鴨疫裡默氏桿菌GroEL蛋白單克隆抗體、雜交瘤細胞株及其應用的製作方法

2023-08-11 05:14:26

鴨疫裡默氏桿菌GroEL蛋白單克隆抗體、雜交瘤細胞株及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明提供了鴨疫裡默氏桿菌GroEL蛋白單克隆抗體、雜交瘤細胞株及其在免疫檢測試劑盒中的應用。本發明所述分泌鴨疫裡默氏桿菌GroEL單克隆抗體的雜交瘤細胞株，保藏編號為CGMCC8778。本發明所述的鴨疫裡默氏桿菌GroEL單克隆抗體具有良好的特異性，與禽致病性大腸桿菌，沙門氏菌和禽巴氏桿菌均無交叉反應性。而與鴨疫裡默氏桿菌血清1、2、10型菌株均有良好的反應性。本發明的免疫檢測試劑盒具有操作簡單、檢測快速靈敏、結果清楚、易於保存和判斷，且無需任何儀器設備等優點，對鴨疫裡默氏桿菌診斷起到輔助作用。
【專利說明】鴨疫裡默氏桿菌GroEL蛋白單克隆抗體、雜交瘤細胞株及其應用
【技術領域】
[0001]本發明屬於基因工程領域，具體地說，涉及鴨疫裡默氏桿菌GroEL蛋白單克隆抗體、雜交瘤細胞株及其在免疫檢測試劑盒中的應用。
【背景技術】
[0002]鴨疫裡默氏桿菌(Riemerella anatipestifer, RA)病是一種主要侵害鴨、火雞和其他鳥類的禽類接觸性傳染病，主要病理變化是纖維素性心包炎、肝周炎、氣囊炎、腦膜炎、乾酪樣輸卵管炎等，發病率高，病死率高，耐過鴨多成僵鴨，生長遲緩，造成的經濟損失重大，是目前危害禽類養殖業的主要傳染病之一。鴨疫裡默氏桿菌血清型複雜，迄今為止，已公認的有21個血清型(I~21型)，各血清型之間缺乏有效的交叉保護。我國該病的發展更是越來越複雜而且呈動態變化，這使得對該病的免疫預防與診斷困難極大。[0003]臨床上通常以病例特徵性的症狀和解剖的特徵病變進行診斷，但是該病與禽致病性大腸桿菌病和禽沙門氏菌病在臨床症狀和病理變化上很相似，很難進行鑑別診斷。病原菌的分離鑑定為該病的確診手段，但是其工作程序較為繁瑣。目前檢測鴨疫裡默氏桿菌的血清學方法有間接血凝試驗，平板凝集，試管凝集和瓊脂擴散試驗等。用裂解的全菌蛋白
[1]、提純的脂多糖[2]和外膜蛋白M作為包被抗原建立的ELISA方法能特異性檢測出鴨疫裡默氏桿菌抗體。檢測鴨疫裡默氏桿菌的分子生物學方法主要有基於該菌16S
OmpAte]的PCR方法，基於莢膜多糖基因序列的real-time PCRte]以及基於groEL的LAMPm方法等。但是這些方法都存在過程繁瑣、耗時長、不適合野外操作等缺點，因此需要建立一種快速靈敏特異性強的方法以滿足臨床快速檢測的需求。
[0004]膠體金免疫層析法(Immunochromatography Assay)始於上世紀90年代中期，是在免疫滲濾法的基礎上發展起來的。它是免疫親和技術、印跡技術、免疫標記技術和層析技術的組合。目前已得到了迅速發展，廣泛應用於免疫組織(或細胞)化學檢測和免疫學檢測領域，具有操作簡單、檢測快速靈敏、結果清楚、易於保存和判斷，且無需任何儀器設備等優點，適合於臨床的快速診斷和基層、農村等流行病學調查大規模應用。
[0005]本發明研究人員的前期研究表明GroEL蛋白是一種免疫原性蛋白，且在血清1、2、10型菌株中保守型良好[8]。GroEL是分子伴侶家族HSP60成員之一，為可溶性蛋白，單體分子量為60kDa左右，兩個由七個亞基組成的環疊加在一起形成十四聚體。GroEL蛋白具有重要的生理功能，在新生蛋白質的正確摺疊和組裝以及變性蛋白質的恢復過程中起重要作用。
[0006]本發明利用GroEL蛋白的單克隆抗體建立針對抗原檢測的免疫膠體金檢測試劑盒可滿足現場和生產實踐的需求，對該病的診斷提供快速有效的工具。

【發明內容】

[0007]本發明的目的在於提供一種能分泌鴨疫裡默氏桿菌GroEL蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞株。
[0008]本發明的另一目的在於提供一種鴨疫裡默氏桿菌GroEL蛋白單克隆抗體。
[0009]本發明的再一目的在於提供含有該單克隆抗體的免疫檢測試劑盒。
[0010]為實現上述目的，本發明採用如下技術方案:
[0011]本發明所述分泌針對鴨疫裡默氏桿菌GroEL蛋白的單克隆抗體的雜交瘤細胞株，命名為1G2F10 (鴨疫裡默氏桿菌GroEL蛋白的單克隆抗體細胞株)，已於2014年I月22日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址:北京市朝陽區北辰西路I號院3號)，其保藏編號為CGMCC8778。
[0012]本發明還提供一種由所述雜交瘤細胞株分泌的鴨疫裡默氏桿菌GroEL蛋白單克隆抗體。
[0013]本發明所述的鴨疫裡默氏桿菌GroEL蛋白單克隆抗體具有良好的特異性，與禽致病性大腸桿菌、沙門氏菌和禽巴氏桿菌均無交叉反應性，而與鴨疫裡默氏桿菌血清1、2、10型菌株均有良好的反應性。
[0014]本發明還提供包含所述的鴨疫裡默氏桿菌GroEL蛋白單克隆抗體的免疫檢測試劑盒。
[0015]本發明所述鴨疫裡默氏桿菌GroEL蛋白單克隆抗體在製備檢測鴨疫裡默氏桿菌的免疫檢測試劑盒中的應用。
`[0016]本發明採用純化鴨疫裡默氏桿菌GroEL蛋白單克隆抗體和羊抗鼠IgG分別固相於硝酸纖維素膜(NC膜)，結合膠體金標記的鴨疫裡默氏桿菌GroEL蛋白單克隆抗體，應用膜層析雙抗夾心法的原理檢測標本中鴨疫裡默氏桿菌。
[0017]本發明所述的免疫檢測試劑盒包含包被了鴨疫裡默氏桿菌GroEL蛋白單克隆抗體(檢測用，T線)和羊抗鼠IgG (質控用，C線)的硝酸纖維素膜和包被了膠體金標記的鴨疫裡默氏桿菌GroEL蛋白單克隆抗體的玻璃纖維素膜。
[0018]本發明還提供一種鴨疫裡默氏桿菌免疫檢測試劑盒在檢測鴨疫裡默氏桿菌中的應用。
[0019]本發明的試劑盒利用膠體金標記技術和膜層析技術，可用於外環境樣本中增菌後的快速篩查，為下一步的分離鑑定創造了有利條件，節省了大量人力物力，具有操作簡單、檢測快速靈敏、結果清楚、易於保存和判斷，且無需任何儀器設備等優點，對鴨疫裡默氏桿菌的快速診斷起到重要的輔助作用。
[0020]本發明所述分泌針對鴨疫裡默氏桿菌GroEL蛋白的單克隆抗體的雜交瘤細胞株，命名為1G2F10 (鴨疫裡默氏桿菌GroEL蛋白的單克隆抗體細胞株)，已於2014年I月22日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址:北京市朝陽區北辰西路I號院3號)，其保藏編號為CGMCC8778。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0021 ] 圖1:鴨疫裡默氏桿菌GroEL蛋白的原核表達及純化。M.ProteinRuler ；1.pET28a-GroEL 誘導全菌蛋白；2.pET28a_GroEL 超聲沉澱；3.pET28a_GroEL 超聲上清；
4.pET28a-GroEL重組蛋白純化；5.pET28a空質粒。
[0022]圖2:ffestern-blot鑑定單克隆抗體1G2F10的特異性。該單抗與RA血清I型菌株CH3、2型菌株NJ3、10型菌株HXb2發生特異性結合，在60kDa左右出現目的條帶；該單抗與禽致病性大腸桿菌Ol菌株APEC 01,02菌株DE14、018菌株CE66和078菌株DE48，以及沙門氏菌菌株CVCC1805、CAUOl 18和禽巴氏桿菌菌株CVCC493無反應性。
[0023]圖3a_3b:膠體金檢測試劑盒的特異性試驗。結果:3a為該試劑盒檢測鴨疫裡默氏桿菌血清型1、2、10、15和未定型菌株均為陽性結果，其中編號1-15為鴨疫裡默氏桿菌血清 I 型菌株，依次分別是 WJ4、CH3、CHl、CQl、CQ3、CQ4、CQ5、JY4、YXb 12、NN2、NJl、NJ4、YL4、YXbl4、NN4 ;編號16-27為鴨疫裡默氏桿菌血清2型菌株，依次分別是JY1、SC2、NJ3、Yb2、Th4、YXbl、NNl、NN5、⑶3、⑶4、⑶5、⑶7 ;編號28-30為鴨疫裡默氏桿菌血清10型菌株，依次分別是YXbl1、HXb2、YXLl ;編號31-32為鴨疫裡默氏桿菌血清15型菌株，依次分別是NN6、NN8 ;編號33-34為鴨疫裡默氏桿菌未定血清型菌株，依次分別是JY6、GD6。3b為該試劑盒檢測禽致病性大腸桿菌，沙門氏菌和禽致病性巴氏桿菌均為陰性結果，其中編號1-2為大腸桿菌01血清型菌株，分別為APEC 01、DE171 ;編號3_4為大腸桿菌02血清型菌株，分別為DE17、DE14 ;編號5為大腸桿菌018血清型菌株CE66 ;編號6_8為大腸桿菌078血清型菌株，分別為 DE25、DE40、DE48 ;編號 9_13 為沙門氏菌菌株 CVCC1805、CAU0118、ATCC14028、JXbl、SM63 ;編號14為禽致病性巴氏桿菌菌株CVCC493。
[0024]圖4:膠體金檢測試劑盒的敏感性試驗。檢測條1-6菌數分別為:IO8CFU、IO7CFU、IO6CFU、IO5CFU、IO4CFU 和 IO3CFU。
【具體實施方式】
[0025]以下結合具體實施例，進一步闡述本發明。這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件或按照製造廠商所建議的條件。除非另行定義，文中所使用的所有專業與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意義相同。
[0026]實施例1鴨疫裡默氏桿菌GroEL蛋白的克隆表達
[0027](1) groEL基因的擴增
[0028]根據所要擴增的片段，設計一對引物，引物兩端分別添加BamHI和SalI酶切位點和保護性鹼基，引物groEL Pl和P2可擴增鴨疫裡默氏桿菌groEL基因開放閱讀框(ORF)I, 629bp。(GenBank 登錄號為⑶060633.1)
[0029]引物序列分別為:
[0030]Pl:5』 -CAGGATCCATGGCAAAAGATATTAAATTTGATATA-3』
[0031]P2:5』 -CTGTCGACTTACATCATACCTGGCATTCC-3』
[0032](2) PCR 擴增
[0033]取PCR管，反應體系20 μ L: 2 XPrimeSTAR Max DNA Polymerase (高保真酶，寶生物工程有限公司提供)10 μ L，引物Pl和Ρ2( 10 μ Μ)各0.5 μ L、模板1.0 μ L、超純水12.0 μ L，混勻。放入PCR儀進行擴增，反應參數:95°C預變性5min ；95°C lmin，58°C 2min，72°C Imin，30 個循環；72°C IOmin0
[0034](3) PCR產物的回收和酶切
[0035]PCR產物在1%瓊脂糖凝膠電泳後，用GeneJET膠回收試劑盒(賽默飛世爾科技公司提供)回收目的片段，並以BamHI和SalI酶切2h，用GeneJET PCR產物純化試劑盒(賽默飛世爾科技公司提供)回收目的片段。
[0036](4)重組質粒的構建和鑑定
[0037]在含有50 μ g/mL的卡那抗性LB中接種攜帶pET28a ( + )空質粒的DH5 α大腸桿菌單菌落，37°C培養12h，以高純質粒小提試劑盒(天根生化科技有限公司提供)抽提製備，BamHI和SalI酶切後，用GeneJET膠回收試劑盒回收酶切產物。將片段雙酶切回收產物和空質粒雙酶切回收產物進行連接，並轉化感受態DH5a宿主菌。利用卡那抗性和限制性內切酶進行重組菌的篩選和鑑定。PCR鑑定獲得了 5株陽性克隆。
[0038](5)重組質粒的測序和序列分析
[0039]重組質粒送上海華津生物公司進行序列測定，以驗證其閱讀框架，並以DNAStar軟體進行同源性分析，結果表明所獲得的陽性克隆與目的序列同源性達到100%。
[0040](6)重組質粒在大腸桿菌中的表達和純化
[0041 ] 將重組表達載體pET28a-groEL轉入表達宿主菌BL21 (DE3)，37 °C振蕩培養至0D600 ^ 0.5，隨後加入lmmol/L IPTG進行誘導表達，37°C下振搖表達6 h，同時設置陰性對照。收集菌體後超聲處理，離心分離上清和包涵體，進行SDS-PAGE檢測重組蛋白GroEL的表達情況。可溶性表達的His-GroEL用His-Binding-Resin親和柱(上海悅克生物科技有限公司提供)進行純化，純化後用BCA法測定蛋白濃度，經測定重組蛋白的濃度為1.4mg/
mLo
[0042]結合圖1所示，重組His-GroEL蛋白在pET28a載體中成功表達，在60KDa左右出現目的條帶。菌體經超聲處理後的結果表明，重組蛋白主要存在上清中。融合蛋白帶有His標籤，利用親和層析柱進行純化，SDS-PAGE電泳顯示，純化蛋白顯示清晰的目的蛋白條帶，表明純化效果較好。`
[0043]實施例2:鴨疫裡默氏桿菌GroEL蛋白單克隆抗體細胞株的製備
[0044](I)動物免疫
[0045]取6-8周齡的BALB/c雌性小鼠(上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供)，將GroEL重組蛋白與等體積的福氏完全佐劑(Sigma-Aldrich西格瑪奧德裡奇)進行乳化後，按100 μ g/只的劑量在小鼠背部和腹部皮下多點注射，進行首免；以後每隔2周用福氏不完全佐劑(Sigma-Aldrich)加等體積的GroEL重組蛋白乳化後加強免疫，劑量、方法、途徑同首免；經3次加強免疫後，從小鼠尾靜脈取血，用間接ELISA法檢測血清的抗體效價。選擇血清效價最高的小鼠，腹腔注射重組蛋白IOOyg/只，不添加佐劑，3天後取脾細胞進行細胞融合。
[0046](2)單克隆抗體細胞株的製備及篩選
[0047]超免疫後第3天進行融合。取免疫小鼠脾細胞與骨髓瘤細胞SP2/0混合，離心後棄上清，敲擊至管底，45秒內加入ImL聚乙二醇(Sigma-Aldrich),然後逐滴加入10mL1640培養基(Hyclone)進行中止，37°C水浴15min。用含有飼養細胞的次黃嘌呤-氨基蝶呤-胸苷培養基(hypoxanthine-aminopterin-thymidine (HAT,次黃嘌呤-氨基蝶呤-胸苷培養基)(Sigma-Aldrich)培養液將細胞重懸，混勻後以100 μ L/孔加入到96孔細胞培養板中，置於CO2培養箱中培養。5天後每孔補加100 μ L的HAT培養液，8-10天後待融合細胞集落長至培養孔1/4時，完全吸取細胞培養上清，用純化GroEL重組蛋白包被的ELISA板(5 μ g/mL, IOOul/孔)進行間接ELISA檢測，篩選出陽性克隆，同時加入200 μ L次黃嘌呤-胸苷培養基(hypoxanthine-thymidine, HT) (Sigma-Aldrich)培養液繼續培養,用有限稀釋法進行亞克隆篩選，直至100%陽性。
[0048]最終獲得一株穩定分泌抗體的細胞，命名為1G2F10 (鴨疫裡默氏桿菌GroEL蛋白的單克隆抗體細胞株)，已於2014年I月22日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址:北京市朝陽區北辰西路I號院3號)，其保藏編號為CGMCC8778。
[0049]實施例3:抗鴨疫裡默氏桿菌GroEL蛋白單克隆抗體的生物學特性研究
[0050](I)雜交瘤細胞株的穩定性測定
[0051]將雜交瘤細胞株1G2F10在相同的操作下連續傳30代，進行間接ELISA試驗，測定其每代細胞培養上清效價，結果表明其每代細胞上清效價基本一致；將雜交瘤細胞株1G2F10凍存於液氮中，分別在3個月、6個月和12個月後取出凍存的雜交瘤細胞株復甦，擴大培養後製備腹水，進行間接ELISA檢測，結果表明單抗的腹水效價基本一致，表明該雜交瘤細胞株穩定性良好。
[0052](2)單克隆抗體腹水的製備及效價測定
[0053]取10周齡BALB/c雌性小鼠，腹腔注射液體石蠟0.3mL/只，10天後腹腔接種用無抗生素無血清的RPMI1640培養基(Hyclone)稀釋的雜交瘤細胞，每隻5X 105/0.2mL。間隔5天後，觀察小鼠狀態，如腹部明顯膨大，即可收集腹水。採用間接ELISA法測定腹水單抗效價，細胞株1G2F10的腹水效價達到2.5X 104。
[0054](3) Ig類及亞類測定
[0055]採用小鼠單克隆抗體分型試劑盒SBA Clonotyping? System/HRP(SouthernBiotech)測定獲得`的GroEL單克隆抗體Ig亞類，操作過程嚴格依照試劑盒說明書，細胞株1G2F10的亞類為IgGl。
[0056](4)單克隆抗體的特異性鑑定
[0057]採用免疫印跡法(Western Bloting)鑑定抗體特異性。以鴨疫裡默氏桿菌血清I型CH3菌株、血清2型NJ3菌株和血清10型HXb2菌株[9]的全菌蛋白進行SDS-PAGE電泳，200V,60min,待溴酹藍指示劑到達膠板下緣時停止電泳,利用Trans-Blot轉印槽進行溼轉印，轉印條件為100V、90min，將蛋白轉移至NC膜上。轉印結束後將NC膜用含有5%的脫脂乳PBS封閉兩個小時，PBST洗滌3次，每次5min。將腹水單抗做1:2000稀釋，孵育過夜，PBST洗滌5次，每次5min。然後再與1:5000稀釋的HRP標記的山羊抗小鼠IgG (北京康為世紀生物科技有限公司提供)室溫孵育2h，PBST洗滌5次，每次5min。加DAB底物顯色液進行顯色。同時對禽致病性大腸桿菌01 (APEC 01) [1°]、02(DE14)、018(CE66)和078ΦΕ48)菌株[11]，沙門氏菌(CVCC1805，CAUO118)和禽巴氏桿菌(CVCC493)的全菌蛋白進行檢測。
[0058]如圖2所示，該單抗與鴨疫裡默氏桿菌血清I型菌株CH3、2型菌株NJ3、10型菌株HXb2發生特異性結合，在60kDa左右出現目的條帶；該單抗與禽致病性大腸桿菌01菌株APEC 01、02 菌株 DE14、018 菌株 CE66 和 078 菌株 DE48，沙門氏菌菌株 CVCC1805、CAUOl 18和禽巴氏桿菌菌株CVCC493無反應性。
[0059](5)單克隆抗體的純化
[0060]使用HiTrap Protein G HP(GE Healthcare Life Sciences)親和層析方法對單克隆抗體腹水進行純化，操作過程嚴格依照試劑盒說明書。
[0061]實施例4:鴨疫裡默氏桿菌膠體金檢測試劑盒的研製[0062](I)膠體金-鴨疫裡默氏桿菌GroEL蛋白單克隆抗體結合物的製備
[0063]經實驗確定，鴨疫裡默氏桿菌GroEL蛋白單克隆抗體標記膠體金的最適結合pH為
8.1，最適標記的抗體終濃度為10yg/mL。標記膠體金溶液經穩定劑處理後，取膠體金-鴨疫裡默氏桿菌GroEL蛋白單克隆抗體結合物溶液，均勻吸附於玻璃纖維素膜上，37°C乾燥，備用。
[0064]( 2 )包被抗體於硝酸纖維素膜
[0065]將鴨疫裡默氏桿菌GroEL蛋白單克隆抗體用0.01M PBS稀釋成lmg/mL，同時將羊抗鼠IgG抗體(武漢博士德生物工程有限公司提供)用0.01M PBS稀釋成lmg/mL。用噴膜機將二者以I μ L/cm的速度噴於硝酸纖維素膜上，分別形成檢測線(T)和質控線(C)。兩條線之間的間隔為0.5cm。將包被了抗體的硝酸纖維素膜置於37°C乾燥，備用。
[0066](3)鴨疫裡默氏桿菌膠體金檢測試劑盒的組成
[0067]反應支持物為6.5cmX0.4cm的PVC板；吸水墊為2cmX0.4cm的濾油紙；l.ScmX0.4cm的硝酸纖維素膜包被了鴨疫裡默氏桿菌GroEL蛋白單克隆抗體和羊抗鼠IgG ；0.4cmX0.4cm的玻璃纖維素膜標記了鴨疫裡默氏桿菌GroEL蛋白單克隆抗體；樣品墊為6.5cmX0.4cm的濾紙纖維；即形成了鴨疫裡默氏桿菌膠體金檢測試劑盒。
[0068]( 4 )鴨疫裡默氏桿菌膠體金檢測試劑盒的特異性，敏感性和重複性
[0069]使用步驟3的檢測試劑盒進行實驗
[0070]特異性試驗:檢測鴨疫裡默氏桿菌菌株34株、大腸桿菌血清型01、02、018和078菌株8株、沙門氏菌菌株5株和禽致病性巴氏桿菌菌株I株，如圖3所示，結果，3a為該試劑盒檢測鴨疫裡默氏桿菌血清1、2、10、15和未定型菌株均為陽性結果，其中編號1-15為RA血清 I 型菌株，依次分別是 WJ4、CH3、CHl、CQl、CQ3、CQ4、CQ5、JY4、YXbl2、NN2、NJl、NJ4、YL4、YXbl4、NN4[7];編號 16-27 為 RA 血清 2 型菌株，依次分別是 JYl、SC2、NJ3、Yb2、Th4、YXbl、NNl、NN5、a)3、ffl)4、a)5、a)7[7];編號 28-30 為 RA 血清 10 型菌株，依次分別是 YXbl1、HXb2、YXLlm ;編號31-32為RA血清15型菌株，依次分別是NN6、NN8[7];編號33-34為RA未定血清型菌株，依次分別是JY6、GD6m。3b為該試劑盒檢測禽致病性大腸桿菌，沙門氏菌和禽致病性巴氏桿菌均為陰性結果，其中編號1-2為大腸桿菌01血清型菌株，分別為APEC
01、DE171[11];編號3-4為大腸桿菌02血清型菌株，分別為DE17[n]、DE14 ;編號5為大腸桿菌018血清型菌株CE66 ;編號6-8為大腸桿菌078血清型菌株，分別為DE25、DE40[n]、DE48 ；編號 9-13 為沙門氏菌菌株 CVCC1805、CAU0118、ATCC14028、JXbl、SM63[9];編號 14 為禽致病性巴氏桿菌菌株CVCC493。
[0071]結果表明，本品均能與鴨疫裡默氏桿菌菌株形成陽性反應，而與其他菌株形成陰性反應，說明本品特異性良好。
[0072]敏感性試驗:用PBS將鴨疫裡默氏桿菌CH3菌株進行10倍倍比稀釋後進行敏感性檢測。
[0073]如圖4 所示，檢測條 1-6 菌數分別為:IO8CFU、IO7CFU、IO6CFU、IO5CFU、IO4CFU 和IO3CFU。
[0074]檢測結果表明，本品最低檢出量為1X106CFU。
[0075]重複性試驗:分別在不同時間、由不同人員操作進行10次檢測。結果表明本發明試劑盒重複性良好。[0076]本發明的範圍不受所述具體實施方案的限制，所述實施方案只作為闡明本發明各個方面的單個例子，本發明範圍內還包括功能等同的方法和組分。實際上，除了本文所述的內容外，本領域技術人員參照上文的描述和附圖可以容易地掌握對本發明的多種改進。所述改進也落入所附權利要求書的範圍之內。上文提及的每篇參考文獻皆全文列入本文作為參考。
[0077]參考文獻:
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[0089]本發明的範圍不受所述具體實施方案的限制，所述實施方案只作為闡明本發明各個方面的單個例子，本發明範圍內還包括功能等同的方法和組分。實際上，除了本文所述的內容外，本領域技術人員參照上文的描述和附圖可以容易地掌握對本發明的多種改進。所述改進也落入所附權利要求書的範圍之內。
【權利要求】
1.一種分泌針對鴨疫裡默氏桿菌GroEL蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞株，其保藏號為CGMCC8778。
2.一種由權利要求1所述雜交瘤細胞株分泌的鴨疫裡默氏桿菌GroEL蛋白單克隆抗體。
3.一種運用鴨疫裡默氏桿菌GroEL蛋白單克隆抗體檢測鴨疫裡默氏桿菌的免疫檢測試劑盒，其特徵在於，包含權利要求2所述的單克隆抗體。
4.根據權利要求3所述的免疫檢測試劑盒，其特徵在於，包含包被了鴨疫裡默氏桿菌GroEL蛋白單克隆抗體和羊抗鼠IgG的硝酸纖維素膜和包被了膠體金標記的鴨疫裡默氏桿菌GroEL蛋白單克隆抗體的玻璃纖維素膜。
5.權利要求2所述單克隆抗體在製備檢測鴨疫裡默氏桿菌的免疫檢測試劑盒產品中的應用。`
【文檔編號】C12N5/20GK103820395SQ201410088918
【公開日】2014年5月28日 申請日期:2014年3月12日 優先權日:2014年3月12日
【發明者】於聖青, 侯灣灣, 王少輝, 王小蘭, 韓先幹, 丁鏟, 王權, 蔣蔚, 嶽嘉蘋 申請人:中國農業科學院上海獸醫研究所