一種與牙釉質表面軸向特異性結合的七肽及其應用的製作方法

2023-08-11 05:43:11

專利名稱：一種與牙釉質表面軸向特異性結合的七肽及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及利用噬菌體表面展示技術，篩選出能與牙釉質表面軸向特異性結合的多肽，具體地說，是應用隨機七肽噬菌體展示文庫篩選與牙釉質表面軸向特異性結合的噬菌體，得到能促進脫礦牙釉質表面再礦化的七肽序列。
背景技術：
齲病是人類最常見口腔疾病之一，其進展最終會導致牙體硬組織缺損並嚴重影響人們的日常生活。牙齒暴露於口腔中的唾液中，正常人體牙齒處於脫礦與再礦化的動態礦化平衡之中，二者相互依存，相互拮抗。當促進脫礦的因素加重時，即以脫礦為主，牙體中的羥基磷灰石開始溶解。從病因學以及病理學的角度出發，齲病可以理解為致病細菌(變性鏈球菌等)酸性代謝產物幹擾下，牙體礦物質脫礦與再礦化的失衡(以脫礦為主)。近年，隨著保存齒科學的興起，人們針對齲病的策略開始強調齲病早期診斷和再礦化治療(齲病早期治療)。這樣可以最大程度的減少牙體組織的缺損。眾所周知，有機物在礦物的形成中起著生物調控作用，該過程稱為生物礦化。牙體硬組織的生物形成就是生物礦化的一個典型例子。有機物對礦物的調控具體表現為對礦物晶體的成核，晶體生長和礦物的形態的調控。國內外學者已經證實，有機分子對羥基磷灰石等晶體的成核和晶體結構起著引導作用。如，牙釉質中的釉原蛋白，被證實可以促進牙釉質表面再礦化。但是這些有機大分子，分子結構複雜，具體應用時環境條件要求苛刻，同時蛋白的生產提純費用昂貴。因此找出能夠與無機物晶體特異性結合併能調控其礦化過程的小分子多肽具有相當的應用前景。噬菌體表面展示技術可以篩選出能夠與無機物特異性結合併且調控無機物礦化過程的小分子多肽(7-12個胺基酸序列)。學者們已經篩選出包括羥基磷灰石在內的許多無機物特異性結合的多肽。但由於這些篩選過程中由於忽略了作為篩選基底的晶體的各向異性特徵，這些多肽的調控作用缺乏特異性。本研究利用隨機七肽噬菌體展示文庫，篩選能與牙釉質表面特異性結合的七肽，在國內外尚未報導。

發明內容
本發明的目的是應用噬菌體表面展示技術，篩選出一種能與牙釉質表面軸向特異性結合的七肽。當齲病發生牙釉質脫礦，羥基磷灰石晶體大量暴露，與牙釉質表面晶體特異性結合的多肽相應增加，該多肽若融合某些可檢測分子(螢光蛋白)可作為脫礦開始的診斷工具(即齲病的早期診斷)。本發明的另一目的是利用該多肽對脫礦牙釉質表面再礦化過程的作用，將該多肽用於齲壞牙體再礦化修復。該發明通過以下技術方案實現本發明應用隨機七肽噬菌體展示文庫對牙釉質表面進行了 4輪篩選，獲得能與牙釉質表面特異性結合的重組噬菌體，從得到的重組噬菌體分離製備單克隆噬菌體，提取單克隆噬菌體單鏈基因組DNA，共獲得了 32個七肽，通過Output/Input比值比較不同單克隆噬菌體的結合能力，獲得了能與牙釉質表面軸向特異性結合，結合力最高的七肽，其胺基酸序列如下Asn-Asn-His-Tyr-Leu-Pro-Arg。實驗表明該七肽對脫礦牙釉質表面再礦化具有促進作用，可用於齲壞牙體再礦化修復。本發明的優點是1、本發明製備的與牙釉質表面軸向特異性結合的七肽，能與牙釉質表面特異性結合，尤其是酸蝕後的牙釉質表面，該七肽可應用於齲病的診斷。2、本發明製備的七肽具有促進酸蝕牙釉質表面再礦的作用，可用於齲壞牙體再礦化修復。


圖1 是四輪篩選所獲得的洗脫噬菌體的滴度。圖2 是單克隆噬菌體E-I至E-32對牙釉質表面的結合力。圖3 是與牙釉質表面特異性結合能力最強的七肽EHBP的胺基酸序列結構式。圖4 是EHBP與不同牙釉質表面(未酸蝕，酸蝕，縱剖面)結合時的螢光強度比較。 其中圖4(A)未酸蝕牙釉質表面未結合七肽EHBP時的螢光圖；圖4(B)未酸蝕牙釉質表面結合七肽EHBP的螢光圖；圖4(C)酸蝕牙釉質表面未結合七肽EHBP的螢光圖；圖4(D)酸蝕牙釉質表面結合七肽EHBP的螢光圖；圖4(E)牙釉質縱剖面未結合七肽EHBP的螢光圖；圖4(F)牙釉質縱剖面結合七肽EHBP的螢光圖。圖5 是不同七肽對酸蝕牙釉質表面的再礦化的促進作用比較(電鏡圖)。其中圖 5(A)酸蝕牙釉質表面未加入任何多肽再礦化16h;圖5 (B)酸蝕牙釉質表面未加入任何多肽再礦化Mh ；圖5 (C)酸蝕牙釉質表面加入隨機多肽RP後再礦化16h ；圖5 (D)酸蝕牙釉質表面加入隨機多肽RP後再礦化24h ；圖5(E):酸蝕牙釉質表面加入低結合力多肽ELBP後再礦化16h ；圖5(F)酸蝕牙釉質表面加入低結合力多肽ELBP後再礦化Mh ；圖5(G)酸蝕牙釉質表面加入高結合力多肽EHBP後再礦化16h ；圖5(H)酸蝕牙釉質表面加入高結合力多肽EHBP後再礦化Mh。
具體實施例方式以下結合說明書附圖和實施例對本發明作進一步的說明，但不是限制本發明。實施例1 與牙釉質表面軸向特異性結合的重組噬菌體的篩選1.第一輪篩選與洗脫1)取正畸原因拔除前磨牙，去除牙齒表面附著軟組織，將前磨牙放入蒸餾水中超聲清洗30分鐘，經環氧乙烷消毒後備用。2)將消毒後的前磨牙放入封阻緩衝液(0. IM NaHCO3 [pH 8. 6]，5mg/ml BSA, 0. 02% NaN3),4°C過夜封阻。3)第二天，將經過過夜封阻的前磨牙取出，放入滅菌水，4°C繼續封阻1小時。4)將牙齒懸吊於 M 孔板的一個孔中，用 500uL TBST (TBS+0. 1% [v/v] Tween-20) 緩衝液快速衝洗牙齒6次。注意每次衝洗吸取TBST緩衝液後，再次加入TBST緩衝液要快，避免牙齒乾燥。5)經過6次TBST緩衝液衝洗後，去除緩衝液，立即加入IOuL噬菌體原庫(10"pfu) (噬菌體試劑盒購自New England Biolabs公司)和490uL TBST緩衝液的混合溶液。注意控制牙齒懸吊高度，以保證液體僅浸泡牙釉質表面，不超過牙冠部分。室溫下置於搖床溫和搖動結合40分鐘。6)吸掉噬菌體原庫和TBST混合溶液，用500uL TBST緩衝液快速衝洗牙齒10次。 具體注意事項同步驟4)。7)吸掉 TBST 緩衝液，加 IOOOuL 洗脫緩衝液(0. 2M Glycine-HCl [pH 2. 2]，lmg/ml BSA)洗脫結合的噬菌體，室溫下置於搖床溫和搖動10分鐘。立即將洗脫噬菌體液轉移至另一乾淨微量離心管，然後再用150uL Tris-HCl (ΙΜ,ρΗ 9. 1)中和上述洗脫噬菌體液。4°C保存直到用於噬菌體滴度測定或擴增用於下一輪篩選。2.擴增，第二，三，四輪篩選與洗脫1)準備5mL LB-Tet培養基(LB培養基並加入5uL四環素貯液[四環素20mg/mL 溶解於乙醇])放入15mL離心管。槍頭挑取ER2378菌落一個，放入培養基，置於37°C恆溫搖床，230rpm，過夜培養。2)第二天，將ER2738細菌過夜培養物1 100稀釋於20mLLB培養基中(用250mL 三角燒瓶盛裝)，37°C恆溫搖床，230rpm,預培養1小時。3)加入200uL未擴增洗脫噬菌體液，37°C恆溫搖床，250rpm,培養4. 5小時.4)轉移培養物至50mL高速離心管，4°C，10，OOOrpm,離心10分鐘。上清液轉移至新離心管，相同條件下再次離心。5)將上清的上部80%轉移至新離心管，加入1/6體積的PEG/NaCl溶液，4°C過夜沉澱。6)第三天，4°C，10，OOOrpm，離心15分鐘。倒掉上清液，再短暫離心，吸去殘留上清液。7)沉澱物重懸於ImL TBS中，懸液轉入微量離心管中，4°C，10，OOOrpm離心5分鐘
使殘餘細胞沉澱。8)上清轉入另一新鮮微量離心管，用1/6體積的PEG/NaCl再沉澱。冰上孵育60 分鐘。4°C，10，OOOrpm離心10分鐘，棄上清，再短暫離心，用微量移液器吸去殘餘上清。9)沉澱物重懸於200uL TBS中。離心1分鐘，沉澱任何殘餘的不溶物。上清轉入新鮮管中。此即為擴增後的洗脫噬菌體液。4°C保存用於測定滴度和下一輪的篩選。10)按照第一輪的方法進行第二，三，四輪篩選實驗，但是TBST緩衝液的Tween濃度增至 0.5% (ν/ν)。3.噬菌體滴度的測定1)槍頭挑取ER2378菌落一個，放入含5mL LB-Tet培養基的15mL離心管。置於 37 °C恆溫搖床，230rpm,培養至對數中期(0D 0. 5)。2)微波爐融化上層瓊脂，分成3mL等份於滅菌試管中，每個噬菌體稀釋度一管。保存於45°C備用。3) 37°C預溫LB/IPTG/Xgal平板，每個噬菌體稀釋度取一個平板備用。4)在LB培養基中準備10倍系列稀釋的噬菌體。稀釋度如下
對於擴增噬菌體液，IO9至IO11稀釋度；對於洗脫噬菌體液，IO3至IO6稀釋度。5)菌體培養物分成200uL等份於微量離心管中，每個噬菌體稀釋度一管。6)每管加入IOuL不同稀釋度的噬菌體，快速震蕩混勻，室溫溫育5分鐘。7)將感染細胞加入45°C預溫的上層瓊脂培養管中，每次一管，快速混勻，立即傾注於37°C預溫的LB/IPTG/Xgal平板上。適當傾斜平板將上層瓊脂均勻鋪開。8)平板冷卻5分鐘，倒置平板，37°C培養過夜。9)計數平板上噬菌斑的數目，根據稀釋度計算噬菌體的濃度。結果經過四輪篩選，第一輪至第三輪從牙釉質表面基底洗脫下來的噬菌體總量升高，第四輪開始，洗脫噬菌體滴度未升高(圖1)，說明噬菌體與牙釉質表面的結合已到最大程度。實施例2 單克隆噬菌體的分離製備1)根據實施例1所述，在第三輪和第四輪篩選中噬菌體與牙釉質結合已達最大程度。因此，從第三，四輪篩選所得噬菌體中分別挑取約15個單克隆。2)將ER2738過夜培養物按1 100稀釋接種於LB培養基，分5mL到離心管中。3)用滅菌牙籤或者槍頭每次挑取一個藍色噬菌斑，轉移至上述的5mL離心管中。 注意，要從噬菌斑總量不滿100個的平板中挑取，以保證每個被挑的噬菌斑僅含一個DNA序列。4) 37°C恆溫搖床，230rpm，培養4-5小時。5)將培養物 4°C，10, OOOrpm,離心 10 分鐘。6)將上清的上部80%轉移至新離心管，加入1/6體積的PEG/NaCl溶液，4°C沉澱至少1小時。7)4°C，10，OOOrpm，離心15分鐘。倒掉上清液，再短暫離心，吸去殘留上清液。8)沉澱物重懸於ImL TBS中。4°C，10, OOOrpm,離心5分鐘，沉澱任何殘餘的不溶物。9)上清轉入新鮮離心管中，此即挑取的單克隆噬菌體。4°C保存SOOuL用於測序， 餘部分1 1與甘油混合後置於-20°C長期保存。結果從原庫隨機挑取的隨機單克隆噬菌體E-1，從第三輪挑取單克隆噬菌體15 個(E-2至E-16)，從第四輪挑取單克隆噬菌體16個(E-17至E-32)。實施例3 噬菌體單鏈基因組DNA的提取和七肽胺基酸序列的獲得1)取實施例2所得800uL擴增後的單克隆噬菌體液，加入300uL PEG/NaCl溶液， 顛倒混勻，室溫放置30分鐘。2) 10，OOOrpm離心10分鐘，棄上清液，短暫離心，小心吸去殘留上清。3)上步所得沉澱物重懸於IOOuL碘化物緩衝液中，再加入250uL無水乙醇，室溫孵育10分鐘。4) 10，OOOrpm離心10分鐘，棄上清。用70%乙醇洗沉澱。5) 10, OOOrpm離心10分鐘，棄上清，乾燥。6)沉澱重懸於 30uL TEdOmM Tris-HCl [pH 8. 0], ImM EDTA)中，此即該單克隆噬菌體的單鏈基因組DNA。
7)以 _96gIII 測序引物(5，-H。CCC TCA TAG TTA GCG TAA CG-3，)對上述單鏈DNA 測序。用Align軟體翻譯，得到七肽胺基酸序列。結果從原庫隨機挑取的隨機七肽以及第三輪(15個)和第四輪(16個)篩選到的七肽的胺基酸序列如表1所示。表1 單克隆噬菌體E-I至E-32表達的七肽的胺基酸序列。
權利要求
1.一種與牙釉質表面軸向特異性結合的七肽，其胺基酸序列如下 Asn-Asn-His-Tyr-Leu-Pro-Arg。
2.根據權利要求1所述的與牙釉質表面軸向特異性結合的七肽，其特徵在於所述的七肽的製備步驟如下1)應用隨機七肽噬菌體展示文庫對牙釉質表面進行四輪篩選，獲得能與牙釉質表面特異性結合的重組噬菌體；2)從步驟1)得到的重組噬菌體分離製備單克隆噬菌體；3)提取單克隆噬菌體單鏈基因組DNA，獲得七肽胺基酸序列；4)測定單克隆噬菌體對牙釉質表面結合能力，篩選出對牙釉質表面特異性結合力最強的七肽胺基酸序列，其胺基酸序列如下Asn-Asn-His-Tyr-Leu-Pro-Arg。
3.根據權利要求1所述的與牙釉質表面軸向特異性結合的七肽，其特徵在於所述的與牙釉質表面軸向特異性結合的七肽在齲病的診斷以及齲壞牙體再礦化修復中的應用。
全文摘要
本發明涉及一種與牙釉質表面軸向特異性結合的七肽序列及其應用。本發明應用噬菌體表面展示技術，篩選出一種能與牙釉質表面軸向特異性結合的七肽，其胺基酸序列如下Asn-Asn-His-Tyr-Leu-Pro-Arg。該七肽具有與與牙釉質表面軸向特異性結合的特性，並且能夠促進脫礦牙釉質表面的再礦化過程。該發明提供的七肽對齲病的診斷以及齲壞牙體再礦化修復具有很高的應用前景。
文檔編號A61K49/00GK102286073SQ20111017564
公開日2011年12月21日 申請日期2011年6月27日 優先權日2011年6月27日
發明者周彬, 龔士強 申請人:華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院