嗜熱內切木聚糖酶基因工程菌的構建及其酶的應用的製作方法

2023-07-09 00:27:26 2

專利名稱：嗜熱內切木聚糖酶基因工程菌的構建及其酶的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術，具體涉及一種嗜熱內切木聚糖酶基因工程菌的構建、利用該工程菌製備的嗜熱內切木聚糖酶及該酶在工業中的應用。
背景技術：
木聚糖是植物細胞壁半纖維素的重要組成部分，它是僅次於纖維素、自然界中含量第二豐富的多聚糖，幾乎佔地球可再生碳源的三分之一(Collins et. al. FEMSMicrobiology Reviews. 2005，29 :3_2；3)。木聚糖來源廣泛，可由林業、農業、木材加工以及造紙等工業的副產品獲得，其主鏈主要是由木聚糖殘基以β_1，4-糖苷鍵構成。而根據來源的不同，木聚糖的側鏈可以被阿拉伯糖、葡聚糖醛酸、乙醯基等殘基取代，由於成份複雜，木聚糖需要在包括木聚糖酶、D-木糖苷酶、葡萄糖醛酸酶以及α-L-阿拉伯呋喃糖酶等的共同作用下才能夠被徹底降解。β-1,4-內切木聚糖酶(Endo-^-l,4-xylanase, EC 3.2. 1.8)主要從主鏈內部作用於木糖苷鍵，能夠專一降解木聚糖為低聚木糖和木糖，是木聚糖降解過程中最重要的酶之一 (Kulkami N, Shendye A, Rao M. Molecular and biotechnological aspects of xylanases[J], FEMS Microbiol. Rev. 1999,23(4) :411-456) 能夠產生木聚糖酶的微生物有很多，包括絲狀真菌、細菌、放線菌等。微生物中木聚糖酶由於來源菌株不同而導致其理化性質和分子量不盡相同，其分子量從7. 7到150kDa都有分布，絕大多數在20_40kDa 之間，最適PH值在2-11都有分布。根據木聚糖酶催化區域的結構和性質分析，可將其分為不同的家族，其中糖苷水解酶以第10家族和第11家族居多(Kulkami N, Shendye A， Rao M. Molecular and biotechnological aspects of xylanases[J]. FEMS Microbiol. Rev. 1999,23(4) :441-456)。在過去20年中，有大量的木聚糖酶被分離純化出來，它們的基因已經被克隆，並在大腸桿菌、釀酒酵母、畢赤酵母等系統中進行了表達。當前，木聚糖酶在造紙、食品、飼料、紡織和能源等工業領域都有著廣泛的應用前景，但能夠應用於工業生產的天然木聚糖酶卻很少，工業用酶要求有較高的酶活性，良好的PH穩定性及熱穩定性。如在食品加工過程中，高溫易造成酶失活，因此耐高溫的酶有更好的應用前景(Beg QK, Kapoor Μ,Mahajan L,et al. Microbial xylanases and their industrial applications a review [J], Appl Microbiol. Biotechnol. 2001,56(3-4) :326-338) 到目前為止，國內有關木聚糖酶產生菌的報導較多，其中以真菌(如黑麴黴)的研究居多，而細菌類研究偏少。但較真菌所產木聚糖酶而言，細菌木聚糖酶有更好的熱穩定性，具有更廣泛的工業應用前景，並受到學術界的普遍關注(Badal C. Hemicellulose bioconversion[J]. J Ind Microbiol Biotechnol,2003, 30 :279-291)。木聚糖酶產生菌株熱解纖維素菌(Caldicellulosiruptor bescii DSM 6725)在 70_75°C的高溫下可以正常生長，所以我們推斷它所產生的木聚糖酶具有良好的熱穩定性， 非常適合工業化生產以及食品應用，通過序列比對發現，它與其它已研究的木聚糖酶基因序列具有較低的同源性，我們希望通過此研究來發掘性質優良的新型木聚糖酶源。

發明內容
本發明的目的之一是提供一種能高效應用的高比活嗜熱內切木聚糖酶；本發明的目的之二是提供編碼上述高比活嗜熱內切木聚糖酶的基因；本發明的目的之三是提供包含上述嗜熱內切木聚糖酶的基因的重組載體；本發明的目的之四是提供包含上述嗜熱內切木聚糖酶的基因的重組菌株；本發明的目的之五是提供一種嗜熱內切木聚糖酶的基因工程菌的構建方法。本發明的目的之六是提供上述高比活嗜熱內切木聚糖酶的應用。本發明的嗜熱內切木聚糖酶的基因工程菌已於2011年10月31日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱CGMCCJia 中國北京市朝陽區北辰西路 1號院3號，中國科學院微生物研究所。保藏編號為CGMCC No. 5420。其分類命名為大腸埃希氏菌，拉丁名!Escherichia coli。為了實現上述目的，本發明採用了以下技術方案一種嗜熱內切木聚糖酶基因工程菌的構建，所述的嗜熱內切木聚糖酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，包括以下步驟A、熱解纖維素菌(Caldicellulosiruptor bescii DSM 6725)的培養按照 DSMZ 的配方配置厭氧培養基，按照100體積份的厭氧培養基注入1體積熱解纖維素菌的比例，將熱解纖維素菌接種到厭氧培養基中進行培養；B、基因組DNA的提取將步驟A培養的熱解纖維素菌用細菌基因組DNA提取試劑盒提取熱解纖維素菌的基因組，得到基因組DNA溶液；C、引物設計及用PCR法釣取嗜熱內切木聚糖酶目的基因引物設計如下上遊引物5』CCAGTCCCATGGAGAGCGAAGATTATTATGAAAA 3，，劃線部分為 Nco I 的酶切位點；下遊引物5，CGACGACTCGAGAAAGTCAATTATTCTGAAAAATGCC3，，劃線部分為 Xho I 的酶切位點；以步驟B所得基因組DNA溶液為模板，在上述上遊引物和下遊引物的參與下進行 PCR反應，得到PCR擴增產物，再對擴增產物進行純化，得到純化的PCR產物，然後用限制性內切酶Nco I和B10 I進行雙酶切，得到嗜熱內切木聚糖酶目的基因；D、構建重組表達載體以pET28a為載體，對載體用限制性內切酶Nco I和)(h0 I進行雙酶切，然後用連接試劑盒與步驟C所得嗜熱內切木聚糖酶目的基因進行連接，得到重組表達載體；E、將重組表達載體轉化到宿主細胞中將步驟D所得重組表達載體轉化到大腸桿菌B L 21感受態細胞中進行培養，得到嗜熱內切木聚糖酶基因工程菌。所述的PCR反應的反應體系按以下方法配製DNA聚合酶(Primer star) 1 μ 1，DNA 聚合酶緩衝液(Primer star buffer) 20 μ 1，作為模板的基因組DNA溶液2 μ 1，2. 5mM脫氧核苷酸混合物((1^ )8111，上下遊引物各加40 11101，加超純水至總體積10(^1 ；所述的PCR反應的反應程序為94°C預變性:3min ；然後98°C變性15s，56°C退火10s，72°C延伸90s，最後再72°C延伸20min，共32個循環。步驟C所述的用限制性內切酶Nco I和Bio I進行雙酶切的酶切體系包括40 μ 1 純化的PCR產物，上遊引物和下遊引物各2μ 1，限制性內切酶緩衝液(FD buffer) 4. 9 μ L·所述的脫氧核苷酸混合物是脫氧腺嘌呤苷酸、脫氧鳥嘌呤苷酸、脫氧胞嘧啶核苷酸和脫氧胸腺嘧啶核苷酸的混合物，每種核苷酸的濃度均為25nmol/L。步驟D所述的用限制性內切酶Nco I和Bio I進行雙酶切的酶切體系包括pET28a 空載體45 μ 1，上遊引物和下遊引物各2 μ 1，限制性內切酶緩衝液(FDbuffer) 6 μ 1，加超純水5μ 1至總體積60 μ 1。用上述嗜熱內切木聚糖酶基因工程菌製備的嗜熱內切木聚糖酶，所述的嗜熱內切木聚糖酶的胺基酸序列如SEQ ID No. 2所示，該嗜熱內切木聚糖酶具有以下特性(1)最適反應溫度在45-85°C表現催化活力，最適反應溫度為70°C ；(2)最適反應pH在pH 4. 2-12. O範圍內表現催化活力，最適pH為7.2;(3)底物特異性能夠有效地催化樺木木聚糖(Birctiwood)，山毛櫸木聚糖(Beechhood)，燕麥木聚糖(Oat Spelts)，高粘度羥甲基纖維素(高粘度CMC)，低粘度羥甲基纖維素(低粘度CMC) 的水解，其中水解的最適底物為山毛櫸木聚糖；(4)熱穩定性將嗜熱內切木聚糖酶在不同溫度孵育，表現出很好的熱穩定性，其中60°C下保溫 240min仍然保持65%的活力，65°C下保溫150min仍然保持45%的活力；(5)對一價金屬離子有很好的抗性。上述嗜熱內切木聚糖酶的製備方法是，將構建在大腸桿菌宿主中的含嗜熱內切木聚糖酶的工程菌進行放大培養，然後通過細胞超聲破碎、熱失活大腸桿菌自主表達的雜蛋白、分離純化得到嗜熱內切木聚糖酶。所述的嗜熱內切木聚糖酶用於造紙、食品、飼料、紡織、釀酒和醫藥的生產領域中。熱解纖維素菌(Caldicellulosiruptor bescii DSM 6725)是一株極度嗜熱的細菌，可以降解纖維素，半纖維素，其最適生長溫度為75°C。菌種購買於德國微生物菌種保藏中心 DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen),通過 NCBI 對熱解纖維素菌(Caldicellulosiruptor bescii DSM 6725)的全基因組進行預測，發現其全基因組的233136-234149區域的1014bp的核苷酸可以編碼一種嗜熱內切木聚糖酶，可以將其DNA分子中表達嗜熱內切木聚糖酶活性的基因序列稱為嗜熱內切木聚糖酶基因Cb XynlOB0 由於嗜熱的熱解纖維素菌(Caldicellulosiruptor bescii DSM 6725)是一株厭氧細菌，培養條件複雜，人工培養比較困難，因此直接用培養厭氧菌來生產嗜熱內切木聚糖酶成本比較高且周期比較長。將嗜熱內切木聚糖酶基因轉入易培養、可快速繁殖的常溫宿主如大腸桿菌內，能夠有效地解決上述問題。對厭氧的熱解纖維素菌(Caldicellulosiruptor bescii DSM 6725)通過培養、目的基因的提取，得到本發明所述嗜熱內切木聚糖酶基因，我們委託上海華大基因有限公司進行基因測序，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No. 1所示。將嗜熱內切木聚糖酶基因裝載在pET系統載體上，然後轉入到大腸桿菌宿主中， 得到一株含目的基因的大腸桿菌工程菌。表達的產物是細胞可溶性蛋白，通過細胞超聲破碎、熱失活大腸桿菌雜蛋白和親和層析，即可進行分離純化得到嗜熱蛋白。工程菌表達的嗜熱蛋白為嗜熱內切木聚糖酶，其胺基酸序列如序列表SEQ ID No. 2所示。該嗜熱內切木聚糖酶的最適催化溫度為70°C，最適pH為7. 2，可以催化木聚糖水解，有廣泛的應用前景。如在造紙領域，在化學漂白之前用木聚糖酶對紙漿進行預處理， 可增加纖維的分離度，使氯氣等化學漂白劑更好地滲透到紙漿裡，從而大大減少化學漂白劑的用量，同時可以降低成紙的透氣度，提高緊度；在食品領域，可用於從棉殼、甘蔗渣、玉米芯等天然食物半纖維中製備低聚木糖；在飼料領域，可作為添加劑增進飼料營養成分的消化、吸收；在紡織領域，可用於薴麻脫膠等過程改善了勞動條件，減少環境汙染，減輕對纖維的損傷；在釀酒領域，木聚糖酶有助於提高發酵效率，增加酒精的產率；另外，木聚糖酶在去汙洗滌、醫藥等行業中也有應用。本發明的嗜熱內切木聚糖酶基因與表達載體重組，形成重組表達載體，但是不限於特定的表達載體，優選的表達載體為原核表達載體，進一步優先選擇的為pEDSa，將重組表達載體按常規方法導入適宜的宿主細胞，包括原核細胞和真核細胞。本發明不限於任何特定的宿主細胞，只要它能夠表達所述重組表達載體，本發明使用大腸桿菌(E. coli BL21codon plus (DE3)-RIL)菌株。以上技術方案中所有基本分子生物學操作均參照「分子克隆實驗指南」(第三版， 科學出版社，2002年)。


圖1是純化得到的嗜熱內切木聚糖酶Cb XynlOB的電泳圖；圖2是嗜熱內切木聚糖酶Cb XynlOB的pH_活力曲線；圖3是嗜熱內切木聚糖酶Cb XynlOB的溫度-活力曲線；圖4是嗜熱內切木聚糖酶Cb XynlOB的熱穩定性-活力曲線；圖5是嗜熱內切木聚糖酶Cb XynlOB的底物特異性。
具體實施例方式實施例1 嗜熱內切木聚糖酶工程菌的構建及其酶的表達1、熱解纖維素菌(Caldicellulosiruptor bescii DSM 6725)的培養及其基因組 DNA的提取。按照DSMZ的配方，配置厭氧培養基(anaerocellum medium)，分裝於厭氧試管中， 每管5ml，培養基封閉後用真空泵將試管中的空氣抽乾，並充入一定量的氮氣和二氧化碳的混合氣體(80% N2和20% CO2)，在厭氧箱中用培養基Iml溶解購買於DSMZ的熱解纖維素菌(Caldicellulosiruptor bescii DSM 6725)，按照1 %的接菌量接種於5ml試管中，混勻，75°C靜置培養數天，直至細菌開始生長起來。然後轉移至裝有IOOml培養基的錐形瓶中 75°C培養數天，_80°C保存菌體備用。取5ml 小試管培養的熱解纖維素菌(Caldicellulosiruptor bescii DSM 6725)，用北京普博欣生物技術有限責任公司的細菌基因組DNA小量提取試劑盒(Bacteria Genomic Mini Preparation Kit)提取細菌的基因組，所得染色體DNA溶液放4°C冰箱備用。2、引物設計及用PCR法提取嗜熱內切木聚糖酶目的基因及重組載體的製備嗜熱細菌熱解纖維素菌(Caldicellulosiruptor bescii DSM 6725)基因組中含有幾段預測的可能的嗜熱內切木聚糖酶基因。選擇核苷酸序列如表SEQ ID No. 1所示的基因作為研究對象，命名為XynlOB。該酶基因通過PCR方法從步驟1所得的基因組DNA中擴增而得到。兩個引物是根據基因的序列及載體的限制性內切酶位點而設計的，委託上海生工生物工程公司合成。上遊引物5，CCAGTCCCATGGAGAGCGAAGATTATTATGAAAA 3，，劃線部分為 Nco I 的酶切位點；下遊引物5』CGACGACTCGAGAAAGTCAATTATTCTGAAAAATGCC 3，，劃線部分為》ιο I的酶切位點；兩個引物所設置的酶切位點與表達載體pET28a的Nco I和Bio I 相匹配，適合於在大腸桿菌中高效表達。PCR反應在 ΙΟΟμ 1反應體系中含有1μ 1 Primer star DNA聚合酶，Primer star buffer20 μ 1，模板DNA (基因組DNA) 2 μ 1,2. 5mM dNTP混合物(每種核苷酸濃度25nmol/ L)8y 1，上下遊引物各加40pmol，，加ddH20至總體積ΙΟΟμ L· PCR反應程序為94°C預變性3min ；循環程序為98°C變性15s，56°C退火10s，72°C延伸90s ；最後再72°C延伸20min, 共32個循環。用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，分子量大小為1014bp，與預測的結果一致。使用上海捷瑞生物工程有限公司的PCR產物純化試劑盒對擴增產物進行純化。將純化的PCR產物用限制性內切酶Nco I和Bio I進行雙酶切，酶切體系包括 40 μ 1的目的基因PCR回收產物，Nco I和Xho I各2 μ 1，FD_buffer4. 9 μ 1，37 °C下保溫2 小時。酶切完畢後用0.8%的瓊脂糖凝膠進行電泳，再用DNA凝膠檢測試劑盒回收酶切後的 DNA片段。用同樣的限制性內切酶Nco I和Bio I來酶切pET28a載體，反應體系為60μ 1，體系包括:pET28a 空載體 45 μ 1，Nco I 和 Xho I 各 2 μ 1，FD-buffer 6 μ 1，加 ddH20 5 μ 1 至總體積60 μ 1。37°C下保溫2小時，然後再用磷酸酶O^astAP)處理去磷酸化，反應二十分鐘左右，用0. 8%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，再用膠回收試劑盒回收。在16°C用連接試劑盒來連接木聚糖酶基因和載體。將連接載體轉入大腸桿菌 DH5a中，用含卡那黴素的瓊脂平板進行單克隆菌株的篩選和鑑定。挑取一個陽性的單克隆，加入到含卡那黴素的試管中，37°C ISOrpm/min培養過夜，取菌液進行PCR驗證，得到一條大小為1240bp的條帶即為目的基因，證明目的基因已經與載體連接並轉化到宿主中。測序正確後，提取重組質粒轉化到大腸桿菌(E. coli BL21codon plus (DE3)-RIL)中進行表達 pET^a-cbxynlOB-his。測序工作由上海華大基因完成。3、重組載體在宿主細菌中的表達將重組的DNA 質粒、pEI^8a-cbxynlOB_his 轉化到大腸桿菌(E. coli BL21codon plus(DE3)-RIL)感受態細胞中。大腸桿菌感受態細胞製備及其載體轉化方法參照《分子克隆實驗指南》。挑取陽性轉化菌，置5ml含卡那黴素的培養液中37°C振蕩培養過夜，次日接種到IOOml新鮮的含卡那黴素的2YT培養基中，37°C繼續培養4h。將初步放大的種子液以
的比例接入IL的2YT培養基中培養(37°C，120rpm/min)，其中加入了 100mg/ml的卡那黴素，當0D600達到0. 8左右時加入200mg/ml的異丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，降低培養溫度至22°C，誘導菌體表達目的蛋白。誘導表達過夜後4°C，得到本發明所述工程菌，lOOOOrpm，IOmin離心搜集菌體。然後用50mM，pH8. 0的Tris-HCl緩衝液重懸菌體，超聲破碎(lsXls，30min)後的溶液在70°C下熱失活30min，然後4°C，13000rpm離心30min, 取上清即為粗酶液。利用重組嗜熱酶N-末端含有His-Tag，通過60 °C熱失活、鎳親和層析 (Ni-Chelating Column)對重組蛋白質進行分離，用150mM咪唑洗脫與層析柱結合得到目的酶，然後在PH7. 2、溫度56°C條件下，以山毛櫸木聚糖為底物測定不同處理後的酶活力以及相應的蛋白濃度，得到不同處理後的蛋白純化表，如表1所示。表1嗜熱內切木聚糖酶Cb XynlOB的蛋白純化表
權利要求
1.一種嗜熱內切木聚糖酶基因工程菌，含有嗜熱內切木聚糖酶基因核苷酸序列SEQ ID NO :1。
2.如權利要求1所述的嗜熱內切木聚糖酶基因工程菌，其特徵在於所述嗜熱內切木聚糖酶基因來源於熱解纖維素菌(Caldicellulosiruptor bescii DSM 6725)。
3.如權利要求1所述的一種嗜熱內切木聚糖酶基因工程菌，其特徵在於對所述的嗜熱內切木聚糖酶基因的核苷酸序列SEQ ID NO :1之上進行突變、改造或修飾。
4.如權利要求1所述的一種嗜熱內切木聚糖酶基因工程菌的構建方法，其特徵在於， 包括以下步驟A、熱解纖維素菌(Caldicellulosiruptorbescii DSM 6725)的培養按照DSMZ的配方配置厭氧培養基，按照100體積份的厭氧培養基注入1體積熱解纖維素菌(Caldicellulosiruptor bescii DSM 6725)的比例，將熱解纖維素菌 (Caldicellulosiruptor bescii DSM 6725)接種到厭氧培養基中進行培養；B、基因組DNA的提取將步驟A培養的熱解纖維素菌(Caldicellulosiruptor bescii DSM 6725)用細菌基因組DNA提取試劑盒提取熱解纖維素菌(Caldicellulosiruptor bescii DSM 6725)的基因組，得到基因組DNA溶液；C、引物設計及用PCR法釣取嗜熱內切木聚糖酶目的基因引物設計如下上遊引物5 CCAGTCCCATGGAGAGCGAAGATTATTATGAAAA 3，，劃線部分為 Nco I 的酶切位佔.下遊引物5，CGACGACTCGAGAAAGTCAATTATTCTGAAAAATGCC 3，，劃線部分為 Xho I 的酶切位點；以步驟B所得基因組DNA溶液為模板，在上述上遊引物和下遊引物的參與下進行PCR 反應，得到PCR擴增產物，再對擴增產物進行純化，得到純化的PCR產物，然後用限制性內切酶Nco I和B10 I進行雙酶切，得到嗜熱內切木聚糖酶目的基因；D、構建重組表達載體以pET28a為載體，對載體用限制性內切酶Nco I和)(h0 I進行雙酶切，然後用連接試劑盒與步驟C所得嗜熱內切木聚糖酶目的基因進行連接，得到重組表達載體；E、將重組表達載體轉化到宿主細胞中將步驟D所得重組表達載體轉化到大腸桿菌B L 21感受態細胞中進行培養，得到嗜熱內切木聚糖酶基因工程菌。
5.如權利要求1所述的嗜熱內切木聚糖酶基因工程菌的構建，其特徵在於所述的 PCR反應的反應體系按以下方法配製DNA聚合酶(Primer star) 1μ 1, DNA聚合酶緩衝液 (Primer star buffer) 20 μ 1，作為模板的基因組DNA溶液2 μ 1，2. 5mM脫氧核苷酸混合物 (dNTP)8 μ 1，上下遊引物各加40pmol，加超純水至總體積100 μ 1 ；所述的PCR反應的反應程序為94°C預變性:3min ；然後98°C變性15s，60°C退火10s，72°C延伸90s，再72°C延伸 20min，共30個循環；所述的PCR反應的反應程序為94°C預變性^iin ；然後98°C變性15s， 56°C退火10s，72°C延伸90s，最後再72°C延伸20min，共32個循環。
6.如權利要求1所述的嗜熱內切木聚糖酶基因工程菌的構建，其特徵在於步驟C所述的用限制性內切酶Nco I和Bio I進行雙酶切的酶切體系包括40μ 1純化的PCR產物， 上遊引物和下遊引物各2 μ 1，限制性內切酶緩衝液(FD buffer) 4. 9 μ L·
7.如權利要求2所述的嗜熱內切木聚糖酶基因工程菌的構建，其特徵在於所述的脫氧核苷酸混合物是脫氧腺嘌呤苷酸、脫氧鳥嘌呤苷酸、脫氧胞嘧啶核苷酸和脫氧胸腺嘧啶核苷酸的混合物，每種核苷酸的濃度均為25nmol/L。
8.如權利要求1所述的嗜熱內切木聚糖酶基因工程菌的構建，其特徵在於步驟D所述的用限制性內切酶Nco I和Bio I進行雙酶切的酶切體系包括pET28a空載體45μ 1，上遊引物和下遊引物各2 μ 1，限制性內切酶緩衝液(FDbUffer)6y 1，加超純水5μ 1至總體積 60 μ 1。
9.一種用權利要求1所述的嗜熱內切木聚糖酶基因工程菌製備的嗜熱內切木聚糖酶， 其特徵在於所述的嗜熱內切木聚糖酶的胺基酸序列如SEQ ID No. 2所示，該嗜熱內切木聚糖酶具有以下特性(1)最適反應溫度在45-85°C表現催化活力，最適反應溫度為70°C ；(2)最適反應pH在pH 4. 2-12. O範圍內表現催化活力，最適pH為7.2 ；(3)底物特異性能夠有效地催化BirctiwoocK樺木木聚糖)，Beechhood(山毛櫸木聚糖)，Oat Spelts (燕麥木聚糖)，高粘度CMC (高粘度羥甲基纖維素)，低粘度CMC (低粘度羥甲基纖維素)的水解，其中水解的最適底物為Beechhood(山毛櫸木聚糖)；(4)熱穩定性將嗜熱內切木聚糖酶在不同溫度孵育，表現出很好的熱穩定性，其中60°C下保溫 240min仍然保持65%的活力，65°C下保溫150min仍然保持45%的活力；(5)對一價金屬離子有很好的抗性。
10.一種如權利要求6所述的嗜熱內切木聚糖酶的製備方法，其特徵在於將構建在大腸桿菌宿主中的含嗜熱內切木聚糖酶的工程菌進行放大培養，然後通過細胞超聲破碎、熱失活大腸桿菌自主表達的雜蛋白、分離純化得到嗜熱內切木聚糖酶。
11.一種如權利要求6所述的嗜熱內切木聚糖酶的應用，其特徵在於所述的嗜熱內切木聚糖酶用於造紙、食品、飼料、紡織、釀酒和醫藥的生產領域中。
全文摘要
本發明提供了一種嗜熱內切木聚糖酶基因工程菌的構建及其酶的應用。嗜熱內切木聚糖酶基因來源於熱解纖維素菌(Caldicellulosiruptor bescii DSM 6725)；本發明採用生物工程技術，通過細菌的培養、目的基因釣取、構建表達載體、及將載體轉化到宿主細胞中等步驟構建成嗜熱內切木聚糖酶基因工程菌，再經細胞培養、收集沉澱、超聲破碎、熱處理、親和層析等步驟純化獲得嗜熱內切木聚糖酶。本發明的嗜熱內切木聚糖酶具有很好的熱穩定性，及對金屬離子、有機溶劑及表面活性劑的抗性，可用於造紙、食品、飼料、紡織、釀酒和醫藥的生產中。
文檔編號C12R1/19GK102559567SQ201110406838
公開日2012年7月11日 申請日期2011年12月8日 優先權日2011年12月8日
發明者馮雁, 安嬌, 楊廣宇, 田東升, 白挨璽, 謝淵 申請人:上海交通大學