寡核糖核苷酸以及其用於治療脫髮、腎衰竭和其它疾病的方法

2023-07-08 11:11:46

專利名稱：寡核糖核苷酸以及其用於治療脫髮、腎衰竭和其它疾病的方法
寡核糖核苷酸以及其用於治療脫髮、腎衰竭和其它疾病的方法本申請是申請日為2005年9月27日，申請號為200580032715. 4，發明名稱為「寡核糖核苷酸以及其用於治療脫髮、腎衰竭和其它疾病的方法」的申請的分案申請。
在本申請中引用了各種專利和科技出版物。為了更完全地描述本發明所屬領域的現有技術，各出版物的公開以參考的方式完全引入本申請中。
背景技術：
siRNA 和 RNA 幹渉RNA幹涉(RNAi)是涉及雙鏈(ds) RNA-依賴性基因特異性轉錄後沉默的現象。最初，研究此現象並操作哺乳動物細胞的實驗嘗試因為響應於長dsRNA分子而活化的活性、非特異性抗病毒防禦機制而受挫；見Gil等 2000, Apoptosis，5 :107-114。後來發現21個核苷酸RNA的合成二聯體能介導哺乳動物細胞內基因特異性RNAi，而不刺激通用的抗病毒防禦機制(見 Elbashir 等 Nature 2001,411 :494-498 和 Caplen 等 Proc Natl AcadSci2001，98 :9742-9747)。因此，小的幹涉RNA (siRNA)是小的雙鏈RNA，在理解基因功能的方面已成為有力的工具。因此，RNA幹涉(RNAi)是指哺乳動物中由小的幹涉RNA (siRNA) (Fire等，1998，Nature 391,806)或微RNA(miRNA) (Ambros V. Nature431 :7006,350-355(2004) JPBartelDP.Cell. 2004 Jan 23 ；116 (2) 281-97MicroRNAs genomics, biogenesis, mechanism, andfunction)介導的序列特異性轉錄後基因沉默過程。植物中相應的過程通常稱為特異性轉錄後基因沉默或RNA沉默，並通常在真菌中稱為壓制。siRNA是雙鏈RNA分子，它下調或沉默(防止)其內源(胞內)對應部分基因/mRNA的表達。RNA幹涉是基於dsRNA物質進入特定蛋白複合體的能力，然後它靶向於互補的細胞RNA並特異性地降解它。因此，RNA幹涉響應是含有siRNA的核酸內切酶複合體的特徵，該複合體通常稱為RNA-誘導的沉默複合體(RISC)，它介導具有與siRNA雙鏈體的反義鏈互補的序列的單鏈RNA的裂解。靶RNA的裂解可在互補於siRNA雙鏈體反義鏈的區域中間發生(Elbashir等2001, Genes Dev.,15,188)。詳細地說，較長的dsRNA由III型RNA酶降解為短的(17_29bp) dsRNA片段(也稱為小抑制 RNA- 「siRNA」) (DICER, DROSHA, etc.，Bernstein 等 ，Nature, 2001, v. 409，p. 363-6 ；Lee等 ，Nature, 2003,425, p. 415-9)。RISC蛋白複合體識別這些片段和互補的mRNA。整個過程結束於革E mRNA的核酸內切酶裂解(McManus&Sharp, Nature Rev Genet,2002, v. 3, p. 737-47 ；Paddison&Hannon, Curr Opin Mol Ther.2003 Jun ;5 (3) :217-24)。對於這些術語和可能機制的信息，見Bernstein E.，Denli AM. Harmon GJ :2001 The restis silence. RNA.I ；7 (11) : 1509-21 ;Nishikura K. :2001 A short primer on RNAi RNA-directed RNA polymerase acts as a key catalyst. Cell. I 16 ； 107 (4) :415-8 和PCT 公布 WO 01/36646 (Glover 等)。已經廣泛報導了對應於已知基因的siRNA的選擇和合成，見，例如Chalk AM，Wahlestedt C,Sonnhammer EL. 2004 Improved and automated prediction of effectivesiRNA Biochem. Biophys. Res. Commun. Jun 18 ；319 (I) :264-74 ;Sioud M, Leirdal M.,2004, Potential design rules and enzymatic synthesis of siRNAs, Methods MolBiol ；252 :457-69 ；Levenkova N, Gu Q, Rux JJ. 2004, Gene specific siRNA selectorBioinformatics.I 12 ；20 (3) :430-2 和 Ui-Tei K, Naito Y, Takahashi F, HaraguchiT, Ohki-Hamazaki H, Juni A, Ueda R, Saigo K. , Guidelines for the selection ofhighly effective siRNA sequences for mammalian and chick RNA interferenceNucleic Acids Res. 2004 19 ；32 (3) :936-48. Se also Liu Y,Braasch DA,Nulf CJ,CoreyDR. Efficient and isoform-selective inhibition of cellular gene expression bypeptide nucleic acids, Biochemistry, 2004 I 24 ；43 (7) :1921-7 還可參見於 PCT 公布 W02004/015107 (Atugen)和 WO 02/44321 (Tuschl 等)，以及 Chiu YL, Rana TM. siRNAfunction in RNAi a chemical modification ahalysis,RNA 2003 Sep ；9 (9) :1034-48和用於生產修飾的/更穩定siRNA的I專利No. 5898031和6107094 (Crooke)。多個研究組描述了能夠在細胞內產生siRNA的基於DNA的媒介物的進展。該方法一般涉及轉錄小的髮夾RNA，它在細胞內被有效處理以形成siRNA。Paddison等.PNAS2002,99 :1443-1448 ；Paddison 等 Genes&Dev2002，16 :948-958 ;Sui 等.PNAS 2002,8 5515-5520 JPfcummelkamp 等.Science 2002,296 :550_553。這些報導介紹了產生能夠特異性地靶向於大量內源和外源表達基因的siRNA的方法。siRNA近來已經被成功地用於靈長類中的抑制；詳情見Tolentino等.，Retina24 (I)February 2004 I 132-138。d53某閔和多狀人類p53基因是熟知和高度研究的基因。p53多肽在細胞脅迫響應機制中起重要作用，通過轉化各種不同刺激，例如DNA破壞條件，諸如Y -輻射、轉錄或複製脫調節，和癌基因轉化，引起細胞生長停止或凋亡(Gottlieb等，1996, Biochem. Biophys. Acta,1287, p. 77) 0 p53多肽對誘導響應這樣的刺激的細胞程序性死亡或「凋亡」是必需的。大多數抗癌治療還傷害或殺死含有天然P53的正常細胞，導致與健康細胞的傷害或死亡相關的嚴重副作用。因為這些副作用很大程度上由P53-介導的正常細胞死亡而確定，抗癌治療急性階段暫時抑制P53已經作為避免這些嚴重毒性事件的治療策略。這描述於美國專利 No. 6，593，353 和 Komarov PG 等，1999, A chemical inhibitor ofp53 that protectsmice from the side effects of cancer therapy. , Science,285(5434) :1651,1653.已證實p53參與了化療和福射誘導的脫髮(Botcharev等,2000, p53 is essential forChemotherapy-induced Hair Loss, Cancer Research,60,5002-5006)。脫髮近來在理解調節毛囊形成和頭發生長的分子和途徑中已經有了重大進展。化療破壞生產毛幹的生長球(bulb)中的基體角質化細胞的增殖。這使得毛囊進入營養不良的退化階段，其中毛幹的整體性受損，然後頭髮斷裂並掉落。由於超過90%的頭皮囊在任何時間都處於生長階段，這些頭髮在化療後迅速喪失，因此脫髮是快速和廣泛的(GeorgeCotsarelis and Sarah E.Millar, 2001, Towards a molecular understanding of hairloss and its treatment, TRENDS in Molecular Medicine Vol. 7 No. 7)。很可能導致頭髮喪失的化療藥物為順鉬、阿糖胞苷、環磷醯胺、多柔比星、表柔比星、依託泊苷、異環磷醯胺和長春新鹼。輻射誘導的一般脫髮在實際上100%的接受全腦輻射(WBR)的患者中觀察、到，尤其是3000rad或更高的。脫髮是癌症患者中最怕的化療副作用之一，儘管化療後的頭髮喪失實際上會再生長。從患者的角度，作為化療的令人痛苦的副作用，頭髮喪失(脫髮)僅次於噁心。約75%的患者描述化療誘導的頭髮喪失等於或比癌症導致的痛苦更有破壞性。因此，儘管頭髮病不致命，它們對社會交往和患者的心理健康的深遠影響是不可否認的。對頭髮喪失的治療需要產生了數十億美元的工業。儘管如此，目前多數上市產品無效，證據為FDA僅批准了兩種對頭髮喪失的治療。已知的治療或療法對癌症治療誘導的脫髮無效。急件腎衰竭(ARF) ARF是一種臨床綜合症，特徵為在幾天內發生的腎功能的快速衰退。ARF的主要特徵是腎小球濾過率(GFR)的急速下降，導致含氮廢物(尿素、肌酸酐)的滯留。在整個世界人口中，每年發生每百萬人中170-200例的嚴重ARF。目前，對已建立的ARF還沒有特異性治療。已經發現多種藥物來改善毒性和缺血性實驗性ARF，由不同動物模型中表現為較低血清肌酸酐水平、減少組織學損傷和腎功能的快速恢復。這些包括抗氧化劑、鈣通道阻滯劑、利尿劑、血管活性物質、生長因子、抗炎劑等。然而，已經在臨床試驗中研究的這些藥物顯示無優勢，並且尚未批准在臨床ARF中使用。在大多數住院患者中，ARF由急性腎小管壞死(ATN)引起，這由缺血性和/或腎毒性創傷造成。腎灌注不足是由低血容量、心源性和感染性休克，由給藥血管收縮藥物或腎血管損傷造成的。腎毒素包括外源毒素例如造影劑和氨基糖苷以及內源毒素例如肌紅蛋白。然而近來的研究認為腎組織中的細胞凋亡在大多數人類ARF病例中是突出的。凋亡性細胞死亡的主要位點是遠端腎單位。在缺血性損傷的開始階段，肌動蛋白細胞骨架整體性的喪失導致上皮變扁平，失去刷狀緣，失去局部細胞接觸，以及隨後細胞脫離下層基質。已經認為凋亡小管細胞死亡比壞死細胞死亡有更多預測的功能變化(Komarov等.Science. 1999Sep 10 ；285(5434) :1733-7);還見於(Supavekin 等.Kidney Int. 2003 May ；63(5)1714-24)。總之，目前沒有令人滿意的治療方式來預防和/或治療毒性脫髮和急性腎衰竭，也沒有令人滿意的治療方式來治療伴有P53多肽水平升高的許多其它疾病和疾患，因此需要開發為此目的的新型化合物。發明的概述本發明提供了抑制p53基因的新型雙鏈寡核糖核苷酸。本發明還提供了一種藥物組合物，其包括一種或多種此寡核糖核苷酸，以及能夠表達寡核糖核苷酸的媒介物。本發明還提供了一種方法以治療患有一種疾病的患者，其中P53活性的暫時(可逆)抑制是有利的，所述方法包括向患者給藥一般作為藥物組合物的一種或多種寡核糖核苷酸，以治療有效的劑量從而治療患者。本發明還包括治療其它伴有P53多肽水平升高的疾病。因為長期的P53失活會顯著增加癌症風險，優選的是使用本發明分子暫時抑制p53。在一個優選實施方案中，當使用p53siRNA暫時抑制p53是有利的，並伴有常規化療(如此處所述)或放療時，這裡所公開的新型siRNA分子可用於治療腫瘤。例如，此處公開的新型siRNA分子保護含有p53的正常細胞不受化療或放療誘導的細胞凋亡。當p53抑制強化了這些細胞的凋亡性細胞死亡時，此處公開的新型siRNA分子還可用於抑制p53在特定癌細胞中的表達。特別地，放療和化療會引起嚴重的副作用，如對淋巴系統和造血系統以及腸上皮的嚴重傷害，這限制了這些治療的有效性，並會導致引起心理痛苦的脫髮。這些副作用是由P53介導的細胞凋亡引起的。因此，為了消除或減輕癌症治療帶來的副作用，使用本發明siRNA分子在正常細胞誘導p53活性的暫時抑制是有利的，從而保護正常組織。在另一優選實施方案中，此處所公開的新型siRNA分子可用於治療急性腎衰竭(ARF)，該疾病的特徵為腎功能的急速衰退，並伴有腎組織中的凋亡性細胞死亡。此處所公開的新型siRNA分子還可用於治療其它疾患，其中p53被激活，原因為與損傷相關的各種刺激，損傷例如燒傷、體 溫過高、與受阻的血供應如心肌梗塞、中風、和缺血中相關的缺氧。使用本發明siRNA分子暫時抑制p53可治療性地有效減少或消除中樞神經系統中P53依賴性神經元死亡，即腦和脊髓損傷，在移植前保存組織和器官，準備骨髓移植的宿主，並減輕或消除癲癇發作期間的神經元損傷。p53還在細胞衰老中起作用。尤其是，衰老相關的正常組織形態學和生理學變化可涉及P53活性。已知隨著時間聚集在組織中的衰老細胞能維持較高水平的p53依賴性轉錄。衰老組織中聚集的衰老細胞的p53依賴性分泌生長抑制物。因此，此處公開的siRNA分子還可用於抑制組織衰老。本發明一方面提供了一種具有下述結構的化合物(N)x-Z (反義鏈)3' V -(N/ )y 5'(有義鏈)其中每個N和N』是核糖核苷酸，在其糖殘基中可為修飾或未修飾的，(N)j^P (N')y是寡聚物，其中每個連續的N或N』由共價鍵連接至下一 N或N』 ；其中每個X和y是19和40之間的整數；其中每個Z和V可存在或不存在，但如果存在時為dTdT，並且共價地連接於其所存在的鏈的3』末端；和其中(N) x的序列包括對p53cDNA的反義鏈。在本發明化合物的優選實施方案中，(N)x的序列可包括表A、B和C中存在的一種或多種反義序列。在本發明化合物的優選實施方案中，共價鍵可以是磷酸二酯鍵。在本發明化合物的優選實施方案中，X = y,更優選地X = y = 19。在本發明化合物的某些優選實施方案中，Z和Z'可都不存在。在本發明化合物的某些優選實施方案中，Z或Z'之一存在。在本發明化合物的某些優選實施方案中，所有核糖核苷酸在其糖殘基中可以是未修飾的。在本發明化合物的某些優選實施方案中，至少一個核糖核苷酸在其糖殘基可以是修飾的。在本發明化合物的某些優選實施方案中，糖殘基的修飾可包括在2』位的修飾。在本發明化合物的某些優選實施方案中，在2』位的修飾可導致存在一個基團，所述基團選自氣基、氣、甲氧基、燒氧基和燒基。在本發明化合物的某些優選實施方案中，在2』位的基團可以是甲氧基(2』 -0-甲基)。
在本發明化合物的某些優選實施方案中，交替核糖核苷酸可在有義鏈和反義鏈中被修飾。在本發明化合物的某些優選實施方案中，反義鏈5』和3』末端的核糖核苷酸在其糖殘基可以是被修飾的，且有義鏈5』和3』末端的核糖核苷酸在其糖殘基可以是未修飾的。在本發明化合物的某些優選實施方案中，反義和有義鏈在5』和3』末端可以是非磷酸化的，或反義和有義鏈在3』末端可以是磷酸化的。在某些優選實施方案中，本發明化合物可具有任一表A中系列號3、5、20和23的反義序列。在某些優選實施方案中，本發明化合物可具有表A中系列號23的反義序列。本發明另一方面提供了一種能夠表達本發明化合物的媒介物。本發明另一方面提供了包括有效抑制人類p53的量的一種或多種本發明化合物或媒介物和載體的藥物組合物。本發明另一方面提供了包括有效抑制人類p53的量的一種或多種本發明化合物和載體的藥物組合物。本發明另一方面提供了包括有效抑制人類p53的量的一種或多種本發明化合物和載體的藥物組合物。本發明另一方面提供了包括有效抑制人類p53的量的具有任意表A中系列號3、5、20和23的反義序列的任意寡核糖核苷酸和藥學上可接受載體的藥物組合物。在某些優選實施方案中，本發明的藥物組合物可包括具有表A中系列號23的反義序列的寡核苷酸和藥學上可接受載體。本發明另一方面提供了治療患有疾病患者的方法,包括向所述患者給藥包括治療有效劑量的一種或多種本發明化合物的組合物，從而治療所述患者。在某些優選實施方案中，本發明的組合物是包括有效抑制人類p53的量的一種或多種本發明化合物或媒介物和載體的組合物。本發明另一方面提供了治療患有疾病患者的方法,包括向所述患者給藥包括治療有效劑量的一種或多種本發明化合物的組合物，從而治療所述患者。在某些優選實施方案中，所述疾病可以是脫髮或急性腎衰竭或所述疾病可伴有P53多肽水平升高。在某些優選實施方案中，所述患者在較大心臟手術後處於發展急性腎衰竭的高風險。本發明另一方面提供了單鏈寡核苷酸，其包括一種或多種主幹和環結構，其中主幹區包括P53基因的有義siRNA序列和相應反義siRNA序列。在某些優選實施方案中，本發明的單鏈寡核苷酸的有義或反義siRNA序列可包括任意表A至C中存在的序列。本發明另一方面提供了一種組合物，其包括有效抑制人類p53量的本發明化合物和載體，其中本發明化合物共價或非共價結合於一種或多種本發明化合物。在某些優選實施方案中，脫髮由化療或放療引起。本發明另一方面提供了治療有效量的本發明寡核糖核苷酸或本發明媒介物用於製備用於促進患有脫髮或急性腎衰竭或伴有P53多肽水平升高的疾病的患者康復的藥物、的用途。本發明另一方面提供了與對照相比至少50%下調基因p53表達的方法，包括將基因p53的mRNA接觸本發明的寡核糖核苷酸。本發明另一方面提供了組合物，其包括共價或非共價結合於一種或多種抑制前凋亡基因表達的化合物的有效抑制人類P53量的本發明化合物，以及載體。在本發明組合物的某些實施方案中，前凋亡基因可選自RTP801、Fas、Bax、Noxa,Puma、PIDD、TNF a、caspase2、caspase3、caspase9、E2F1 和 PARP-1。在本發明組合物的某些實施方案中，抑制前凋亡基因表達的化合物可以是siRNA化合物。
本發明另一方面提供了預防經受大手術的高風險患者急性腎衰竭的方法，包括向所述患者給藥包括治療有效劑量的一種或多種本發明化合物的組合物，從而治療所述患者。在某些實施方案中,手術可以是心臟手術。在某些實施方案中，化合物是本發明化合物。本發明另一方面提供了預防經受大手術的患者急性腎衰竭的方法，其包括給藥所述患者包括治療有效劑量抑制p53的一種或多種siRNA化合物的組合物,從而治療所述患者。在某些實施方案中，手術可以是心臟手術且其中化合物可以是本發明化合物。


圖I.此圖表示人類p53基因-SEQ ID NO : I的核苷酸序列。圖2.此圖表示人類p53多肽-SEQ ID NO 2的胺基酸序列。圖3.此圖表示證明各種人類p53siRNA對p53表達作用的Western Blot結果。圖4.此圖表示證明各種小鼠p53siRNA對p53表達作用的Western Blot結果。圖5.此圖表示作為動物急性腎衰竭指徵的血清肌酸酐水平，所述動物遭遇兩側腎動脈鉗緊並如所指的以p53siRNA化合物或對照處理。圖6.此圖表示動物腎組織中腎小管壞死的程度，所述動物遭遇兩側腎動脈鉗緊並以p53siRNA化合物處理。圖7.此圖說明在經受缺血-再灌注腎傷害的動物腎的皮質腔中，p53siRNA處理下調調亡如基因Puma的表達。發明的詳細描述本發明一般涉及下調p53基因表達的化合物，尤其涉及新型小幹涉RNA(SiRNA)，以及這些新型siRNA用於治療各種疾病和醫學疾患的用途，尤其是脫髮或急性腎衰竭或伴有P53多肽水平升高的疾病。本發明的發明人已經發現為了治療任何所述疾病或疾患，誘導P53的暫時抑制是有利的。抑制p53的方法、分子和組合物將在這裡詳細地討論，而且，任何所述分子和/或組合物可有利地用於治療經受任何所述疾患的患者。本發明提供了體內抑制靶p53基因表達的方法和組合物。通常，該方法包括給藥寡核糖核苷酸，諸如小幹涉RNA(即siRNA)，其在生物條件下(細胞內)靶向於特定p53mRNA並與之雜交或相互作用，或給藥能在細胞內產生siRNA的核酸物質，以足以通過RNA幹涉機制下調靶基因表達的量。尤其是，所述方法可用於抑制P53基因的表達以治療疾病。根據本發明，p53基因的siRNA分子或抑制物可用作藥物以治療各種病理，尤其是脫髮或急性腎衰竭或其它伴有P53多肽水平升高的疾病。因為長期p53失活會顯著增加癌症風險，優選的是使用本發明分子抑制P53是暫時的/可逆的。本發明提供 了雙鏈寡核糖核苷酸(siRNA)，其下調p53基因的表達。本發明的siRNA是二聯體寡核糖核苷酸，其中有義鏈衍生自p53基因的mRNA序列，反義鏈互補於有義鏈。一般，可耐受IE mRNA序列的一些偏差而不損害siRNA活性(見於如Czauderna等2003Nucleic Acids Research 31(11), 2705-2716) 本發明的siRNA在轉錄後水平抑制基因表達，同時破壞或不破壞mRNA。不由理論束縛，siRNA可為了特定裂解和降解而祀向於mRNA和/或可抑制靶信息的翻譯。p53 多肽有至少四種變體(見 Bourdon 等.Genes Dev. . 2005 ；19 :2122-2137) 圖I中所給的序列是gi-8400737的核苷酸序列。對應的多肽序列具有393個胺基酸；見圖2。所有變體和任何其它類似的小變體都包括在P53多肽的定義和編碼它們的p53基因的定義中。如此處所用，術語「p53基因」定義為p53基因的任何同源物，與SEQ ID N0:1的胺基酸編碼區或在高度嚴格雜交條件下結合於P53基因的核酸序列具有優選90%同源性，更優選95%同源性，甚至更優選98%同源性，這些是本領域中已知的(例如參見Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore,Maryland(1988), updated in 1995and 1998)。如此處所用，術語「p53」或「p53多肽」定義為p53多肽的任何同源物，與SEQ IDNO 2具有優選90%同源性，更優選95%同源性，甚至更優選98%同源性，作為其全長或片段或域，作為突變體或由剪接的變體核酸序列編碼的多肽，作為與其他多肽的嵌合體，只要任何上述具有與P53多肽相同或大致相同的生物功能。一般地，用於本發明的SiRNA包括含有雙鏈結構的核糖核酸，而該雙鏈結構包括第一鏈和第二鏈，第一鏈包括相鄰核苷酸的第一伸展，並且所述第一伸展至少部分互補於靶核酸，和第二鏈包括相鄰核苷酸的第二伸展，所述第二伸展與靶核酸至少部分相同，所述第一鏈和/或第二鏈包括多個修飾的核苷酸組，所述核苷酸在2』-位點有修飾，從而在所述鏈內每組修飾的核苷酸在一側或兩側被核苷酸側翼組所側翼，形成所述側翼組核苷酸的側翼核苷酸是未修飾的核苷酸或具有不同於修飾核苷酸的修飾的修飾核苷酸。而且，所述第一鏈和/或第二鏈可包括多個修飾核苷酸並可包括所述多個修飾核苷酸組。修飾核苷酸組和/或側翼核苷酸組可包括許多核苷酸，其數量選自I個核苷酸至10個核苷酸。關於此處特指的任何範圍，應理解為每個範圍公開了在用於界定範圍的相應數字之間的任意單獨整數，包括所述兩個界定範圍的數字。因此，在這樣的情況下所述的組包括一個核苷酸、二個核苷酸、三個核苷酸、四個核苷酸、五個核苷酸、六個核苷酸、七個核苷酸、八個核苷酸、九個核苷酸和十個核苷酸。所述第一鏈的修飾核苷酸的方式可由相對於第二鏈的修飾核苷酸的方式的一個或多個核苷酸來替換。上述的修飾可選自氨基、氟、甲氧烷氧基、烷基、氨基、氟、氯、溴、CN、CF、咪唑、羧酸酷(caboxylate)、硫代酷(thioate)、C1至Cltl低級燒基、取代的低級燒基、燒芳基或芳燒基、OCF3> OCN、O-、S-、或 N-烷基；0_、S-、或 N-鏈烯基；SOCH3 ；SO2CH3 ；0N02 ;N02、N3 ;雜環烷基(heterozycloalkyl);雜環燒芳基(heterozycloalkaryl);氨基燒氨基；多燒基氨基或取代的甲矽烷基及其它，如描述於歐洲專利EP 0 586 520 BI或EP 0618 925 BI。siRNA的雙鏈結構在一側或兩側可是平頭的。具體地，雙鏈結構在由第一鏈的5』 -末端和第二鏈的3』末端界定的雙鏈結構側可是平頭的，或雙鏈結構在由第一鏈的3』 -末端和第二鏈的5』末端界定的雙鏈結構側可是平頭的。此外，雙鏈的至少一個可具有在5』 -末端至少一個核苷酸的懸突；所述懸突可由至少一個脫氧核糖核酸組成。至少一個鏈還可 任選地在3』-末端具有至少一個核苷酸的懸關。siRNA雙鏈結構的長度通常從約17到21個，並更優選地18個或19個鹼基。而且所述第一鏈的長度和/或所述第二鏈的長度可獨立地選自從約15個到約23個鹼基、17至21個鹼基和18個或19個鹼基的範圍。此外，所述第一鏈和靶核酸之間的互補可以是完全的，或者第一鏈和靶核酸之間形成的二聯體可包括至少15個核苷酸，其中在形成所述雙鏈結構的所述第一鏈和靶核酸之間有I個或2個錯配。在某些情況下，第一鏈和第二鏈都各自包括至少一組的修飾核苷酸和至少一側翼組的核苷酸，每組修飾核苷酸包括至少一個核苷酸，而每個側翼組核苷酸包括至少一個核苷酸，第一鏈的每組修飾核苷酸與第二鏈的側翼核苷酸組對齊，第一鏈的最末端5』核苷酸是修飾核苷酸組的核苷酸，第二鏈的最末段3』核苷酸是側翼組核苷酸的核苷酸。每組修飾核苷酸可由單個核苷酸組成和/或每側翼組核苷酸可由單個核苷酸組成。此外,可能在第一鏈上,形成核苷酸側翼組的核苷酸是未修飾的核苷酸，其被布置在相對於形成修飾核苷酸組的核苷酸的3』方向，在第二鏈上，形成修飾核苷酸組的核苷酸是修飾的核苷酸，其被布置在相對於形成核苷酸側翼組的核苷酸的5』方向。siRNA的第一鏈還可包括8至12個，優選9至11個修飾核苷酸組，第二鏈可包括7至11個，優選8至10個修飾核苷酸組。第一鏈和第二鏈可由環結構連接，該環可包括非核酸的聚合物，諸如聚乙二醇及其它。可替換地，環結構可包括核酸。此外，siRNA第一鏈的5』 -末端可連接到第二鏈的3』 -末端,或第一鏈的3』 -末端可連接到第二鏈的5』 -末端，所述連接可通過核酸連接物，其通常具有10-2000核酸鹼基。尤其是，本發明提供一種具有結構A的化合物5' (N)x-Z 3'(反義鏈)3' V -(N/ )y 5'(有義鏈)其中每個N和N』是核糖核酸，其糖殘基中可為修飾或未修飾的，而且(N)dP (N')y是寡聚物，其中每個連續的N或N』由共價鍵連接至下一 N或N』 ；其中每個X和y是19和40之間的整數；其中每個Z和V可存在或不存在，但如果存在時為dTdT，並且共價地連接於其所存在的鏈的3』末端；而且，其中(N)x的序列包括對p53mRNA的反義序列，尤其是存在於表A、B和C中的任何反義鏈。本領域技術人員易於理解的是，本發明化合物由多個核苷酸組成，其通過共價鍵連接。每個這樣的共價鍵可以是磷酸二酯鍵、硫代磷酸酯鍵、或兩者的組合，沿著各鏈的核苷酸序列的長度。其它可能的骨架修飾描述於美國專利No. 5，587，361 ;6，242，589 ；6，277，967 ;6，326，358 ;5，399，676 ;5，489，677 ;和 5，596，086。在特定實施方案中，X和y優選為約19至約27的整數，最優選地從約19至約23。在本發明化合物的特定實施方案中，X可等於y (即X = y)，並且在優選實施方案中，x = y=19或X = y = 21。在特別優選的實施方案中X = y = 19。在本發明化合物一個實施方案中，Z和Z'都不存在；在另一實施方案中，Z或Z'
之一存在。 在本發明化合物一個實施方案中，化合物所有核糖核苷酸在其糖殘基上都未修飾。在本發明化合物一個優選實施方案中，至少一個核糖核苷酸在其糖殘基上修飾，優選地在2』位點修飾。在2』位點的修飾導致存在一個基團，其優選地選自氨基、氟、甲氧基、烷氧基和烷基。在存在時最優選實施方案中，在2』位的基團是甲氧基(2' -0-甲基)。在本發明優選的實施方案中，化合物反義鏈和有義鏈內的交替核糖核苷酸被修飾。尤其是用於實施例的siRNA已被如此修飾，在反義鏈的第一、第三、第五、第七、第九、第十一、第十三、第十五、第十七和第十九核苷酸上存在2' O-Me基團，而同樣的修飾即2，O-Me基團存在於有義鏈的第二、第四、第六、第八、第十、第十二、第十四、第十六和第十八核苷酸。此外，應注意的是，在根據本發明這些特定核酸的情況下，第一伸展與第一鏈相同，第二伸展與第二鏈相同，並且這些核酸也是平頭的。在特別優選的實施方案中，siRNA的序列是表A中的15。根據本發明一個優選實施方案，siRNA的反義鏈和有義鏈僅在3』 -末端而不是5』 -末端磷酸化。根據本發明另一優選實施方案，反義鏈和有義鏈在3』 -末端和5』 -末端都未磷酸化。根據本發明另一優選實施方案，有義鏈5』位置的第一個核苷酸被特殊地修飾以取消體內任何5』 -磷酸化的可能。在本發明化合物的另一個實施方案中，反義鏈5』和3』末端的核苷酸在其糖殘基上修飾，有義鏈5』和3』末端的核苷酸在其糖殘基上未修飾。本發明還提供了一種媒介物，其能夠以未修飾形式在細胞中表達任何上述的寡核糖核苷酸，之後可進行合適的修飾。本發明還提供了一種組合物，其包括在載體中的本發明一種或多種化合物，該載體優選為藥物可接受的載體。此組合物可包括兩種或多種不同siRNA的混合物。本發明還提供了一種組合物，其包括本發明上述化合物，其共價或非共價地連接於本發明一種或多種化合物，以足以有效抑制人類P53的量，以及載體。該組合物可在胞內由內源胞內複合體處理以產生本發明的一種或多種寡核糖核苷酸。本發明還提供了一種組合物，其包括載體和足以有效下調細胞中人類p53表達的量的本發明一種或多種化合物，所述化合物包括大致互補於(N)x序列的序列。此外本發明提供了一種與對照相比至少50%下調基因p53表達的方法，包括將基因p53mRNA轉錄子接觸本發明一種或多種化合物。
在一個實施方案中，所述寡核糖核苷酸是下調p53，而p53的下調選自p53功能的下調、p53多肽的下調和p53mRNA表達的下調。在一個實施方案中，所述化合物是下調p53多肽，而p53的下調選自p53功能的下調(可由酶檢測或與已知天然基因/多肽的相互作用子的結合檢測而檢查，及其它)、P53蛋白的下調(可由Western blotting、ELISA或免疫沉澱而檢查,及其它)和p53mRNA表達的下調(可由Northern blotting、定量RT-PCR、原位雜交或微陣列雜交而檢查,及其它)。本發明還提供了一種治療患有伴有p53多肽水平升高疾病的患者的方法，該方法包括給藥患者治療有效劑量的本發明組合物籍此治療患者。優選地，本發明提供了一種治療患有一種疾病的患者的方法，其中P53的暫時抑制是有利的。在一個優選的實施方案中，本發明的組合物與常規化療或放療一起用於治療腫瘤，以防止化療或放療相關的脫髮。在另一優選實施方案中，本發明組合物用於治療急性腎衰竭。在另一優選實施方案中，本發明組合物用於一些疾患，其中P53被激活，原因為與損傷相關的各種刺激，損傷例如燒傷、體溫過高、與受阻的血供應如心肌梗塞、中風、和缺血中相關的缺氧。使用本發明siRNA分子 暫時抑制P53可治療性地有效減少或消除中樞神經系統中p53依賴性神經元死亡，即腦和脊髓損傷，在移植前保存組織和器官，準備用於骨髓移植的宿主，減輕或消除癲癇發作期間的神經元損傷和抑制組織衰老。本發明還提供了治療有效劑量的一種或多種本發明化合物用於製備組合物的用途，所述組合物用於治療伴有P53多肽水平升高的疾病，諸如在患有脫髮或急性腎衰竭的患者中。更具體地，本發明提供了一種寡核糖核苷酸，其中一條鏈包括連續的核苷酸，其具有從5』到3』的SEQ ID NO :3-25(表A，有義鏈)或SEQ ID NO :49-119 (表B，有義鏈)或SEQ ID NO :191-253(表C，有義鏈)或其同源物所列序列，其中每個末端區域中多至2個核
苷酸中有一個鹼基被改變。寡核糖核苷酸的末端區域是指19-mer序列中鹼基1_4和/或16_19和21_mer序列中鹼基1-4和/或18-21。此外，本發明提供了寡核糖核苷酸，其中一條鏈包括連續的核苷酸，其具有從5』到3』 的 SEQ ID NO :26-48(表 A，反義鏈)或 SEQ ID NO : 120-190 (表 B，反義鏈)或 SEQ IDNO =254-316 (表C，反義鏈)或其同源物所列序列，其中每個末端區域中多至2個核苷酸中
有一個鹼基被改變。本發明優選的寡核糖核苷酸是表D中人類p53寡核糖核苷酸系列號3、5、20和23以及表E中小鼠p53寡核糖核苷酸系列號111、12、14、17和18。這些等同於表A中系列號
3、5、20和23(人類)以及11、12、14、17和18(小鼠)。本發明最優選的寡核糖核苷酸是人類P53寡核糖核苷酸，其具有表A中系列號23的序列。本發明目前最優選的化合物是平頭的19-mer寡核糖核苷酸，即x = y = 19且Z和V都不存在。寡核糖核苷酸分子在有義鏈和反義鏈的3』末端都磷酸化，或都未磷酸化；或有義鏈5』位置的第一個核苷酸被特殊地修飾以取消體內任何5』 -磷酸化的可能。可替換的核糖核酸在反義鏈和有義鏈的2』位置都修飾，其中2』位置的基團是甲氧基(2' -0-甲基)，且其中反義鏈5』和3』末端的核糖核酸在其糖殘基被修飾，有義鏈5』和3』末端的核糖核酸在其糖殘基未被修飾。目前最優選的這種化合物是如此修飾的寡核糖核苷酸，其包括表A系列號23的序列。在本發明的一個方面，寡核糖核苷酸包括雙鏈結構，從而這樣的雙鏈結構包括第一鏈和第二鏈，而第一鏈包括連續核苷酸的第一伸展，和第二鏈包括連續核苷酸的第二伸展，而第一伸展與編碼p53的核酸序列互補或相同，和第二伸展與編碼p53的核酸序列相同或互補。在一個實施方案中，第一伸展和/或第二伸展包括從約14至40個核苷酸，優選地約18至30個核苷酸，更優選地從約19至27個核苷酸，最優選地從約19至23個核苷酸，尤其是從約19至21個核苷酸。在這樣的實施方案中，寡核糖核苷酸長度可從17-40核苷酸。此外，根據本發明的核酸進一步包括表中所列多核苷酸中任一個的至少14個連續核苷酸，並優選地在雙鏈結構任一末端的14個連續核苷酸鹼基對，所述雙鏈結構由如上所述的第一伸展和第二伸展組成。在一個實施方案中第一伸展包括寡核糖核苷酸的至少14個連續核苷酸的序列，而這樣的寡核糖核苷酸選自SEQ. ID. No 3-316，優選地選自具有表A系列號3、5、20或23(人類)或系列號11、12、14、17和18 (小鼠)任一序列的寡核糖核苷酸，更優選地選自具有表A系列號3、5、20或23任一序列的寡核糖核苷酸。此外，根據本發明其它的核酸包括任一 SEQ. ID. No 3至316的至少14個連續核苷酸，更優選地在雙鏈結構任一末端包括14個連續核苷酸鹼基對,所述雙鏈結構由如上所述的第一伸展和第二伸展組成。本領域技術人員應理解的是，儘管給出了根據本發明核酸的可能長度，尤其是形成根據本發明核酸的單個伸展的，相對於P53編碼序列向各側的一些移位是可能的，這樣的移位可在兩個方向為1、2、3、4、5和6個核苷酸,這樣產生的雙鏈核酸分子仍在本發明範圍內。傳輸已經開發了專門針對於增強並改善siRNA向哺乳動物細胞的傳輸的傳輸系統，見於例如 Shen 等(FEBS letters 539 :111-114 (2003))，Xia 等 ，NatureBiotechnology 20 :1006-1010 (2002)，Reich 等.，Molecular Vision 9 :210-216 (2003)，Sorensen 等 (J. Mol. Biol. 327 :761-766(2003), Lewis 等.，Nature Genetics 32:107-108(2002)和 Simeoni 等，Nucleic Acids Research 31,11 :2717-2724 (2003)。近來siRNA已經成功用於靈長類中的抑制；詳情請見Tolentino等.，Retina 24 (I) February20041 132-138。siRNA的呼吸製劑描述於Davis等人的美國專利申請No. 2004/0063654。膽固醇-軛合的siRNA(及其它類固醇和脂質軛合的siRNA)可用於傳輸,見Soutschek等Nature432 :173-177 (2004)Therapeutic silencing of an endogenous gene by systemicadministration of modified siRNAs ;和 Lorenz 等 Bioorg. Med. Chemistry. Lett. 14 :4975-4977(2004)Steroid and lipid conjugates of siRNAs to enhance cellularuptake and gene silencing in liver cells。本發明的siRNA或藥物組合物根據良好醫療實踐給藥和確定劑量，並考慮個別患者的臨床情況，所治療疾病，給藥位置和方法，給藥方案，患者年齡，性別，體重和對醫療執業者已知的其它因素。「治療有效劑量」是根據如本領域已知的這些考慮而確定。該劑量必須有效達到、改善，包括但不限於改善的存活率或更快的恢復，或改善或消除症狀和由本領域技術人員選作合適測量的其它指徵。本發明化合物可由任何常規給藥途徑給藥。應注意的是，該化合物可作為化合物或作為藥學上可接收的鹽給藥，而且可單獨給藥或作為有效成分結合藥物可接受的載體、溶劑、稀釋劑、賦形劑、佐劑和媒介物給藥。化合物可口服、皮下或非胃腸包括靜脈內、動脈內、肌內、腹膜內以及鼻內，和鞘膜內和灌注技術給藥。化合物的植入也是有用的。可製備液態形式用於注射，該術語包括皮下、經皮、靜脈內、肌內、鞘膜內和其它非胃腸給藥途徑。液態組合物包括含水溶液，帶有或不帶有有機共溶劑、水性或油性懸浮液，帶有食用油的乳劑，以及類似的藥物賦形物。此外，在一些情況下，用於本發明新型治療的組合物可配製為用於鼻內和類似給藥的氣溶膠。所治療的患者是溫血動物，尤其是哺乳動物包括人類。藥物可接受的載體、溶劑 、稀釋劑、賦形劑、佐劑和賦形物以及植入載體通常是指惰性、非毒性、不與本發明活性成分反應的固態或液態填充物、稀釋物或包被物質，包括脂質體和微球。用於本發明的傳輸系統的例子包括美國專利No. 5，225，182 ;5，169，383 ；5，167，616 ;4，959，217 ;4，925，678 ;4，487，603 ;4，486，194 ;4，447，233 ;4，447，224 ；4，439，196 ;和4，475，196。許多其它這樣的植入物、傳輸系統和組件對本領域技術人員而言是熟知的。在本發明的一個特定實施方案中，尤其優選局部和經皮製劑。—般地,用於人類的化合物活性劑量在每天lng/kg至約20_100mg/kg體重的範圍，優選每天約0. Olmg至約2-10mg/kg體重，以每天一個劑量或每天給藥2次或3次或更多次，持續1-4周或更長的給藥方案。應注意的是，根據本發明SiRNA化合物在腎近曲小管中向靶細胞的傳輸尤其有效地治療急性腎衰竭。不受限於理論，這可能是因為正常siRNA分子是經過腎近曲小管的細胞從身體分泌。因此，裸siRNA分子是天然集中在急性腎衰竭治療所靶向的細胞中。這裡所用的術語「治療」是指給藥治療物質，以有效地改善疾病相關的症狀，以減輕疾病的嚴重度或治癒疾病，或以防止疾病發生。在特定實施方案中，給藥包括靜脈內給藥。在另一特定實施方案中，給藥包括局部或部位給藥。本發明另一方面是一種治療患有脫髮或急性腎衰竭或伴有p53多肽水平升高的疾患的方法，包括向患者給藥有效量的本發明藥物組合物以治療患者。在治療脫髮的優選實施方案中，給藥包括局部或部位給藥。在另一優選實施方案中，給藥包括經皮給藥。在特定實施方案中，藥物組合物施用於患者頭皮。在治療ARF的優選實施方案中，給藥包括靜脈內、動脈內或腹膜內給藥。本發明的另一方面是對經受可導致脫髮治療的患者預防脫髮的方法，包括向患者給藥治療有效量的本發明藥物組合物以治療患者。本發明另一方面提供了一種藥物組合物，其包括任何上述寡核糖核苷酸(SEQ IDNO 3-316)或媒介物和藥學上可接受載體。本發明另一方面是治療有效量的任何上述寡核糖核苷酸(SEQ ID NO 3-316)或媒介物用於製備促進患者恢復的藥劑的用途，該患者患有脫髮或急性腎衰竭或伴有P53水平升高的疾患。在優選實施方案中，該藥劑包括局部藥劑。在特定實施方案中，該藥劑施用於患者頭皮。在另一優選實施方案中，該藥劑包括經皮給藥。在本發明上述所有方面，脫髮可由化療或放療誘導，並稱為「毒性脫髮」。詳細地說，毒性脫髮可由輻射如Y輻射或化療劑引起，化療劑如依託泊苷、5-FU (5-氟尿嘧啶)、順鉬、多柔比星、長春花鹼、長春新鹼、長春鹼、長春瑞濱、紫杉醇、環磷醯胺、異磷醯胺、苯丁酸氮芥、白消安、氮芥、絲裂黴素、達卡巴嗪、碳鉬、塞替派、柔紅黴素、伊達比星、米託蒽醌、博來黴素、埃斯波黴素A l(esperamicin Al)、更生黴素、普卡黴素、卡莫司汀、洛莫司汀、牛磺莫司汀、鏈佐星、美法侖、更生黴素、丙卡巴肼、地塞米松、潑尼松、2-氯脫氧腺苷、阿糖胞苷、多西紫杉醇、氟達拉濱、吉西他濱、赫賽汀、羥基脲、伊立替康、甲氨喋呤、奧沙利鉬、rituxin、司莫司汀、表柔比星、依託泊苷、tomudex (雷替曲塞)和託泊替康,或這些化療劑之一的化學類似物。非常可能導致脫髮的化療劑為順鉬、阿糖胞苷、環磷醯胺、多柔比星、表柔比星、依託泊苷、異磷醯胺和長春新鹼。本發明的化合物優選地用於治療急性腎衰竭，尤其是在術後患者由於缺血的急性腎衰竭，和由於如給藥順鉬化療的急性腎衰竭或敗血病相關的急性腎衰竭。本發明化合物優選用途是對經受大的心臟手術或血管手術的高風險患者預防急性腎衰竭。有高風險發展急性腎衰竭的患者可使用各種打分方法識別，如Cleveland Clinic algorithm或美國Academic Hospitals (QMMI)和 Veterans' Administration (CICSS)開發的方法。本發明化 合物其它優選用途是預防腎移植患者的缺血性急性腎衰竭，或預防接受化療的患者的毒性急性腎衰竭。其它用途是創傷癒合、急性肝衰竭、順鉬誘導的耳聾(可能局部地)、造血幹細胞的體外擴增、在移植前通過把供體器官/組織浸泡於siRNA溶液(可能通過電穿孔)而保存以及在移植後促進移植組織存活。其它適應症可以是中風、帕金森病、阿爾茨海默病、多柔比星引起的心毒性、心肌梗塞/心衰竭並在移植後改善移植組織存活(由全身給藥)。不束縛於理論，所有這些疾病都伴有p53多肽水平的升高。本發明還提供了一種製備藥物組合物的方法，包括獲得本發明的一種或多種雙鏈化合物；和將所述化合物與藥物上可接受載體混合。本發明還提供了一種製備藥物組合物的方法，包括將本發明一種或多種化合物與藥物上可接受載體混合。在優選實施方案中，用於製備藥物組合物的化合物以藥物有效劑量與載體混合。在特定實施方案，本發明化合物與類固醇或脂質或另一種合適的分子如膽固醇軛合。可引入核苷酸的修飾或類似物以改進核苷酸的治療特性。改善的特性包括改善的核酶抗性和/或對滲透細胞膜能力的增加。因此，本發明還包括本發明寡核糖核苷酸的所有類似物、或修飾物，只要其基本上不影響多核苷酸或寡核糖核苷酸的功能。在優選實施方案中，這種修飾涉及核苷酸的鹼基部分，涉及核苷酸的糖基和/或涉及核苷酸的磷酸酯部分。在本發明實施方案中，核苷酸可選自天然存在的或合成修飾的鹼基。天然存在的鹼基包括腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶。修飾的寡核苷酸包括肌苷、黃嘌呤、次黃嘌呤、2-氨基腺嘌呤、6-甲基_、2-丙基-和其它烷基-腺嘌呤、5-滷代尿嘧啶、5-滷代胞嘧啶、6-氮雜胞嘧啶和6-氮雜胸腺嘧啶、假尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、8-滷代腺嘌呤、8-氨基腺嘌呤、8-巰基腺嘌呤、8-巰基烷基腺嘌呤、8-羥基腺嘌呤和其它8-取代的腺嘌呤、8-滷代鳥嘌呤、8-氨基鳥嘌呤、8-巰基鳥嘌呤、8-巰基烷基鳥嘌呤8-羥基鳥嘌呤和其它取代的鳥嘌呤、其它氮雜和去氮雜(deaza)腺嘌呤、其它氮雜和去氮雜鳥嘌呤、5_三氟甲基尿嘧啶和5-三氟胞嘧啶。此外，可製備核苷酸的類似物，其中核苷酸的結構被根本地改變，更適於作為治療劑或實驗試劑。核 苷酸類似物的一個例子是肽核酸(PNA)，其中DNA(或RNA)中的脫氧核糖(或核糖)磷酸酯骨架以類似於肽中的多醯胺骨架代替。PNA類似物已經顯示為抗酶的降解並在體內和體外壽命延長。而且，PNA已經顯示為比DNA分子更強地結合互補DNA序列。這個結果歸因於PNA鏈與DNA鏈之間缺少電荷排斥。可對寡核苷酸進行其它修飾，包括聚合物骨架、環骨架或非環的骨架。在一個實施方案中，所述修飾是對磷酸酯部分的修飾，修飾的磷酸酯部分選自硫代磷酸酯。本發明化合物可由本領域熟知的任何用於合成核糖核酸(或脫氧核糖核酸)寡核苷酸的方法合成。這樣的合成如描述於Beaucage S. L. and Iyer R. P. , Tetrahedron1992 ；48 :2223-2311, Beaucage S.L. and Iyer R. P. , Tetrahedron 1993；49 :6123-6194和 Caruthers M. H. et. al.，Methods EnzymoI. 1987 ； 154 :287-313 ;硫代酯的合成描述於Eckstein F.，Annu. Rev. Biochem. 1985 ；54 :367-402, RNA 分子的合成描述於 Sproat B.，in Humana Press 2005edited by Herdewijn P. ;Kap. 2 :17-31,相應的下遊工藝描述於Pingoud A. et. al. , in IRL Press 1989 edited by Oliver R. ff. A. ；Kap. 7 :183-208 和Sproat B. , in Humana Press 2005 edited by Herdewijn P. ；Kap. 2 :17-31(同上)。其它合成步驟是本領域已知的，如描述於Usman等.，1987, J. Am. Chem. Soc, 109,7845 ；Scaringe 等.,1990, Nucleic Acids Res. ,18,5433 ；ffincott 等.,1995, NucleicAcids Res. 23,2677-2684 ;和 Wincott 等.，1997，Methods Mol. Bio.，74，59，和這些步驟可用於普通的核酸保護和偶聯基團，諸如在5』 -末端二甲氧基三苯甲基，在3』 -末端亞磷醯胺。修飾的(如2' -0-甲基化)核苷酸和未修飾的核苷酸如期望的合併。本發明的寡核糖核苷酸可單獨合成並在合成後結合在一起，例如由連接反應(ligation) (Moore 等 ，1992, Science 256,9923 ；Draper 等 ，國際 PCT 公布No. W093/23569 ；Shabarova 等 ，1991, Nucleic Acids Research 19,4247 ；Bellon 等 ，1997,Nucleosides&Nucleotides, 16,951 ；Bellon 等.，1997,Bioconjugate Chem. 8,204)，或在合成後雜交和/或脫保護。應注意的是,可使用市場銷售的機器(如從Applied Biosystems及其它可得的)；寡核糖核苷酸可根據此處所公開的序列製備。化學合成片段的重疊對可使用本領域已知方法連接(如見美國專利No. 6，121，426)。單獨合成各鏈，然後在管中互相退火。然後，以HPLC從未退火的單鏈寡核苷酸(如因為其中一個過量)分離雙鏈siRNA。關於本發明的siRNA或siRNA片段，可合成兩種或多種這樣的序列並結合以用於本發明。本發明的化合物還可由串聯合成方法合成，如描述於美國專利申請公開No. US2004/0019001 (McSwiggen)，其中兩條siRNA鏈作為單個連續的寡核苷酸片段或鏈合成，其由可裂解的連接物分開，連接物隨後裂解以提供單獨的siRNA片段或鏈，它們雜交並允許siRNA 二聯體的純化。連接物可為多核苷酸連接物或非核苷酸連接物。本發明還提供了一種藥物組合物，其包括兩種或多種用於治療任何此處所述疾病或疾患的siRNA分子，所述兩種分子可以產生等效或有利活性的量物理性混合在藥物組合物中，或可共價或非共價結合，或由核酸連接物連接，連接物長度從2-100，優選2-50或2-30核苷酸。在一個實施方案中，siRNA包括此處所述的雙鏈核酸結構，其中兩個siRNA序列選自表A-C，優選選自表A，ID No :3、5、20和23 (人類序列)和11、12、14、17和18(小鼠序列)。在另一實施方案中，siRNA分子包括雙鏈核酸結構，其中第一 siRNA序列選自表A-C，優選選自表A，ID No :3、5、20和23 (人類p53序列)和11、12、14、17和18(小鼠p53序列)，和第二 siRNA序列靶向於凋亡前基因，從而提供有利活性。包括兩或多個siRNA序列的串聯雙鏈結構在胞內加工以形成兩或多種不同siRNA。這樣的第二 siRNA分子優選為靶向於凋亡前基因的siRNA分子。siRNA分子共價或非共價地結合或由連接物連接以形成串聯siRNA分子。這樣的串聯siRNA分子包括兩個siRNA序列，通常長約38-150核苷酸，更優選38或40-60核苷酸或如果超過兩個siRNA序列包括在串聯分子中則相應更長。長的串聯分子包括兩或多個編碼siRNA的長序列，由胞內處理產生，如長dsRNA，也包括作為編碼兩或多個shRNA的串聯分子。這樣的串聯分子也認為是本發明的一部分。
靶向P53的siRNA分子可為藥物組合物中的活性成分，或可為含有兩種或多種siRNA(或編碼或內源產生兩或多種siRNA的分子，使它成為分子與一種或多種編碼兩種或多種siRNA的串聯分子的混合物)的藥物組合物的一種活性成分,所述藥物組合物還包括一種或多種另外的、靶向一種或多種另外基因的siRNA分子。同時p53和所述另外基因的抑制將對治療此處所述疾病具有加和或協同效應。在特定實施例，用於治療此處所述疾病的藥物組合物可包括以下化合物的聯合l)p53siRNA 和 Fas siRNA ;2)p53siRNA 和 Bax siRNA ;3)p53siRNA 和 Noxa siRNA ；4)p53siRNA 和 Puma siRNA ；5)p53siRNA 和 RTP801siRNA ;6)p53siRNA 和 PIDD siRNA ；7)p53siRNA, Fas siRNA 和 RTP801siRNA，Bax siRNA, Noxa siRNA 或 Puma siRNA 或 PIDDsiRNA的任一個，以形成三聚體或聚合物(即，編碼三個siRNA的串聯分子)。其它可聯合 53^1 嫩的優選凋亡前基因為1即[1、細胞凋亡蛋白酶2、細胞凋亡蛋白酶3、細胞凋亡蛋白酶9、E2F1和PARP-I。根據本發明，優選的聯合是p53siRNA和RTP801siRNA (見PCT專利申請 PCT/EP2005/008891)。此外，p53siRNA或任何包括或編碼p53siRNA的核酸分子可連接(共價或非共價)於針對表達於靶細胞上的細胞表面可內化分子的抗體，以達到增強的靶向從而治療此處所述疾病。例如，抗-Fas抗體(優選中和抗體)可與p53siRNA分子聯合。本發明化合物可直接傳輸或經由病毒或非病毒媒介物傳輸。直接傳輸時，序列通常被賦予核酸酶抗性。可替換地，所述序列可併入表達框或構建體，從而序列如下討論地表達於細胞。一般構建體含有合適的調節序列或啟動子以允許序列表達於靶細胞。任選用於傳輸本發明化合物的媒介物是市場可得的，可為了傳輸本發明化合物而由本領域已知方法修飾。還考慮一種長的包括一個或多個主幹和環結構的寡核苷酸(通常長25-500核苷酸)，其中主幹區包括本發明的寡核苷酸序列，可以載體傳輸，優選以藥學上可接受載體，並在胞內由內源細胞複合體(如上所述的DROSHA和DICER)加工以產生一個或多個較小的雙鏈寡核苷酸(siRNA)即本發明的寡核苷酸。該寡核苷酸可稱為串聯shRNA構建體。考慮這種長寡核苷酸是包括一個或多個主幹和環結構的單鏈寡核苷酸，其中每個主幹區包括P53基因的有義和相應反義siRNA序列。尤其是，考慮這種寡核苷酸包括如任一表A、B或C所列的有義和反義siRNA序列。如此處所用，術語「多肽」是指除了多肽以外的寡肽、肽和全蛋白。p53失活化合物的篩選:本發明的 一些化合物和組合物可用於篩選檢測，以鑑定和分離調節p53活性的化合物，尤其是調節脫髮或急性腎衰竭或伴有P53多肽水平升高的疾患的化合物。待篩選的化合物包括諸如小化學分子和反義寡核苷酸等物質。本發明化合物對p53多肽活性的抑制活性或本發明化合物對p53的結合可用於確定另外化合物與P53多肽的相互作用，如，是否另外化合物與本發明寡核苷酸競爭對p53的抑制，或者該另外化合物救助所述抑制。可由各種方式檢測抑制或活化，如，及其它，檢測P53多肽活性產物，或在放射性或螢光競爭檢測中代替從p53多肽的結合化合物。以下參考實施例詳細說明本發明，但不是教導僅限於此。此處對任何文件的引用不意味一種認可，即該文件是有關現有技術，或認為對本申請任何權利要求的專利性(相關)的材料。對任何文件的內容或日期的任何引證是基於申請人在提交時可得的信息，不構成對這種引證正確性的確認。
實施例分子生物學一般方法本領域中已知的標準分子生物學技術，未特殊描述的，為以下Sambrook等.，Molecular Cloning A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press, NewYork(1989),和 Ausubel 等 ，Current Protocols in Molecular Biology, John Wileyand Sons, Baltimore, Maryland(1989)和 Perbal, A Practical Guide to MolecularCloning,John ffiley&Sons,New York(1988),和Watson等 ，Recombinant DNA,ScientificAmerican Books, New York 和 Birren 等(eds)Genome Analysis A Laboratory ManualSeries, Vols. 1-4 Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York(1998)中以及美國專利 4，666，828 ；4, 683，202 ；4, 801，531 ；5, 192，659 和 5，272，057 中所述的方法，並引入這裡作為參考。聚合酶鏈式反應(PCR)以PCR實驗方案一般進行A Guide To Methods AndApplications, Academic Press, San Diego, CA(1990)。原位(細胞中)PCR 結合流式細胞術可用於檢測含有特定DNA和mRNA序列的細胞(Testoni等.，1996，Blood 87 :3822)。進行RT-PCR的方法是本領域中已知的。實施例I :產生活性siRNA化合物的序列使用專用的算法和基因p53的已知序列(SEQ ID NO : I)，產生許多可能的siRNA的序列。表A展示了 23種siRNA，它們目前已被選擇、化學合成和測試活性(見實施例2)。所有 siRNA 是 19-mer。表A23獻 卜文 NA
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I_I I_I fnp獲知(Dira 和 cBernards, Reversal of senescence in mouse fibroblasts throughlentiviral suppression of p53, J. Biol. Chem. (2003)278 :11731), siRNA No 2 (SEQ IDNO 4 和 27)也從文獻獲知(Brummelkamp 等 Science 2002,296 :550-553)。然而，這些化合物用於此處所述治療方法的用途以前未公開，因此是新穎的。
下面的表B展示了 71種另外的19-mer siRNA,它們已由專用算法產生。表B
權利要求
1.一種雙鏈RNA化合物，其具有以下結構 反義鏈5' (N)x-Z 3/ ； 有義鏈3' V _(N』)y5'； 其中每個N和N』是未修飾的核糖核苷酸或2』-O-甲基糖修飾的核糖核苷酸，並且每個連續的核糖核苷酸由共價鍵連接至下一個核糖核苷酸； 其中 X = y = 19 ; 其中Z和V中的每個可存在或不存在，但如果存在時為dTdT，並且共價地連接於其所存在的鏈的3』末端； 其中在所述反義鏈和所述有義鏈中的交替核糖核苷酸是2』 -0-甲基糖修飾的核糖核苷酸； 其中2』-0_甲基糖修飾的核糖核苷酸存在於所述反義鏈的5』末端和3』末端而未修飾的核糖核苷酸存在於所述有義鏈的5』末端和3』末端；並且 其中(N)x 選自 SEQ ID NO 30,SEQ ID NO :45、SEQ ID NO :28 或 SEQ ID N0:46 中的任何一個。
2.如權利要求I所述的雙鏈RNA化合物，其中所述共價鍵是磷酸二酯鍵。
3.如權利要求I或2所述的雙鏈RNA化合物，其中Z和Z'都不存在。
4.如權利要求I或2所述的雙鏈RNA化合物，其中所述反義鏈和所述有義鏈在3』末端和5』末端是非磷酸化的。
5.如權利要求I至3中任一項所述的雙鏈RNA化合物，其中所述反義鏈和所述有義鏈在3』末端是磷酸化的。
6.一種雙鏈RNA化合物，其由以下結構組成 反義鏈 SEQ ID NO :30 :5，aaaucauccauugcuuggg 3， 有義鏈 SEQ ID NO 7 :3，uuuaguagguaacgaaccc 5， 其中a、C、u和g中的每一個是未修飾的核糖核苷酸或2』 -0-甲基糖修飾的核糖核苷酸，並且每個連續的核糖核苷酸由共價鍵連接至下一個核糖核苷酸； 其中在所述反義鏈中第一、第三、第五、第七、第九、第十一、第十三、第十五、第十七和第十九核糖核苷酸中的每一個是2』 -0-甲基糖修飾的核糖核苷酸；並且 其中在所述有義鏈中第二、第四、第六、第八、第十、第十二、第十四、第十六和第十八核糖核苷酸中的每一個是2』 -0-甲基糖修飾的核糖核苷酸。
7.一種雙鏈RNA化合物，其由以下結構組成反義鏈 SEQ ID NO 45 :5』 caaauuuccuuccacucgg 3』 有義鏈 SEQ ID NO :22 :3，guuuaaaggaaggugagcc 5， 其中a、C、u和g中的每一個是未修飾的核糖核苷酸或2』 -0-甲基糖修飾的核糖核苷酸，並且每個連續的核糖核苷酸由共價鍵連接至下一個核糖核苷酸； 其中在所述反義鏈中第一、第三、第五、第七、第九、第十一、第十三、第十五、第十七和第十九核糖核苷酸中的每一個是2』 -0-甲基糖修飾的核糖核苷酸；並且 其中在所述有義鏈中第二、第四、第六、第八、第十、第十二、第十四、第十六和第十八核糖核苷酸中的每一個是2』 -0-甲基糖修飾的核糖核苷酸。
8.一種雙鏈RNA化合物，其由以下結構組成反義鏈 SEQ ID NO :28 :5，aguaguuuccauaggucug 3，有義鏈 SEQ ID NO 5 -.39 ucaucaaagguauccagac 5， 其中a、C、u和g中的每一個是未修飾的核糖核苷酸或2』 -O-甲基糖修飾的核糖核苷酸，並且每個連續的核糖核苷酸由共價鍵連接至下一個核糖核苷酸； 其中在所述反義鏈中第一、第三、第五、第七、第九、第十一、第十三、第十五、第十七和第十九核糖核苷酸中的每一個是2』 -0-甲基糖修飾的核糖核苷酸；並且 其中在所述有義鏈中第二、第四、第六、第八、第十、第十二、第十四、第十六和第十八核糖核苷酸中的每一個是2』 -0-甲基糖修飾的核糖核苷酸。
9.一種雙鏈RNA化合物，其由以下結構組成反義鏈 SEQ ID NO :46 :5，gucgaaaaguguuucuguc 3，有義鏈 SEQ ID NO :23 :3，cagcuuuucacaaagacag 5， 其中a、C、u和g中的每一個是未修飾的核糖核苷酸或2』 -0-甲基糖修飾的核糖核苷酸，並且每個連續的核糖核苷酸由共價鍵連接至下一個核糖核苷酸； 其中在所述反義鏈中第一、第三、第五、第七、第九、第十一、第十三、第十五、第十七和第十九核糖核苷酸中的每一個是2』 -0-甲基糖修飾的核糖核苷酸；並且 其中在所述有義鏈中第二、第四、第六、第八、第十、第十二、第十四、第十六和第十八核糖核苷酸中的每一個是2』 -0-甲基糖修飾的核糖核苷酸。
10.如權利要求6至9中任一項所述的雙鏈RNA化合物，其中所述共價鍵是磷酸二酯鍵。
11.如權利要求10所述的雙鏈RNA化合物，其中所述反義鏈和所述有義鏈在3』末端和5』末端是非磷酸化的。
12.如權利要求10所述的雙鏈RNA化合物，其中所述反義鏈和所述有義鏈在3』末端是磷酸化的。
13.一種藥物組合物，其包括權利要求I至12中任一項所述的雙鏈RNA化合物和藥物可接受的載體。
14.如權利要求13所述的藥物組合物，其中所述雙鏈RNA化合物以有效下調人類p53基因表達的量存在。
15.權利要求I至12中任一項所述的雙鏈RNA化合物在製備用於治療患有疾患的患者的藥物中的應用。
16.如權利要求15所述的應用，其中所述患者在較大手術後處於發展急性腎衰竭的高風險。
17.如權利要求15所述的應用，其中所述疾患是順鉬誘導的耳聾。
18.如權利要求17所述的應用，其中所述藥物製備為用於局部給藥。
19.如權利要求15所述的應用，其中所述疾患是順鉬誘導的脫髮。
20.如權利要求15所述的應用，其中所述患者患有急性腎衰竭或具有患急性腎衰竭的風險。
21.如權利要求15所述的應用，其中所述患者是遭受缺血再灌注損傷或具有缺血再灌注損傷的風險的手術患者。
22.權利要求I至12中任一項所述的雙鏈RNA化合物在製備用於預防經受大手術的患者急性腎衰竭的藥物中的應用。
23.如權利要求16或22所述的應用，其中所述手術是心臟手術。
24.如權利要求22所述的應用，其中所述患者是腎移植患者。
25.一種與對照相比下調p53基因表達至少50%的方法，包括使所述p53基因的mRNA轉錄子接觸權利要求I至12中任一項所述的雙鏈RNA化合物。
26.權利要求I至12中任一項所述的雙鏈RNA化合物用於製備治療或預防伴有p53多肽水平升高的疾病或疾患的藥物的應用。
全文摘要
本發明涉及一種雙鏈化合物，優選一種寡核糖核苷酸，其下調人類p53基因的表達。本發明還涉及一種藥物組合物，它含有該化合物，或能夠表達該寡核糖核苷酸化合物的媒介物，以及藥學上可接受的載體。本發明還涉及一種治療患有脫髮或急性腎衰竭或其他疾病患者的方法，包括向患者給藥治療有效劑量的所述藥物組合物從而治療患者。脫髮可由化療或放療引起，並且所述患者可能患有癌症，尤其是乳腺癌。
文檔編號A61P13/12GK102643818SQ20121009774
公開日2012年8月22日 申請日期2005年9月27日 優先權日2004年9月28日
發明者丹尼爾·祖爾, 埃琳娜·費因斯坦, 莎伊·艾爾利奇 申請人:夸克醫藥公司