮培養基（濃度為0. 5、1、2、4、8、 16、32和64μ g/mL)在37°C下共培養24h。然後，向培養板孔中加入20μ L MTT(5mg/mL)，繼 續在37°C下培養4h後，棄去培養液，並加入200 μ L DMS0,振蕩15分鐘使結晶體完全溶解 後，使用酶聯免疫檢測儀在570nm處測量各孔溶液的吸光值，並根據此值計算細胞的活力。 不同濃度的材料對細胞增殖的影響以緩衝液PBS為對照組進行比較。（圖5a)
[0064] 為了證明所合成的LM-PEG-LA/D0X複合物的抗腫瘤藥效僅和其所負載的抗腫瘤 藥物D0X相關，且具有靶向殺死細胞的能力。配製含不同的D0X濃度（0. 1，0.2,0.4,0.8， 1. 2,1. 6 和 2. 0 μ g/mL) LM-PEG-LA/D0X 和 LM-mPEG/DOX 的材料。！fepG2 細胞種植於 96 孔板 後分別與含有LM-PEG-LA/D0X和LM-mPEG/DOX納米顆粒的新鮮培養基（含D0X濃度分別為 0. 1，0. 2,0. 4,0. 8,1. 2,1. 6和2. 0μ g/mL.)在37°C下共培養24h。然後，向培養板孔中加 入20yL MTT(5mg/mL)，繼續在37°C下培養4h後，棄去培養液，並加入200yL DMS0,振蕩 15分鐘使結晶體完全溶解後，使用酶聯免疫檢測儀在570nm處測量各孔溶液的吸光值，並 根據此值計算細胞的活力。以緩衝液PBS為對照組進行比較不同濃度的材料對細胞增殖的 影響。（圖5b)
[0065] 實施例5
[0066] 收集對數生長期Η印G2細胞，將蓋玻片放置於12孔細胞培養板中並用新鮮DMEM 培養基浸泡12h，然後棄去培養基後每孔補充1. OmL新鮮培養基並接種5 X 104個Η印G2細 胞，過夜培養細胞，貼壁後棄去培養基，細胞再分別與含有PBS、材料LM-PEG-LA/D0X和對照 材料LM-mPEG/DOX (D0X濃度為2 μ g/mL)納米顆粒的培養基在37°C下共培養4h，接著用PBS 清洗三次，然後依次用2.5%戊二醛（0.511^)固定15分鐘、11〇吐68丨33343(0.81^)染色30 分鐘，最後將蓋玻片放置於載玻片上，通過油鏡（63 X)觀察細胞的形貌。（圖6)
[0067] 用新鮮細胞培養液分別將LM-PEG-LA/D0X和LM-mPEG/DOX配製成D0X濃度為1和 2 μ g/mL的兩種納米顆粒溶液。HepG2細胞先以2X 105/孔的密度種植於12孔板，過夜培養 細胞貼壁後，先棄掉培養液，然後細胞再分別與LM-PEG-LA/D0X和LM-mPEG/DOX納米顆粒的 培養基溶液在37°C下共培養4h，並且以PBS處理的細胞作為對照組。共培養後細胞用PBS 清洗三次，再用胰酶消化並離心，棄上清液，將細胞懸浮於lmL PBS中。通過流式細胞儀檢 測細胞吞噬納米顆粒後的平均螢光強度。（圖7)
【權利要求】
1. 一種聚乙二醇-乳糖酸修飾的氨基化鋰皂石納米顆粒，其特徵在於：所述的 氨基化鋰皂石納米顆粒為（3-氨基丙基）二甲基乙氧基矽烷修飾的鋰皂石，納米顆 粒中聚乙二醇-乳糖酸的質量分數在49. 17-51. 09%，聚乙二醇與乳糖酸的摩爾比為 1 : 0· 68-1 : 0· 76。
2. -種聚乙二醇-乳糖酸修飾的氨基化鋰皂石納米顆粒的製備方法，包括： (1) 用溶劑溶解乳糖酸LA，加入活化劑活化羧基2-4h，然後在攪拌的情況下逐滴加入 一端是氨基另一端是羧基的聚乙二醇溶液，反應70-74h後，透析，冷凍乾燥得到聚乙二醇 化乳糖酸LA-PEG-COOH ; (2) 配置LAP分散液，取（3-氨基丙基）二甲基乙氧基矽烷逐滴加入到LAP分散液中， 然後50°C水浴中靜置14-18h，透析，製得氨基化的鋰皂石溶液LM-NH 2 ; (3) 取（1)中所得的LA-PEG-COOH配成溶液，經活化劑活化過3h後，邊攪拌邊逐滴加入 步驟（2)所得LM-NH2溶液中，反應70-74h後，透析，最後得到純化的聚乙二醇-乳糖酸修 飾的氨基化鋰皂石納米顆粒LM-PEG-LA。
3. 根據權利要求2所述的一種聚乙二醇-乳糖酸修飾的氨基化鋰皂石納米顆粒的製備 方法，其特徵在於：步驟（1)中所述的溶解乳糖酸和（3)中聚乙二醇-乳糖酸的溶劑為pH =6的磷酸鹽緩衝液。
4. 根據權利要求2所述的一種聚乙二醇-乳糖酸修飾的氨基化鋰皂石納米顆粒的製備 方法，其特徵在於：步驟（1)中乳糖酸溶液濃度為6-8mg/mL。
5. 根據權利要求2所述的一種聚乙二醇-乳糖酸修飾的氨基化鋰皂石納米顆粒的制 備方法，其特徵在於：步驟（1)和步驟（3)中活化劑為1-乙基-(3-二甲基氨基丙基）碳 醯二亞胺（EDC)和N-羥基丁二醯亞胺（NHS)，步驟（1)中EDC、NHS與羧酸基團的摩爾比為 1 : 1 : 1，步驟（3)中EDC、NHS與羧酸基團的摩爾比5 : 5 : 1-10 : 10 : 1。
6. 根據權利要求2所述的一種聚乙二醇-乳糖酸修飾的氨基化鋰皂石納米顆粒的製備 方法，其特徵在於：步驟（2)中鋰皂石納米顆粒的水溶液濃度為8-10mg/mL，鋰皂石和矽烷 偶聯劑的質量比2 : 1-3 : 1。
7. 根據權利要求2所述的一種聚乙二醇-乳糖酸修飾的氨基化鋰皂石納米顆粒 的製備方法，其特徵在於：步驟（3)中氨基化鋰皂石與聚乙二醇-乳糖酸的摩爾比為 1 : 1.25-1 : 1.5。
8. 根據權利要求2所述的一種聚乙二醇-乳糖酸修飾的氨基化鋰皂石納米顆粒的製備 方法，其特徵在於：步驟（1)和步驟（3)中所述的攪拌為磁力攪拌，攪拌速度為100-1501·/ min〇
9. 根據權利要求2所述的一種聚乙二醇-乳糖酸修飾的氨基化鋰皂石納米顆粒的製備 方法，其特徵在於：步驟（1)中透析工藝為將反應產物轉移到透析袋中，在磷酸鹽緩衝液和 蒸餾水中分別透析共72h ;所述的透析袋截留分子量為1000,步驟（2)和步驟（3)中所述的 透析袋截留分子量為8000-14000。
10. 根據權利要求2所述的一種聚乙二醇-乳糖酸修飾的氨基化鋰皂石納米顆粒的應 用，其特徵在於：將阿黴素水（D0X)溶液逐滴加入聚乙二醇-乳糖酸修飾的氨基化鋰皂石納 米顆粒水溶液，攪拌12-24h，離心，洗滌並分散，得到負載阿黴素的聚乙二醇-乳糖酸修飾 的氨基化鋰皂石納米顆粒LM-PEG-LA/DOX。
11. 根據權利要求10所述的一種聚乙二醇-乳糖酸修飾的氨基化鋰皂石納米顆粒的應 用，其特徵在於：所述阿黴素的濃度為l-2mg/mL，聚乙二醇-乳糖酸修飾的氨基化鋰皂石納 米顆粒和阿黴素的質量比為4 : 1-2 : 1。
12. 根據權利要求10所述的一種聚乙二醇-乳糖酸修飾的氨基化鋰皂石納米顆粒的應 用，其特徵在於：所述攪拌為磁力攪拌，攪拌時間為12_24h，攪拌速度為100-150r/min ;離 心的速率為5000r/min，離心的時間為lOmin。
【文檔編號】A61K47/04GK104208703SQ201410437407
【公開日】2014年12月17日 申請日期:2014年8月29日 優先權日:2014年8月29日
【發明者】史向陽, 郭睿, 陳光祥 申請人:東華大學