一種哺乳動物通用的免疫避孕靶標及其特異性抗體的製作方法

2023-08-11 05:44:01 1

專利名稱：：一種哺乳動物通用的免疫避孕靶標及其特異性抗體的製作方法
技術領域：
：本發明屬於生物
技術領域：
，更具體地，本發明涉及一種哺乳動物通用的免疫避孕靶標及其特異性抗體。我國作為發展中的人口大國，人口數量和質量的控制等生殖健康是關係國計民生的大事。在過去的幾十年中，還沒有出現可與女性口服避孕藥相比的男用藥品。儘管女用避孕藥減緩了人口的增長，但其副作用及遠期安全性還有待改進。許多婦女不願採用荷爾蒙藥物，生殖道內置器械和埋植物，因此在方法可能的條件下，男性將為減緩人口增長承擔更多的責任和風險。近年以來，儘管在男性避孕方面開展了一些研究，除了傳統的體外排精，保險套和結紮手術，還沒有更加通用的方法出現。最近通過荷爾蒙可逆地抑制男性精子生成的避孕方法被認為可在預期(24個月)內完全恢復精子數量，但荷爾蒙對包括心血管和前列腺等的副作用仍值得關注。|3-防禦素(beta-defensin)家族是近年來發現的參與天然免疫和其它生理過程及疾病的具有多種生物學功能的多肽家族。作為抗菌肽，P-防禦素具有與傳統抗生素不同的廣譜抗菌機理。防禦素可以結合到細菌細胞膜，造成膜滲漏，導致細菌死亡。由於細菌細胞膜的複雜性，相對傳統抗生物而言，細菌不容易進化出對防禦素的抗性，因而在利用防禦素對付抗生素耐藥菌方面得到了大量的關注。最近有報導(http:〃technology.newscientist.com/channel/tech/dnl3924_manmade_defensin_rips_resistant_bacteria-即art.htmlfeedld=online-news_rss20)稱第一個基於防禦素的人造抗生素藥物已經進入了臨床研究。顯然，這對於解決越來越嚴重的抗生素耐藥菌和醫院感染問題是個極好的消息，也使本發明人認識到新型天然防禦素的基礎研究對於新型抗生素類藥物研究|3-防禦素也是聯繫天然免疫和適應性免疫的樞紐，與趨化因子(chemokines)具有功能上的重疊，起到了調節天然免疫和適應性免疫的作用。此外，P-防禦素還具有多種生物學功能，包括參與腫瘤的血管生成、抗愛滋病毒、腫瘤抑制和抗白血病，以及參與精子的運動起始和成熟、保護、獲能和抗免疫識別等等。已有研究發現，小鼠P-防禦素-6的高表達，可引起肌肉退行性病變，這就把機體的天然免疫系統和退行性疾病病理學研究聯繫了起來；而狗P_防禦素_103(CBD103)可與Mclr(melanocortinrec印tors)高親和地結合，與動物毛色的確定有關。特別是，已有研究證實，人P-防禦素-l(HBDl)的低表達則與口腔鱗狀細胞癌、腎癌和前列腺癌的發生、發展過程有關。同時，令人感興趣的是，附睪組織中有豐富的P-防禦素，而臨床上也極少發現附睪原發性的腺癌發生，而且轉移到附睪的癌也極為罕見，提示其不僅具有抗菌作用，也可能有抗惡性腫瘤作用。在大鼠、小鼠、犬、大猩猩和人類，迄今分別發現了43、52、43、37和39個P_防禦素基因，其中絕大多數都是功能未知的基因。幾乎所有的P_防禦素都優先在雄性生殖系統表達，尤其是在睪丸和附睪組織中表達，只有較少數量的P-防禦素在其它部位表達。附
背景技術：
：意義重大。睪組織中包含了幾乎所有的P-防禦素家族成員，並呈現多樣化的e-防禦素區段特異的表達模式，且大鼠和小鼠的13-防禦素家族附睪表達模式具有一定的保守性。由於附睪是雄性生殖系統一個重要的附屬性器官，它與精子成熟、儲存和保護等有密切的關係，本發明人早先根據e-防禦素在體內的表達特徵，可以將P-防禦素分為三類即雄性生殖系統特異表達的P-防禦素、附睪特異表達的e-防禦素和非特異廣泛表達的P-防禦素。Binlb(又被稱作spagll)基因是本發明人在大鼠附睪中克隆到的一個附睪特異表達的天然抗菌肽(LiP，C.H.，HeB，SoSC，ChungYW，ShangQ，ZhangYD，ZhangYL.，Anantimicrobialpeptidegenefoundinthemaler印roductivesystemofrats.Science,2001.291(5509):p.1783-5.)，論文發表在Science雜誌上並獲得了專利(中國專利ZL01105283.X，美國專利US6，887，981，B2)。後來的研究又發現Binb除具有抗菌肽的功能以外，還與起始精子運動相關，論文發表在NatureCellBiology(ZhouCX，ZhangYL，XiaoLetal.，An印ididymis—specificbeta—defensinisimportantfortheinitiationofspermmaturation.NatCellBiol.，2004.6(5):p.458—64.)，其能與附睪頭部的精子結合，通過L-型鈣通道啟動精子的運動，抑制binb表達可以使精子失去起始運動的能力，因而binb可以作為潛在的抗生殖道感染和男性避孕的靶標。因此，本領域還有必要基於此進行進一步的研究以期開發出有應用價值的藥物。
發明內容本發明的目的在於提供一種哺乳動物通用的免疫避孕靶標及其特異性抗體。在本發明的第一方面，提供一種分離的多肽，所述的多肽具有SEQIDNO:l所示的胺基酸序列；並且，所述的多肽來源於哺乳動物Binlb(或稱為SPAG11)蛋白，且由7_30個(較佳地7-20個；更佳地7-15個)胺基酸組成。在另一優選例中，所述的多肽具有SEQIDNO:2所示的胺基酸序列。在本發明的第二方面，提供所述的多肽的用途，用於製備特異性結合Binlb蛋白的抗體(包括單克隆抗體或多克隆抗體)。在本發明的第三方面，提供一種特異性結合Binlb蛋白的抗體，所述的抗體特異性識別Binlb蛋白上具有SEQIDNO:1所示的胺基酸序列的位點。在另一優選例中，所述的抗體由保藏號為CCTCC-C200847(rBinlblOA5，簡稱10A5)的雜交瘤細胞株產生。在本發明的第四方面，提供所述的抗體的用途，用於製備抑制哺乳動物精子運動的組合物。在另一優選例中，所述的組合物是避孕藥。在另一優選例中，所述的哺乳動物選自(但不限於)人、鼠、狗、貓、牛、豬、蝙蝠、猴、樹駒、馬、大象、松鼠、豚鼠、犰狳。在本發明的第五方面，提供一種用於抑制哺乳動物精子運動的組合物，所述的組合物包括(1)有效量的所述的抗體；禾口(2)藥學上可接受的載體。在本發明的第六方面，提供一種雜交瘤細胞株，所述的雜交瘤細胞株的保藏號為CCTCC-C200847。在本發明的第七方面，提供一種所述的抗體的用途，用於製備定性或定量檢測樣品中Binlb蛋白存在情況的試劑。在本發明的第八方面，提供一種非治療目的地抑制哺乳動物精子運動(如非治療目的的避孕)的方法，所述方法包括給予哺乳動物有效量的所述的抗體。在另一優選例中，所述的給予為外用塗抹。本發明的其它方面由於本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。圖1.免疫後的11隻小鼠的抗體滴度水平用間接ELISA檢測。縱坐標為滴度，橫坐標為免疫小鼠的編號。只有一隻小鼠(9號)到達較高滴度水平，用來進行細胞融合。圖2.用WesternBlot(左圖)和DotBlot(右圖)進行單克隆抗體的特異性檢驗。所用抗原為重組表達的雙拷貝串聯蛋白rBD14、rBD15、rBD42、rBD1、mBD15、mBD30;rBD14單和rBD15單分別為rBD14、rBD15的單體活性重組多肽。每泳道上樣量在2ng的蛋白水平，進行Westernblot(2ng/孔)，ECL顯色。把蛋白量提高到1Pg，進行Dotblot(liig/dot)試驗，單克隆抗體特異的識別rBinlb。所用單抗為10B4，一抗1:5000稀釋，二抗山羊抗鼠IgG-HRP1:1000稀釋。圖3.單抗10B4為例，Westernblot結果表明單抗特異識別附睪頭部精子上的rBinlb，而不識別精子上其它蛋白。rC即Sperm，rCorSperm，rCauSperm分別為等量的附睪頭部、體部和尾部精子蛋白。圖4.附睪頭部、體部和尾部精子免疫螢光實驗表明單抗比多抗血清更特異地識別附睪頭部精子上的rbinlb。單克隆抗體10B4隻與附睪頭部的精子rBinlb有反應，而不與體部和尾部的精子蛋白反應，與rBinlb在附睪頭部特異表達是一致的。圖5.粗篩抗原表位融合蛋白的重組表達和多抗血清的Westernblot鑑定。小鼠多抗血清與粗篩抗原表位Segl-Seg6表達菌裂解物進行westernblot，ECL顯色。多抗血清與seg2、3、4、5片段有免疫反應，表明抗原表位集中在這幾個片段內。C為載體對照，pre為誘導表達前的菌液，po為誘導後的菌液。圖6.四個單克隆抗體(3A1(圖C)、10A5(圖A)、10B4(圖B)、14F6(圖D))與粗篩表位序列1-6進行westernblot，ECL顯色。四個單克隆抗體(3A1，10A5，10B4，14F6)分別識別表位肽seg4&5、5、3、4&5。pre為誘導表達前的菌液，po為誘導後的菌液。pre為誘導表達前的菌液，po為誘導後的菌液，Control為載體對照。圖7.單克隆抗體10A5識別精細8肽表位的WesternBlot結果及8肽表位序列比對表明單克隆抗體10A5識別多肽表位DPWNRCC和SDPWNRCC，pre為誘導表達前的菌液，po為誘導後的菌液，C為空白載體對照。圖8.單克隆抗體3A1識別精細8肽表位的WesternBlot結果及8肽表位序列比對，結果3A1可識別SDPWNRCC和DPWNRCCV。pre為誘導表達前的菌液，po為誘導後的菌液。圖9.單克抗體10B4識別精細8肽表位的WesternBlot結果及8肽表位序列比對，表明單克隆抗體10B4識別表位序列RSGERKGD;pre為誘導表達前的菌液，post為誘導後的菌液。圖10.哺乳動物的spagll基因編碼的多肽成熟肽的序列比對。框圖表示單抗識別的共有多肽序列。左列為各哺乳類動物的縮寫。Hum為人類、Mou為小鼠、Rat為大鼠、Dog為狗、Cat為貓、Bul1為牛、Pig為豬、Bat為蝙蝠、Mac為猴、Shr為樹駒、Equ為馬、Ele為大象、Sqr為松鼠、GuiP為豚鼠、Arm為犰狳。單抗10A5和單抗3A1識別的表位序列SDPWNRCC在哺乳動物的spagll基因編碼的多肽(包括人類)中保守地存在。單抗10B4識別的表位序列只在大鼠和小鼠spagll基因編碼的多肽中保守地存在。具體實施例方式本發明人經過廣泛地研究，首次定位到了Binlb蛋白序列上一特定的抗原性表位，所述的抗原性表位在哺乳動物Binlb蛋白中保守地存在。因此，利用含有該表位的多肽(本發明中還稱為短肽)，可以製備出特異性抗Binlb蛋白的抗體，該抗體可識別多種哺乳動物體內的Binlb蛋白。並且，本發明人還篩選到了特異性結合該特定的抗原表位的單克隆抗體，所述的抗體結合特異性好，與其它蛋白沒有交叉反應，可非常顯著地抑制哺乳動物的精子活動，是一種哺乳動物通用型的抗Binlb蛋白抗體。如本文所用，"分離的"是指物質從其原始環境中分離出來(如果是天然的物質，原始環境即是天然環境)。如活體細胞內的天然狀態下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態中同存在的其他物質中分開，則為分離純化的。如本文所用，"SPAGll"蛋白、"Binlb"蛋白可互換使用，均是指存在於哺乳動物體內的、具有抗菌功能的一種蛋白，所述的蛋白與中國專利ZL01105283.X中所述的Binlb蛋白序列具有60%以上的同源性，較佳地具有70%以上的同源性，更佳地具有80%以上(如85%或90%或95%)的同源性。根據所提供的蛋白，可以方便地得知蛋白對於的基因序列。如本文所用，所述的"含有"，"具有"或"包括"包括了"包含"、"主要由......構成"、"基本上由......構成"、和"由......構成"；"主要由......構成"、"基本上由......構成"和"由......構成"屬於"含有"、"具有"或"包括"的下位概念。如本文所用，抗體的"特異性"是指抗體能結合於哺乳動物Binlb蛋白或片段。特別指那些能與哺乳動物Binlb蛋白結合但不識別和結合於其它非相關抗原分子的抗體。本發明中，所述的"哺乳動物"是任何具有Binlb蛋白(或稱為SPAG11蛋白)，且其Binlb蛋白中具有SEQIDN0:1或SEQIDNO:2所示的胺基酸序列的哺乳動物。例如，所述的哺乳動物選自(但不限於)人、鼠、狗、貓、牛、豬、蝙蝠、猴、樹駒、馬、大象、松鼠、豚鼠、犰狳。抗原表位已知Binlb蛋白能與附睪頭部的精子結合，通過L-型鈣通道啟動精子的運動，用抗體或RNAi等手段抑制Binlb表達可以使精子失去起始運動的能力(Zhou，C.X.等，An印ididymis—specificbeta—defensinisimportantfortheinitiationofspermmaturation.NatCellBiol，2004.6(5):p.458-64.)，因而Binlb可以作為抗生殖道感染和男性避孕的靶標。Binlb的表達是附睪特異的，有別於其它P-防禦素。基於以上論述，可以利用合適的抗Binlb抗體來與Binlb蛋白結合，抑制其與精子的結合，從而達到抑制精子運動的目的。—種抗原通常含有多個抗原表位(抗原決定簇)，因此，針對同一個抗原可以獲得不止一個抗體，這些抗體對抗原的結合特性(如特異性等)均可能是不同的。針對同一個抗原，本領域人員需要進行大量的反覆比較、篩選和鑑定，才能找到適合於特異性結合的單抗。而找到抗原上合適的抗原表位，針對性地製備抗體，則可大大簡化該過程。此外，在基於一些抗原蛋白製備抗體的過程中，由於全長蛋白一般序列較長，製備特異性抗體的效率並不高，獲得的抗體經常存在結合能力差、結合位點不確定等問題。因此需要針對一些抗原蛋白找到其特異性的抗原表位(抗原決定簇)，以含有該抗原表位的短肽來製備特異性抗體，以獲得結合能力良好，且結合位點確定的抗體。本發明通過製備特異性抗Binlb蛋白的多克隆抗體和單克隆抗體，並利用抗原表位掃描方法，進行抗原表位掃描分析，確認了各個單抗識別的抗原表位。從中發現了一個抗原表位序列是哺乳動物SPAGll(Binlb)的共有多肽序列，可以作為哺乳動通用的免疫避孕靶標，具有潛在的應用價值。基於本發明人的上述新發現，本發明提供了一種分離的多肽，所述的多肽具有SEQIDN0:1或SEQIDN0:2所示的胺基酸序列；並且，所述的多肽來源於Binlb蛋白，且由7-30個胺基酸組成；較佳地由7-20個胺基酸組成；更佳地由7-15個(如10個)胺基酸組成。—旦獲得了所述多肽的序列，就可以用重組法來大批量地獲得該多肽。這通常是將其克隆入載體，再轉入細胞，然後通過常規方法從增殖後的宿主細胞中分離得到有關序列。此外，對比本發明的短肽而言，優選的是採用人工合成(如通過多肽合成儀合成)的方法來合成有關序列，人工合成的方法可簡便且快速地得到所需要的多肽。本發明還提供了所述的多肽的用途，其作為Binlb蛋白的一種有效的抗原性的片段，用於製備特異性結合Binlb蛋白的抗體，包括單克隆抗體或多克隆抗體。所述的抗體可以通過本領域內技術人員已知的各種技術進行製備。例如，純化的本發明的多肽可被施用於動物以誘導多克隆抗體的產生。與之相似的，表達本發明的多肽的細胞可用來免疫動物來生產抗體。本發明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術來製備(見Kohler等人，Nature256;495，1975;Kohler等人，Eur.J.Immunol.6:511，1976;Kohler等人，Eur.J.Immunol.6:292，1976;Ha騰rling等人，InMonoclonalAntibodiesandTCellHybridomas,Elsevier,N.Y.，1981)。多克隆抗體的生產可用本發明的多肽免疫動物，如家兔，小鼠，大鼠等。多種佐劑可用於增強免疫反應，包括但不限於弗氏佐劑等。抗體基於本發明人的上述新發現，本發明提供了一種特異性結合Binlb蛋白的抗體，所述的抗體特異性識別Binlb蛋白上具有SEQIDNO:1(即DPWNRCC)，或SEQIDN0:2(即SDPWNRCC)所示的胺基酸序列的位點。所述的抗體是一種哺乳動物通用型的抗體。所述的抗體可以是單克隆抗體或多克隆抗體，不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab'或(Fab)2片段，抗體重鏈，抗體輕鏈，遺傳工程改造的單鏈Fv分子，或嵌合抗體(如具有鼠抗體結合特異性但仍保留來自人的抗體部分的抗體)。7本發明中的抗體可用於通過與Binlb蛋白相結合而抑制Binlb蛋白與哺乳動物精子的相互作用，抑制精子運動，從而可達到哺乳動物避孕的效果。本發明的抗體還可用於免疫組織化學技術中，檢測活檢標本中的Binlb蛋白存在情況或存在的量。作為本發明的優選方式，所述的抗體是一種單克隆抗體，其是由保藏號為CCTCC-C200847的雜交瘤細胞株rBinlblOA5(也可稱為10A5)產生的。該單克隆抗體結合能力強，與其它蛋白不發生交叉反應，對於精子活動的抑制效果非常好。—種雜交瘤細胞株，所述的雜交瘤細胞株的保藏號為CCTCC-C200847，所述的雜交瘤細胞株可用於生長本發明的單克隆抗體。在獲得了所述的雜交瘤細胞後，可以利用該雜交瘤細胞大量地生產單克隆抗體，所述的單克隆抗體可以由下列製備方法所製備，所述方法包括步驟[oose](1)提供佐劑預處理的動物(如小鼠)；(2)在動物腹腔內接種所述的雜交瘤細胞並分泌單克隆抗體；(3)抽取腹水，分離獲得所述的單克隆抗體。從腹水中分離單克隆抗體也是已知的。作為一種方式，從腹水中分離單克隆抗體的方法是收集腹水，用經硫酸銨、辛酸沉澱，接著用ProteinG預裝層析柱純化，獲得高純度的單克隆抗體。此外，也可按照常規的動物細胞培養方法，體外培養擴增所述的雜交瘤細胞，從而使之分泌所述的單克隆抗體。本發明還提供了所述的抗體的用途，用於製備檢測樣品中是否存在Binlb蛋白。在獲得了本發明的抗體後，本領域人員可通過多種途徑來靈敏地檢測樣品中Binlb蛋白的存在與否以及存在濃度，採用的技術可以是免疫學領域中常用的技術。組合物本發明還提供了一種抑制哺乳動物精子運動的組合物，它含有有效量(如0.0001wt%-50wt%;更佳的0.001wt%-30wt%)的上述的單克隆抗體，以及藥學上可接受的載體。"有效量"或"有效劑量"是指可對人和/或動物產生功能或活性的且可被人和/或動物所接受的量。"藥學上可接受的"的成分是適用於人和/或哺乳動物而無過度不良副反應(如泰性、剌激和變態反應)的，即具有合理的效益/風險比的物質。術語"藥學上可接受的載體"指用於治療劑給藥的載體，包括各種賦形劑和稀釋劑。通常，可將這些物質配製於無毒的、惰性的和藥學上可接受的水性載體介質中或凝膠介質中，其中pH通常約為5-8，較佳地pH約為6-8，儘管pH值可隨被配製物質的性質以及待治療的病症而有所變化。配製好的藥物組合物可以通過常規途徑進行給藥，其中包括(但並不限於)局部給藥、靜脈內、或腹膜內。優選的，所述的單克隆抗體被用於局部給藥，如附睪內給藥，或局部用於雄性哺乳動物生殖器部位，或用於雌性哺乳動物生殖道部位，以及其它精子儲藏或精子活動的部位。本發明的組合物含有安全有效量的本發明上述的單克隆抗體以及藥學上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但並不限於)鹽水、緩衝液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物製劑應與給藥方式相匹配。本發明的藥物組合物可以被製成液體劑型，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其它輔劑的水溶液通過常規方法進行製備；考慮外用的目的，優選的劑型是凝膠劑、搽劑、膏劑、栓劑等。藥物組合物如溶液宜在無菌條件下製造。活性成分的給藥量是治療有效量，例如每天約l微克-約5毫克。當然，具體劑量還應考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫師技能範圍之內的。本發明還提供了一種抑制哺乳動物精子運動的方法，所述方法包括給予哺乳動物有效量的本發明所述的抗體，優選的是給予由保藏號為CCTCC-C200847的雜交瘤細胞株產生的單克隆抗體。所述的方法儘管是直接用於哺乳動物的，但其使用目的是抑制精子的運動以達到避孕的效果，屬於非治療性的目的。本發明的主要優點在於(1)本發明人首次定位了Binlb蛋白序列上特定的抗原性表位，所述的抗原性表位在哺乳動物Binlb蛋白中保守地存在，從而可基於此抗原性表位來製備特異性結合Binlb蛋白的哺乳動物通用型抗體。(2)本發明人還篩選到了特異性結合本發明所述的抗原表位的單克隆抗體，所述的抗體結合特異性好，與其它蛋白沒有交叉反應。(3)本發明以Binlb蛋白作為避孕的靶標，該蛋白在附睪中特異性表達，而附睪作為精子成熟和貯藏的器官，僅影響精子的活動能力，不影響精子的生成，因此把附睪作為研究避孕和不育的靶器官具有明顯的優勢。下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室指南(NewYork:CoIdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數按重量計算。實施例1.單克隆抗體的製備材料克隆載體pGEM-TEasy載體購自Promega公司，原核表達質粒pET28a(+)購自Novagen公司。DH5a和宿主菌E.coliBL21codonplus(RP)菌為常規菌株。Sp2/0小鼠骨髓瘤細胞購自ATCC。細胞培養用DMEM購自GibcoBRL公司。Trizol試劑購自Invitrogen公司，TaqDNA聚合酶和T4DNA連接酶購自MBI公司。小量質粒製備試劑盒、匪V逆轉錄酶、Oligo(dT)15Primer、RNA酶抑制劑、X-gal均購自Promega公司。Nde1、BglII、BamHI和Sail等限制性內切酶購自NEB公司。PCR產物切膠回收試劑盒購自TaKaRa公司。HisTr即kitNi親和柱購自美國安瑪西亞公司。IPTG購自MERCK公司。His-tagmAb購自北京天為時代公司。HRP和FITC標記的羊抗鼠IgG均購自上海普飛公司。Westernblot的ECL化學發光試劑盒購自Amersham公司。PVDF膜購自MILLIP0RE公司。福氏完全、不完全佐劑、PEG4000、小鼠Ig亞型鑑定試劑盒均購自Sigma公司。HAT、HT、EMEM等培液購自Invitrogen。BALB/c近交系小鼠(6周齡，雌性)，購自中科院實驗動物中心。方法1、大鼠Binlb雙拷貝串連蛋白的表達及純化以大鼠Binlb全長cDNA克隆質粒(rBinlb-pGEM-T，pGEM-T購自Promega公司，製備方法見文獻LiP，C.H.，HeB，SoSC，ChungYW，ShangQ，ZhangYD，ZhangYL.，Anantimicrobialpeptidegenefoundinthemaler印roductivesystemofrats.Science,2001.291(5509):p.1783-5)為模板，分別用4個大鼠Binlb基因特異性引物擴增出兩個rBinlb的片段。片段l由以下引物擴增PI:5，-CATATG(NdeI)GGAATCAGAAACACC-3'(SEQIDNO:61);P2:5，—AGATCT(BglII)TCTGTTTTTAATGGA-3，(SEQIDNO:62)。片段2由以下引物擴增P3:5，-AGATCT(BamHI)GGAATCAGAAACACC—3'(SEQIDNO:63);P4:5，-GTCGAC(salI)CTATCTGTTTTTAATGGA-3，(SEQIDNO:64)。將片段1和2分別連入pGEM-TEasy載體的相關酶切位點，利用BglII，BamHI為同尾酶的特點，將兩個片段串聯起來。用Ndel和Sail將串聯片段切割回收，連入pET28a(參考Xiao，L.Q.等，ActaBiochimBiophysSin(Shanghai)，2004.36(8):p.571-6)。將pET28a-串聯rbinlb轉化表達菌BL21codonplus(RP)。從平板挑單克隆於3mlLB37。C培養過夜，接種500毫升LB，培養至0D600nm為0.6左右，加入IPTG至lmM，37。C誘導6小時，收菌。包涵體純化以lml/mg菌體的比例加入裂解緩衝液(50mMTris-HC1PH8.0，25%蔗糖w/v，lmMEDTA)，超聲破菌，加入脫氧膽酸鈉至終濃度2%(w/v)，室溫攪拌1小時。混合物15000g離心15分鐘，取沉澱。洗滌液(1%TritonX-lOO(V/V)，lmMEDTA，1M尿素)洗滌4次，每次均充分混勻10000g離心10分鐘。經洗滌的包涵體用2X上樣緩衝液(4%SDS，125iiMTris-HCl，PH6.8)溶解。將蛋白進行SDS-PAGE電泳，切下目的條帶，電洗脫(Bio-Radelectro-eluterModel422)。回收的rBinlb蛋白通過和標準BSA比較進行定量。2、雜交瘤細胞的建立用0.5mL前述純化的rBinlb蛋白(0.8mg/ml)與等量福氏完全佐劑混合併完全乳化後，經腹腔注射免疫BALB/c小鼠(0.2mL/只)。加強免疫時，用福氏不完全佐劑充分乳化抗原，注射劑量和部位同前，共免疫4次，每次間隔2周。最後1次直接用抗原溶液進行免疫。末次免疫後3天，取脾細胞與骨髓瘤細胞Sp2/0在PEG4000作用下融合。用間接ELISA法篩選mcAb分泌陽性的雜交瘤細胞。經34次有限稀釋法克隆化後，選擇mcAb分泌持續陽性的雜交瘤細胞擴大培養，並按常規製備腹水。3、mcAb的特性鑑定(1)效價測定採用間接ELISA法。用rBinlb(lmg/L)包酶標板。一抗為適當稀釋的雜交瘤細胞培養上清或腹水樣本，二抗為1:3000的HRP標記羊抗鼠IgG，經TMB底物顯色後，于波長450nm測定0D值。(2)Ig亞類(型)的鑑定間接ELISA法。用純化的rBinlb包被酶標板，4。C過夜。其餘操作詳見Sigma公司單抗亞類鑑定試劑盒操作手冊。參照試劑盒中的說明書進行。(3)特異性鑑定採用Westernblot檢測，對rBinlb誘導表達全菌的裂解產物經15%濃度的膠SDS-PAGE電泳分離，進行Westernblot檢測。轉印後將PVDF膜置5%的脫脂奶粉4t:封閉過夜，然後置於按1:10000封閉液稀釋的mcAb室溫輕輕搖晃作用lh，用PBST搖晃洗滌，10HRP標記的羊抗鼠IgG工作濃度為1:1000，ECL顯色。4、mcAb的初步應用(l)Westernblot檢測應用Westernblot檢測大鼠睪丸、附睪、輸精管與精子中rBinlb蛋白的表達分別提取成年大鼠睪丸、附睪頭部、附睪體部、附睪尾部、輸精管蛋白，以及附睪頭部精子、附睪體部精子和附睪尾部精子蛋白。蛋白定量後，取等量蛋白進行SDS-PAGE和Westernblot分析。重組表達的雙拷貝串聯蛋白(抗原)rBD14、rBD15、rBD42、rBDl、mBD15、mBD30的GenBank登錄號分別為AY621346、AY621347、AY621369、NM_031810、NM_139222、DQ012040;雙拷貝串聯蛋白的製備方法參見文獻XiaoLQ，LiuAH，ZhangYL.Aneffectivemethodforraisingantiseraagainstbeta—defensins:double_copyproteinexpressionofmBinlbinE.coli.ActaBiochimBiophysSin(Shanghai)2004;36(8):571—576.的方f去)。rBD14單和rBD15單(抗原)分別為rBD14、rBD15的單體活性重組多肽，製備方法參見DiaoH，GuoC，LinD，ZhangY.Intein-mediatedexpressionisaneffectiveapproachinthestudyofbeta_defensins.BiochemBiophysResComm皿2007;357(4):840-846。rCapSperm，rCorSperm，rCauSperm分別為等量的附睪頭部、體部和尾部精子蛋白(分別將附睪頭部、體部和尾部精子與2XSDSPAGE電泳上樣緩衝液混勻，共同沸水浴5-10分鐘，冷卻至室溫即可)。(2)免疫組化染色法解剖大鼠取附睪，依次經甲醛固定、石蠟包埋、切片及脫蠟後，3%11202孵育10min，再於微波爐中煮沸10min。加10%羊血清PBS封閉60min，用PBS洗3次。滴加1:1000的抗rBinlb抗體(以免疫前小鼠的血清為陰性對照)，於4t:孵育過夜，PBS洗3次，再滴加l:200的HRP標記羊抗鼠IgG(37t:孵育lh，漂洗3次)，滴加DAB顯色10min後，再以蘇木素復染lmin。經脫水、透明及封片後，鏡下觀察結果並照像。結果1、雜交瘤細胞株的建立按上述方法免疫BALB/c小鼠後，用間接ELISA法進行滴度檢測，只有一隻動物達到〉160000滴度水平，見圖1。挑選滴度最高的第9號鼠進行雜交瘤製備。細胞融合後，從挑選的387個單克隆雜交瘤細胞株中，第一輪初篩選出可能的32個陽性克隆細胞株，從中選出10株抗體效價高的陽性細胞單克隆，用有限稀釋法再進行第2次和第3次克隆，最終得到4株抗體效價高、能穩定分泌抗rBinlb單抗(rBinlbmcAb)的雜交瘤細胞株(3A1，10A5，10B4和14F6)，將其放入液氮中凍存6個月，復甦後仍能穩定分泌rBinlbmcAb。2、mcAb的特性鑑定(1)效價測定雜交瘤細胞3Al，10A5，10B4和14F6培養上清中mcAb的ELISA效價分別為l:32，1:64，1:64，1:128;腹水mcAb的效價分別為l:1X105，2X105，2X105，5X105。(2)Ig亞類(型)鑑定11採用Sigma公司單抗亞類鑑定試劑盒對3A1，10A5，10B4和14F6細胞株分泌的抗體的Ig亞類(型)進行鑑定的結果表明，它們的亞型分別為IgGl，IgGl，IgGl，IgG2a。(3)特異性鑑定經Westernblot檢測，4株細胞分泌抗體只與重組表達的rBinlb起反應，與大腸桿菌中的其它蛋白無交叉反應，與P-防禦素家族的其它成員也無交叉反應，見圖2;與精子上其它蛋白和附睪其它部位的精子蛋白無交叉反應，見圖3。[Cm5]3、mcAb的初步應用Westernblot檢測結果在成年大鼠的睪丸、附睪頭部、附睪體部、附睪尾部、輸精管以及附睪頭部精子、附睪體部精子和附睪尾部精子蛋白中，僅在附睪頭部組織抽提蛋白和附睪頭部精子抽提蛋白中檢測到rBinlb的表達，其他部位均檢測不到陽性信號。免疫組化結果rBinlb在成年大鼠附睪中表達與定位在成年大鼠附睪中僅在附睪頭部靠近附睪體部的部位有rBinlb蛋白的表達，並且大部分陽性信號集中在該部位的附睪管腔內。在Westernblot和精子免疫螢光化學水平，抗rBinlb單抗特異識別附睪頭部精子上的rBinlb而不識別其它蛋白，見圖4。實施例2.單抗的抗原表位掃描實驗材料載體pSY621-GST(徐萬祥等，截短GST蛋白熱誘導融合表達質粒及其製備方法，專利申請號200710173305.2)。宿主菌E.coliBL21。DNA片段合成上海賽百盛基因技術有限公司。方法1、抗原片段合成粗掃描將rbinlb多肽拆分成有79個胺基酸重疊的16肽(seglseg6)，如下seglDIPPGIRNTVCFMQRGseg2NTVCFMQRGHCRLFMCRSeg3HCRLFMCRSGERKGDIseg4SGERKGDICSDPWNRCseg5CSDPWNRCCVSSSIKNVSSSIKNRseg6基於將上述肽段合成相應的編碼DNA片段，並在5'和3'端分別加上BamHI和Sail酶切位點序列，如表1所示。其中，rBinlb蛋白的16肽抗原表位Seg16正負鏈及其合成的DNA編碼序列，用於16肽表位粗篩；s表示正義鏈，r表示反義鏈。表ltableseeoriginaldocumentpage13精細表位掃描將16肽按1個胺基酸的位移拆分成不同的8肽片段，合成相應的DNA片段，在5'和3'端分別加上BamHI和Sail酶切位點序列，見表2，其中s表示正義鏈，r表示反義鏈。表2tableseeoriginaldocumentpage13序列SEQIDNO:Seg3-3r5'-tcg3cttectcccc3g朋cggc3C3tg朋g3gg-3'20Seg3-4s5'-gatccttcatgtgccgttctggggagcgctaag-3'21Seg3-4r5'-tcgacttagcgctccccagaacggcacatgaag-3'22Seg3-5s5'-gatccatgtgccgttctggggagcgcaagtaag-3'23Seg3-5r5'-tcgacttacttgcgctccccagaacggcacatg-3'24Seg3-6s5，-gatcctgccgttctggggagcgcaaggggtaag-3，25Seg3-6r5'_tcgacttaccccttgcgctccccagaacggcag_3'26Seg3-7s5，-gatcccgttctggggagcgcaagggggattaag-3，27Seg3-7r5'_tcgacttaatcccccttgcgctccccagaacgg_3'28Seg4-ls5，-gatccggggagcgcaagggggatatttgctaag-3，29Seg4-lr5'_tcgacttagcaaatatcccccttgcgctccccg_3，30Seg4-2s5'-gatccgagcgcaagggggatatttgctcttaag-3'31Seg4-2r5'-tcgacttaagagcaaatatcccccttgcgctcg-3'32Seg4-3s5'-g3tcccgc朋ggggg3tetttgctctg3ct朋g-3'33Seg4-3r5'-tcgacttagtcagagcaaatatcccccttgcgg-3'34Seg4-4s5'-g3tcc朋ggggg3tetttgctctg3cccgt朋g-3'35Seg4-4r5'-tcgacttacgggtcagagcaaatatcccccttg-3'36Seg4-5s5'-gatccggggatatttgctctgacecgtggtaag-3'37Seg4-5r5'_tcgacttaccacgggtcagagcaaatatccccg_3'3814tableseeoriginaldocumentpage15tableseeoriginaldocumentpage162、表達質粒構建和重組蛋白表達DNA退火合成的DNA單鏈用無菌水溶解到100yM，正義鏈和反義鏈各取5yL，加入到90iiL無菌水，94t:水浴變性5分鐘，自然降溫退火。將pSY621-GST用BamHI和Sail酶切並割膠回收，與退火後的DNA片段連接(TAKARADNA連接試劑盒)。連接好的產物轉化E.coliBL21感受態細菌，加入500iiLLB培養基37。C振搖1小時200轉/分。12000g離心2分鐘，塗含100iig/ml的氨苄西林鈉的LB平板，37。C培養過夜。挑選轉化子接入3ml含100iig/ml氨苄西林鈉的LB培養液，3(TC培養過夜。取100yL過夜菌接入lml含100iig/ml氨苄西林鈉的LB培養液，42。C培養5小時，收菌。取100yL菌液加入20iiL6X上樣緩衝液混勻，IO(TC沸水浴5分鐘，冷卻後取1yL進行SDS-PAGE電泳。3、WesternBlot蛋白電泳完後電轉至PVDF膜，1XNET封閉37。Cl-2小時，抗體稀釋到1XNET4°C雜交過夜。PBST洗膜三次，15分鐘/次。膜與HRP-標記的二抗37t:雜交1小時，PBST洗膜三次，ECL顯色。結果1、抗體的識別特性製備抗Binlb多抗血清，用O.5mL純化的rBinlb蛋白(0.8mg/mL)與等量福氏完全佐劑混合併完全乳化後，經腹腔注射免疫BALB/c小鼠(0.2mL/只)。加強免疫時，用福氏不完全佐劑充分乳化抗原，注射劑量和部位同前，共免疫4次，每次間隔2周。最後1次直接用抗原溶液進行免疫，常規方法從小鼠獲取抗血清。粗篩抗原表位融合蛋白的重組表達和抗Binlb多抗血清的Westernblot鑑定如圖5所示，多抗血清與seg2、3、4、5片段有免疫反應，表明抗原表位集中在這幾個片段內。因此，16肽表位融合蛋白與多抗血清的westernblot結果表明，其表位序列分布在seg2-seg5內部。四個單克隆抗體(3A1、10A5、10B4、14F6)與粗篩表位序列seg1-6的Westernblot結果如圖6。由結果可見，四個單克隆抗體(3A1，10A5，10B4，14F6)分別識別表位肽seg4&5、5、3、4&5。pre為誘導表達前的菌液，po為誘導後的菌液。用seg2-seg5的相應8肽表位融合蛋白進行Westernblot，表明單克隆抗體10A5特異性識別多肽表位序列DPWNRCC(SEQIDNO:1)，SDPWNRCC(SEQIDNO:2)或DPWNRCCV，見圖7。單克隆抗體3A1特異性識別表位序列SDPWNRC、SDPWNRCC、DPWNRCCV、PWNRCCVS，見圖8。單克隆抗體10B4特異性識別表位序列RSGERKGD等，見圖9。用多抗血清也可以得到同樣的表位識別序列。2、表位序列的物種間分析對包括人類、小鼠大鼠在內的哺乳動物spagll基因的成熟肽序列比對表明，單抗10A5和單抗3A1識別的表位序列SDPWNRCC在哺乳動物的spagll基因編碼的多肽(包括人類)中保守地存在，如圖10所示。這意味著該抗體和表位序列可以應用到包括人類的其它哺乳動物的spagll的鑑別和免疫避孕等方面。實施例3.單克隆抗體抑制精子運動起始3月齡雄性Sprague-Dawley大鼠購自中科院實驗動物中心。大鼠斷頸處死後立即解剖，剝離附睪。剪取附睪組織，用(WONG，P.Y.D.(1988a).Mechanismofadrenergicstimulationofanionsecretioninculturedrat印ididymalepithelium.AmericanJournalofPhysiology254，F121133)的方法酶解分散細胞，接種到半透膜(HAWP，045um;Millipore，Bedford,MA，USA)，於32°C和5%二氧化碳及保溼的培養箱培養。培養基為Eagle，sminimumessentialmedium(EMEM)(購自INVITR0GEN)加5%月臺牛血清(Gibco)，lOOmM非必需胺基酸，4mM谷胺醯胺，1mm丙酮酸鈉，100i.u.ml—1青黴素，100ug.m"鏈黴素。培養至細胞鋪滿平皿底部。3月齡雄性Sprague-Dawley大鼠購自中科院實驗動物中心。其它化學試劑購自Sigma公司。大鼠斷頸處死後立即解剖，剝離附睪。剪取附睪起始部(initialsegment)組織，輕輕剪碎，放入0.4ml預熱到37。C的精子培養液(123mMNaCl，4mMKCl，2mMCaCl2，0.4mMMgS04，0.3mMNa2HP04，25mMNaHC03，5mM葡萄糖，12.5mM乳酸鈉和0.5mM丙酮酸鈉，8iig酚紅，4mgm"牛血清白蛋白;pH7.4，滲量(osmolarity)310m0smkg—"，培養5分鐘，游離出未成熟精子。調節精子濃度至6.0X107ml。取上述長滿附睪細胞的培養皿，於精子和附睪上皮細胞的共孵育前2小時，棄去上清，加入150iiL新鮮培養基。作為對照，在培養皿中加入10iiL無關抗體如抗6XHistag單克隆抗體，實驗組加入lOiiL抗rBinlb的單克隆抗體10A5。精子和附睪上皮細胞的共孵育時，加入3iiL6.0X107/mL的上述精子。於37°C，5%C02和飽和溼度條件下共孵育4小時，倒置相差顯微鏡(Olympus)40倍物鏡，10倍目鏡觀察。在顯微鏡視野下可見對照組精子獲得運動能力，精子運動明顯；而實驗組精子不運動。生物材料保藏本發明製備的雜交瘤細胞rBinlblOA5保藏在中國典型培養物保藏中心(CCTCC，中國武漢)，保藏號為CCTCCNO:C200847;保藏日為2008年9月17日。在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定的範圍。序列表〈110〉中國科學院上海生命科學研究院；上海市計劃生育科學研究所〈120〉一種哺乳動物通用的免疫避孕靶標及其特異性抗體〈130>086123〈160>64〈170>PatentInversion3.3〈210>1〈211>7〈212>PRT〈213〉多肽〈400〉1AspProTrpAsnArgCysCys15〈210>2〈211>8〈212>PRT〈213〉多肽〈400>2SerAspProTrpAsnArgCysCys15〈210>3〈211>57〈212>DNA〈213>寡核苷酸〈400>3gatccgacattccacctggaatccgcaacaccgtgtgcttcatgcagcggggctaag57〈210>4〈211>57〈212>DNA〈213>寡核苷酸〈400〉4tcgacttagccccgctgcatgaagcacacggtgttgcggattccaggtggaatgtcg57〈210>5〈211>60〈212>DNA〈213〉寡核苷酸〈400>5gatccaacaccgtgtgcttcatgcagcggggccactgtcgcctcttcatgtgccgttaag606〈211>60〈212>DNA〈213〉寡核苷酸〈400>6tcgacttaacggcacatgaagaggcgacagtggccccgctgcatgaagcacacggtgttg6018〈210>7〈211>57〈212>DNA〈213〉寡核苷酸〈400>7gatcccactgtcgcctcttcatgtgccgtt〈210>8〈211>57〈212>DNA〈213〉寡核苷酸〈400>8tcgacttaaatatcccccttgcgctcccca〈210>9〈211>57〈212>DNA〈213〉寡核苷酸〈400>9gatcctctggggagcgcaagggggatattt〈210>10〈211>57〈212>DNA〈213〉寡核苷酸〈400>10tcgacttagcagcggttccacgggtc卿g〈210>11〈211>57〈212>DNA〈213〉寡核苷酸〈400>11gatcctgctctgacccgtggaaccgctgct〈210>12〈211>57〈212>DNA〈213〉寡核苷酸〈400>12tcgacttagtttttaatggaactggatecg〈210>13〈211>33〈212>DNActggggagcgc^gggggatattteag5了g^cggcacatg33g3ggcgacagtgg57gctctgacccgtggaaccgctgctaag57caaatatcccccttgcgctccccagag57gcgtatccagttccattaaaaactaag57cagcagcggttccacgggtc3gagcag5719〈213〉寡核苷酸〈400>13gatccgtatccagttccattaaaaaccgctaag〈210>14〈211>33〈212>DNA〈213〉寡核苷酸〈400〉14tcgacttagcggtttttaatggaactggatacg33〈210>15〈211>33〈212>DNA〈213〉寡核苷酸〈400>15gatcctgtcgcctcttcatgtgccgttcttaag33〈210>16〈211>33〈212>DNA〈213〉寡核苷酸〈400>16tcgactt朋g朋cggc3catg朋gaggcg3cag33〈210>17〈211>33〈212>DNA〈213〉寡核苷酸〈400>17gatcccgcctcttcatgtgccgttctgggtaag33〈210>18〈211>33〈212>DNA〈213〉寡核苷酸〈400>18tcgacttacccagaacggcacatgaagaggegg33〈210>19〈211>33〈212>DNA〈213〉寡核苷酸〈400〉19gatccctcttcatgtgccgttctggggagtaag3320〈211>33〈212>DNA〈213〉寡核苷酸〈400>20tcgacttactccccag朋cggcac3tg朋gagg33〈210>21〈211〉33〈212>DNA〈213〉寡核苷酸〈400>21gatccttcatgtgccgttctggggagcgctaag33〈210>2233〈212>DNA〈213〉寡核苷酸〈400>22tcgacttegcgctccccagaacggcacatgaag33〈210>23〈211>33〈212〉DNA〈213〉寡核苷酸〈400>23gatccatgtgccgttctggggagcgcaagtaag33〈210>24〈211>33廳〈213>寡核苷酸〈400>24tcgacttacttgcgctccccagaacggcacatg33〈210>25〈211>33〈212>DNA〈213〉寡核苷酸〈400>25gatcctgccgttctggggagcgcaaggggtaag33〈210>26〈211>33〈212>DNA21〈213〉寡核苷酸〈400>26tcgacttaccccttgcgctccccagaacggcag〈210>27〈211>33DNA〈213〉寡核苷酸〈400>27gatcccgttctggggagcgcaagggggattaag33〈210>28〈211>33DNA〈213〉寡核苷酸〈400>28tcgactteatcccccttgcgctccccagaaegg33〈210>29〈211>33DNA〈213〉寡核苷酸〈400>29gatceggggagcgcaagggggatatttgetaag33〈210>30〈211>33DNA〈213〉寡核苷酸〈400>30tcgacttagcaaatatcccccttgcgctccccg33〈210>31〈211>33DNA〈213〉寡核苷酸〈400>31gatccgagcgcaagggggatatttgetettaag33〈210>32〈211>33DNA〈213〉寡核苷酸〈400>32tcgacttaagagcaaatatcccccttgcgctcg33〈210>33〈211>33〈212>DNA〈213>寡核苷酸〈400>33gatcccgcaagggggatatttgctctgact〈210>34〈211>33〈212>DNA寡核苷酸〈400〉34tcgacttagtC3g3gca朋tatcccccttg〈210>35〈211>33〈212>DNA〈213〉寡核苷酸〈400>35gatccaagggggatatttgctctgacccgt〈210>36〈211>33〈212>DNA〈213〉寡核苷酸〈400>36tcgacttacgggtcagagcaaatatccccc〈210>37〈211>33〈212>DNA〈213〉寡核苷酸〈400>37gatccggggatatttgctctgacccgtggt3833〈212〉DNA〈213〉寡核苷酸〈400>38tcgacttaccacgggtcagagcaaatatcc〈210>39〈211>33〈212>DNAaag33egg33aag33ttg33肌g33ccg33〈213〉寡核苷酸〈400>39gatccgatatttgctctgacccgtggaact朋g33〈210>4033〈212>DNA寡核苷酸〈400>40tcgacttagttccacgggtcagagc^atetcg33〈210>4133〈212>DNA寡核苷酸〈400>41gatccatttgctctgacccgtggaaccgct33〈210>42〈211>33〈212>DNA〈213〉寡核苷酸〈400〉42tcgacttagcggttccacgggtcagagc^Eltg33〈210>43〈211>33〈212>DNA〈213〉寡核苷酸〈400〉43gatcctgctctgacccgtggaaccgctgct33〈210>44〈211>33DNA〈213〉寡核苷酸〈400>44tcgacttagcagcggttccacgggtc卿gCElg33〈210>45〈210>46〈211>33〈212〉DNA〈213〉寡核苷酸〈400>46tcgacttagcagcagcggttccacgggtca〈210>47〈211>33〈212>DNA〈213>寡核苷酸47gatccgacccgtggaaccgctgctgcgtat〈210>48〈211〉33〈212>DNA〈213〉寡核苷酸48tcgacttatacgcagcagcggttccacggg〈210>49〈211〉33〈212>DNA〈213〉寡核苷酸〈400>49gatccccgtggaaccgctgctgcgtatcct〈210>50〈211>33〈212>DNA寡核苷酸〈400>50tcgacttaggatecgcagcagcggttccac〈210>51〈211>33〈212>DNA寡核苷酸〈400>51gatcctggaaccgctgctgcgtatccagtt〈210〉52〈211>33〈212>DNAgag33aag33tcg33朋g33ggg313朋g33〈213>寡核苷酸〈400>52tcgacttaactggatacgcagcagcggttc〈210>53〈211>33DNA〈213〉寡核苷酸〈400>53gatccaaccgctgctgcgtatccagttcct〈210>54〈211>33〈212>DNA〈213〉寡核苷酸54tcgacttaggaactggatecgcagcagcgg〈210>55〈211>33〈212>DNA〈213〉寡核苷酸〈400>55gatcccgctgctgcgtatccagttccattt〈210>56〈211>33〈212>DNA〈213〉寡核苷酸〈400>56tcg3ctte肪tggaactggat3CgC3gC3g〈210>57〈211>33〈212>DNA〈213〉寡核苷酸〈400>57gatcctgctgcgtatccagttccattaaat〈210>5833〈212>DNA〈213〉寡核苷酸〈400>58tcgacttatttaatggaactggatacgcag26cag33aag33ttg33aag33egg'3'3肌g33cag33〈210>59〈211>33〈212>DNA〈213>寡核苷酸59gatcctgcgtatccagttcc〈210>60〈211>33〈212>DNA寡核苷酸〈400〉60tcgacttagtttttaatggatictggatecgcag〈210>61〈211>21〈212>DNA〈213〉引物〈400>61catetggg朋tcag朋3C3cc〈210>62〈211>21〈212>DNA〈213〉引物〈400>62agatcttctgtttttaatgg〈210>6321〈212〉DNA〈213〉引物〈400>63agatctggaatcag朋3C3cc64〈211〉24〈212>DNA〈213〉引物〈400>64gtcgacctatctgtttttaatgga25/25頁33332121212權利要求一種分離的多肽，其特徵在於，所述的多肽具有SEQIDNO1所示的胺基酸序列；並且，所述的多肽來源於哺乳動物Bin1b蛋白，且由7-30個胺基酸組成。2.如權利要求l所述的多肽，其特徵在於，所述的多肽具有SEQIDN0:2所示的胺基酸序列。3.權利要求1所述的多肽的用途，其特徵在於，用於製備特異性結合Binlb蛋白的抗體。4.一種特異性結合Binlb蛋白的抗體，其特徵在於，所述的抗體特異性識別Binlb蛋白上具有SEQIDNO:l所示的胺基酸序列的位點。5.如權利要求4所述的抗體，其特徵在於，所述的抗體由保藏號為CCTCC-C200847的雜交瘤細胞株產生。6.權利要求4-5任一所述的抗體的用途，其特徵在於，用於製備抑制哺乳動物精子運動的組合物；或用於製備定性或定量檢測樣品中Binlb蛋白存在情況的試劑。7.如權利要求6所述的用途，其特徵在於，所述的哺乳動物選自人、鼠、狗、貓、牛、豬、蝙蝠、猴、樹駒、馬、大象、松鼠、豚鼠或犰狳。8.—種用於抑制哺乳動物精子運動的組合物，其特徵在於，所述的組合物包括(1)有效量的權利要求4-5任一所述的抗體；禾口(2)藥學上可接受的載體。9.一種雜交瘤細胞株，其特徵在於，所述的雜交瘤細胞株的保藏號為CCTCC-C200847。10.—種抑制哺乳動物精子運動的方法，其特徵在於，所述方法包括給予哺乳動物有效量的權利要求4-5任一所述的抗體。全文摘要本發明涉及一種哺乳動物通用的免疫避孕靶標。本發明公開了一種來源於哺乳動物Bin1b蛋白的保守性抗原表位，本發明還公開了特異性與該抗原表位結合的抗Bin1b蛋白的抗體，特別是單克隆抗體，所述的抗體是一種哺乳動物通用型的抗體。文檔編號G01N33/68GK101724020SQ20081020170公開日2010年6月9日申請日期2008年10月24日優先權日2008年10月24日發明者於合國,刁華,張永蓮,徐萬祥申請人:中國科學院上海生命科學研究院;上海市計劃生育科學研究所