治療方法

2023-07-08 17:40:41 1

專利名稱：治療方法
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本發明一般涉及分子生物學和生長因子調節領域。更具體地，本發明涉及治療病理的病症如癌症的組合療法。背景癌症是對人類健康而言最致命的威脅之一。僅在美國，癌症的每年新發患者為近 1300000，並且是僅次於心血管病的第二號致死原因，在所有死亡中約佔1/4。實體瘤導致那些死亡的大部分。儘管在某些癌症的醫學治療中有明顯的進展，所有癌症的總體5年生存率在過去的20年中僅僅提高了約10%。癌症，或惡性腫瘤，以不受控制的方式轉移並快速生長，導致及時檢出和治療非常困難。HGF是間質衍生的多效性因子，對許多不同細胞類型具有促有絲分裂、促運動和促形態發生活性。HGF作用是通過特定的酪氨酸激酶c-met介導的，而且在多種腫瘤中經常觀察到異常的HGF和c-met表達。參見例如Maulik等，Cytokine & Growth Factor Reviews (細胞因子和生長因子綜述)(2002)，13 :41-59 ；DaniIkovitch-Miagkova 和 Zbar， J. Clin. Invest.(臨床研究雜誌)(2002),109(7) :863_867。在腫瘤進展和轉移中牽涉HGF/ c-Met信號傳導途徑的調控。參見例如Trusgolino和Comoglio，Nature Rev.(自然綜述) (2002) ,2 :289-300)。HGF結合Met受體酪氨酸激酶(RTK)的胞外域並調控多種多樣的生物學過程，諸如細胞分散、增殖和存活。HGF-Met信號傳導對於正常胚胎發育而言是至關重要的，尤其是在肌肉祖細胞遷移及肝和神經系統發育中(Bladt等，Nature (自然)(1995)，376，768-771.； Hamanoue 等，Faseb J (2000), 14,399-406 ；Maina 等，Cell(細胞)(1996)，87，531-542 ； Schmidt 等，Nature (自然)(1995)，373，699-702 ；Uehara 等，Nature (自然)(1995)，373， 702-705)。敲除Met和HGF的小鼠的發育表型非常相似，這說明HGF是Met受體的關聯配體(Schmidt等，1995，同上Uehara等，1995，同上)。HGF-Met還在肝再生、血管發生和傷口癒合中發揮作用(Bussolino 等，J Cell Biol (1992)，119，6四_641 ;Matsumoto 和 Nakamura, Exs (1993)，65，225-249 ；Nusrat 等，J Clin Invest (臨床研究雜誌)(1994)93， 2056-206 。Met受體前體經蛋白酶剪切切割成由二硫鍵連接的胞外α亞基和跨膜β 亞基(Tempest等，Br J Cancer (英國癌症雜誌)(1988)，58，3-7)。β亞基包含胞質激酶結構域，而且在C末端包含多底物停靠位點，在此處銜接物(adapter)蛋白結合併起動信號傳導(Bardelli 等，Oncogene (癌基因)(1997)，15，3103-3111 ；Nguyen 等，J Biol Chem(生物化學雜誌)(1997)，272，20811-20819 ；Pelicci 等，Oncogene (癌基因)(1995)， 10,1631-1638 ；Ponzetto 等，Cell (細胞)(1994)，77，261-271 ；Weidner 等，Nature (自然)(1996)，384，173-176)。HGF結合後，Met激活，分別經由Gabl和Grb2/Sos介導的PI3激酶和Ras/MAPK激活而導致了酪氨酸磷酸化和下遊信號傳導，它驅動細胞運動和增殖(Furge 等，Oncogene (癌基因 M2000)，19,5582-5589 ;Hartmann 等，J Biol Chem(生物化學雜誌)(1994)，269，21936-21939 ;Ponzetto 等，J Biol Chem(生物化學雜誌)(1996)，271， 14119-14123 ；Royal 和 Park，J Biol Chem (生物化學雜誌)(1995)，270，27780-27787)。據顯示，Met可在經致癌原處理的骨肉瘤細胞系中轉化(Cooper等，Nature (自然) (1984)，311,29-33 ；Park 等，Cell (細胞)(1986)，45，895-904)。已在多種人癌症中觀察到了 Met的過表達或基因擴增。例如，Met蛋白在結腸直腸癌中過表達至少5倍，且據報導在肝轉移中有基因擴增(Di Renzo等，Clin Cancer Res (臨床癌症研究)(1995)，1，147-154 ； Liu等，Oncogene (癌基因)(1992)，7，181-185)。據報導，Met蛋白還在口腔鱗狀細胞癌、 肝細胞癌、腎細胞癌、乳腺癌和肺癌中過表達(Jin等，Cancer (癌症)(1997)，79，749-760 ； Morello 等，J Cell Physiol (細胞生理學雜誌 M2001)，189，285-290 ;Natali 等，Int J CanceH 國際癌症雜誌)(1996)，69，212-217 ;01ivero 等，Br J Cancer (英國癌症雜誌) (1996)，74，1862-1868 ；Suzuki 等，Br J Cancer (英國癌症雜誌)(1996)，74，1862-1868)。 此外，在肝細胞癌、胃癌和結腸直腸癌中觀察到mRNA的過表(Boix等，!fepat0l0gy(肝臟病學)(1994)，19，88-91 ；Kuniyasu 等，Int J Cancer (國際癌症雜誌)(1993)，55，72-75 ；Liu 等，Oncogene (癌基因)(1"2)，7,181-185)。在腎乳頭狀癌中發現了 Met激酶結構域中的許多突變，它們導致組成性受體激活(Olivero 等，Int J Cancer (國際癌症雜誌)(1999)，82，640-643 ；Schmidt 等， Nat Genet (自然遺傳)(1997)，16，68-73 ；Schmidt 等，Oncogene (癌基因)(1999)，18， 2343-2350)。這些激活突變造成組成性Met酪氨酸磷酸化，並導致MAPK激活、病灶形成和腫瘤發生(Jeffers等，Natl Acad Sci U S A(美國科學院院刊)(1997)，94， 11445-11450)。此外，這些突變增強細胞運動和侵入(Giordano等，Faseb J(2000), 14, 399-406 ；Lorenzato 等，Cancer Res (癌症研究)Q002)，62，7025-7030)。轉化細胞中的 HGF 依賴性Met激活介導運動、分散和遷移的增加，最終導致侵入性腫瘤生長和轉移(Jeffers 等，Mol Cell Biol (分子細胞生物學)(1996)，16，1115-1125 ；Meiners 等，Oncogene (癌基因)(1998)，16,9-20)。Met已顯示出與驅動受體激活、轉化和侵入的其它蛋白質相互作用。在腫瘤細胞中，據報導，Met與α6β4整聯蛋白(諸如層粘連蛋白的胞外基質(ECM)組分的受體)相互作用，以促進HGF依賴性的侵入生長(Trusolino等，Cell (細胞)(2001)，107，643-654)。 此外，Met胞外域已顯示出與腦信號蛋白(semaphorin)家族的成員叢蛋白Bl相互作用，以增強侵入生長(Giordano等，Nat Cell Biol (自然細胞生物學)(2002)，4，720-724)。而且，已知牽涉腫瘤發生和轉移的⑶44v6據報導也與Met和HGF形成複合物並導致Met受體激活(Orian-Rousseau 等，Genes Dev (基因和發育)Q002)，16，3074-3086)。Met是受體酪氨酸激酶(RTK)亞家族的成員，該家族包括Ron和ka(Maulik等， Cytokine Growth Factor Rev (細胞因子生長因子綜述)(2002)，13，41-59)。Met 胞外域的結構預測表明它與腦信號蛋白和叢蛋白同源。Met的N末端包含約500個胺基酸的義脆結構域，其在所有腦信號蛋白和叢蛋白中是保守的。腦信號蛋白和叢蛋白屬於一個分泌的和膜結合的蛋白質大家族，首先因其在神經發育中的作用而被記載(Van Vactor和Lorenz，Curr Bio (現代生物學)(1999)，19，R201-204)。不過，近來將腦信號蛋白的過表達與腫瘤的侵入和轉移聯繫起來了。在叢蛋白、腦信號蛋白和整聯蛋白中發現的富含半胱氨酸PSI 結構域(也稱為Met相關序列結構域)鄰近kma結構域，隨後是4個IPT重複片段，其是在叢蛋白和轉錄因子中發現的免疫球蛋白樣區域。近來的研究表明Met kma結構域足以使HGF和肝素結合(Gherardi等，Proc Natl Acad Sci U S A (美國科學院院刊)(2003)， 100(21) :12039-44)。如上所述，Met受體酪氨酸激酶由其關聯配體HGF激活，而且受體磷酸化激活下遊 MAPK、PI-3 激酶和 PLC-γ 途徑(L. Trusolino 和 P. M. Comoglio，Nat Rev Cancer (自然綜述癌症)2，289Q002) ；C. Birchmeier 等，Nat Rev Mol Cell Biol (自然綜述分子細胞生物學)4,915 000 )。激酶結構域內的Y1234/Y1235磷酸化對於Met激酶激活來說是關鍵的，而多底物停靠位點中的Y1349和Y1356對於結合src同源體-2 (SH2)、磷酸酪氨酸結合(PTB) JPMet結合結構域(MBD)蛋白來說是重要的(C. Ponzetto等，Cell (細胞)77， 261(1994) ；K. M. Weidner 等，Nature (自然)384，173 (1996) ；G. Pelicci 等，Oncogene (癌基因)10，1631 (1995))，用以介導下遊信號傳導途徑的激活。另一個近膜磷酸化位點Y1003 已經很好地表徵了其與Cbl E3連接酶的酪氨酸激酶結合(TKB)結構域的結合(P. Peschard 等，Mol Cell (分子細胞)8，995(2001) ；P. Peschard, N. Ishiyama, T.Lin，S. Lipkowitz, Μ. Park, J Biol Chem (生物化學雜誌)279，四565 (2004))。據報導，Cbl的結合驅動吞蛋白(endophilin)介導的受體內吞、泛素化及隨後的受體降解(A. Petrelli等，Nature (自然)416,187 0002))。該受體下調的機制以前在也具有相似Cbl結合位點的EGFR家族中有記載(K. Shtiegman，Y. Yarden，Semin Cancer Biol (癌症生物學講座)13，四 Q003)； M. D. Marmot, Y. Yarden, Oncogene (癌基因)23，2057 (2004) ；P. Peschard, M. Park, Cancer Cell (癌細胞)3，519 000；3))。多種腫瘤中據報導有Met和HGF失調。在數種癌中觀察到配體驅動的Met激活。在肺、乳腺癌、和多發性骨髓瘤中觀察到升高的血清和腫瘤內HGF(J. M. Siegfried 等，Ann Thorac Surg 66,1915(1998) ；P. C. Ma 等，Anticancer Res (抗癌研究)23,49(2003) ；B. E.Elliott 等 Can J Physiol Pharmacol 80,91(2002) ；C. Seidel, 等，Med Oncol 15,145(1998))。在多種癌中，諸如在結腸直腸、肺、胃、和腎癌中，據報導有Met和/或HGF的過表達、Met擴增或突變，而且認為這驅動配體依賴性受體激活 (C. Birchmeier 等，Nat Rev Mol Cell Biol (自然綜述分子細胞生物學)4，915 (2003)； G. Maulik 等，Cytokine Growth Factor Rev (細胞因子生長因子綜述)13，41 Q002))。另外，肝小鼠模型中誘導性Met過表達引起了肝細胞癌，這證明了受體過表達驅動配體非依賴性腫瘤發生(R. Wang，等，J Cell Biol 153，1023 (2001))。Met參與癌的最引人注目的證據據報導是在家族性和散發性腎乳頭狀癌(RPC)患者中，Met激酶結構域中造成受體組成性激活的突變在RPC中被鑑定為種系和體細胞突變(LJchmidt等，Nat Genet (自然遺傳)16,68(1997))。將這些突變導入轉基因小鼠模型造成腫瘤發生和轉移(M. Jeffers等， Proc Natl Acad Sci U S A (美國科學院院刊)94，11445 (1997))。表皮生長因子受體(EGFR)家族包括參與細胞應答如分化和增殖的四種密切相關的受體(HER1/EGFR，HER2，HER3和HER4)。過表達EGFR激酶或其配體TGF-α常常與許多癌症相關，包括乳腺癌、肺癌、結腸直腸癌、卵巢癌、腎細胞癌、膀胱癌、頭和頸癌、成膠質細胞瘤和星形細胞瘤，並且認為促進這些腫瘤的惡性生長。也已經發現EGFR基因(EGFRvIII)中的特異性缺失突變增加細胞致腫瘤性。激活EGFR刺激的信號傳導途徑促進多個可能促癌的過程，例如增殖、血管發生、細胞運動性和侵襲、降低細胞凋亡和誘導藥物抗性。增加的 HER1/EGFR表達經常與重病、轉移和差的預後相關聯。例如，在NSCLC和胃癌中，已經顯示增加的HER1/EGFR表達與高轉移率、差的腫瘤分化和增加的腫瘤增殖相關。在NSCLC和成膠質細胞瘤中已經觀察到激活受體的內在性蛋白酪氨酸激酶活性和/或增加下遊信號傳導的突變。然而，突變作為賦予對EGF受體抑制劑(例如厄洛替尼 (erlotinib) (TARCEVA )或吉非替尼(gefitinib))的敏感性的主要機制的作用存在爭議。已經報導全長EGF受體的突變形式預測了對EGF受體酪氨酸激酶抑制劑吉非替尼的反應性(Paez，J.G.等(2004) Science (科學)304 1497-1500 ;Lynch，T. J.等(2004) N. Engl. J. Med.(新英格蘭醫學雜誌)350 =2129-2139)。細胞培養研究已經顯示表達EGF受體的此類突變形式的細胞系(即H325Q對EGF受體酪氨酸激酶抑制劑吉非替尼的生長抑制更敏感，需要高得多的濃度的吉非替尼來抑制表達野生型EGF受體的腫瘤細胞系。這些觀察表明特定突變形式的EGF受體可能反應對EGF受體抑制劑的更大的敏感性，但沒有鑑定完全無反應的表型。直接抑制EGFR的激酶活性的化合物以及通過阻斷EGFR激活降低EGFR激酶活性的抗體開發用作抗腫瘤試劑是強烈努力研究的領域(de Bono J. S.和Rowinsky， Ε. K. (2002) Trends in Mol. Medicine (分子醫學發展趨勢)8 :S19_S26 ；Dancey，J.和 Sausville, Ε. Α. (2003)Nature Rev. Drug Discovery (自然綜述.藥物發現)2 :92-313)。 數個研究已經證明、公開或表明一些EGFR激酶抑制劑當與某些其它抗癌或化療試劑或治療組合使用時可能改善對腫瘤細胞或瘤形成的殺傷(例如Herbst，R.S.等Q001) Expert Opin. Biol. Ther.(生物學理論專家觀點)1 :719-732 ；Solomon，B.等(2003) Iht.J.Radiat. Oncol. Biol. Phys. 55 :713-723 ；Krishnan, S.等(2003)Frontiers in Bioscience (生命科學前沿)8，el-13 ；Grunwald, V.和 Hidalgo，Μ. (2003) J. Nat. Cancer Inst. 95 :851-867 ；Seymour L. (2003) Current Opin. Investig. Drugs ( ^fF ^Sfi 點)4(6) :658-666 ；Khali 1,Μ. Y.等(2003)Expert Rev. Anticancer Ther.(抗癌理論專家綜述)3 :367-380 ；Bulgaru,A. Μ.等(2003)Expert Rev. Anticancer Ther.(抗癌理論專家綜述)3 :269-279 ；Dancey, J.禾口 Sausville, Ε. Α. (2003)Nature Rev. Drug Discovery (自然綜述.藥物發現)2 :92-313 ;Ciardiello，F.等(2000) Cl in. Cancer Res.(臨床癌症研究)6 :2053-2063 ；和專利公開 No :US 2003/0157104)。厄洛替尼(例如鹽酸厄洛替尼，也稱為TARCEVA 或0SI-774)是可口服的EGFR 激酶抑制劑。在體外，厄洛替尼已經證明在很多人腫瘤細胞系(包括結腸直腸癌和乳腺癌) 中對EGFR激酶有重要抑制活性(Moyer J. D.等(1997)Cancer Res(癌症研究).57 :4838)， 並且臨床前評價已經證明有抵抗很多表達EGFR的人腫瘤異種移植物的活性(Pollack， V. Α.等(1999) J. Pharmacol. Exp. Ther. 291 :739)。厄洛替尼在很多適應症的臨床試驗中已經證明有活性，包括頭和頸癌(Soulieres，D.，等Q004) J. Clin. Oncol.(臨床腫瘤學)22 77), NSCLC(Perez-Soler R,等(2001)Proc. Am. Soc. Clin. Oncol. 20 :310a,文摘 1235)， CRC (0za,M.，等 Q003)Proc. Am. Soc. Clin. Oncol. 22 :196a，文摘 785)和 MBC (Winer，Ε·，等 (2002) Breast Cancer Res. Treat.(乳腺癌研究治療)76 :5115a，文摘 445 Jones, R. J.， 等 Q003)Proc. Am. Soc. Clin. Oncol. 22 :45a，文摘 180)。在 III 期試驗中，在患有晚期、治療-頑抗的NSCLC患者中，厄洛替尼單一療法顯著延長存活、延遲疾病進展並且延遲肺癌相關症狀的惡化(Sh印herd，F.等(2004) J.Clin· Oncology (臨床腫瘤學)，22 :14S (7 月15日增刊)，文摘7022)。在2004年11月美國食品藥品管理局(U. S. Food and Drug Administration(FDA))批准TARCEVA 用於在至少一次在先化學治療方案失敗後治療患有局部進展的或轉移的非小細胞肺癌(NSCLC)的患者。儘管在癌症治療中有重大進展，仍然在尋求改進的療法。本文引用的所有參考文獻，包括專利申請和公開，其全文通過引用併入本文。發明概述本發明提供用於治療病理的病症如癌症的療法，其中抗c-met抗體提供顯著的抗腫瘤活性。本發明還提供用於治療病理的病症如癌症的組合療法，其中抗c-met抗體與 EGFR拮抗劑組合，由此提供顯著的抗腫瘤活性。一方面，本發明提供治療受試者中癌症的方法，包括向該受試者以每三周大約 15mg/kg的劑量施用抗c-met抗體。另一方面，本發明提供治療受試者中癌症的方法，包括向該受試者施用(a)每三周大約15mg/kg的劑量的抗c-met抗體；和(b) EGFR拮抗劑。一方面，本發明提供用於在患有非小細胞肺癌的受試者中延長疾病進展時間 (time to disease progression, TTP)或存活的方法，該方法包括向該受試者施用(a)每三周大約15mg/kg的劑量的抗c-met抗體；和(b) EGFR拮抗劑。在一些實施方案中，抗-c-met抗體以足以獲得15微克/ml或高於15微克/ml的血清谷濃度(serum trough concentration)的量施用。在一些實施方案中，抗-c-met抗體以總劑量大約15mg/kg在三周的期間中施用。在一個實施方案中，EGFR拮抗劑是厄洛替尼。在某些實施方案中，厄洛替尼在三周的周期中每天以150mg的劑量施用。在某些實施方案中，厄洛替尼在三周的周期中每天以IOOmg的劑量施用。在某些實施方案中，厄洛替尼在三周的周期中每天以50mg的劑量施用。在一個實施方案中，本發明提供用於在患有非小細胞肺癌的受試者中延長疾病進展時間(TTP)、無進展存活、或存活的方法，該方法包括向該受試者施用(a)每三周大約 15mg/kg的劑量的抗-c-met抗體(如MetMAb)；和(b)在三周的周期中每天150mg劑量的厄洛替尼(N-(3-乙炔基苯基)-6，7-二 O-甲氧基乙氧基)-4-喹唑啉胺)。本申請第一次公開了在人中施用包含Fc區的單價單臂抗體，與包含所述抗原結合臂的Fab分子相比，該Fc區增加了所述抗體片段的穩定性。參見，例如W02005/063816。 在一些情況下全長抗體在結合目標抗原時顯示出激動效應(其可能是不想要的)，即使作為Fab片段其是拮抗性抗體。參見，例如美國專利No. 6，468，5四。當拮抗性效應是想要的治療功能時這種現象是不利的。單臂抗體的單價特性(即抗體包含單抗原結合臂)在該抗體結合目標分子時產生和/或保證拮抗功能，適合用於治療需要拮抗功能且抗體的雙價產生不利激動效應的病理的病症。另外，本文描述的包含Fc區的單臂抗體的特徵在於，與具有相似/基本相同抗原結合特性的Fab形式相比具有優異的藥物代謝動力學屬性(如體內增強的半衰期和/或降低的清除率)，因此克服了使用常規單價Fab抗體中的主要缺點。因此，在一些實施方案中，抗-c-met抗體是包含Fc區的單臂抗體(即重鏈可變結
11構域和輕鏈可變結構域形成單抗原結合臂)，其中該Fc區包含第一和第二 Fc多肽，其中第一和第二 Fc多肽存在於複合物中並形成Fc區，與包含所述抗原結合臂的Fab分子相比較而言，該Fc區增加了所述抗體片段的穩定性。在一些實施方案中，該抗-c-met抗體包含(a)第一多肽，其包含具有下述序列的重鏈可變結構域EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYWLHWVRQAPGKGLEWVGMIDPSNSDTRFNPNFKDRFT ISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCATYRSYVTPLDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO 10)，CHl 序列，和第一 Fc多肽；(b)第二多肽，其包含具有下述序列的輕鏈可變結構域DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKSSQSLLYTSSQKNYLAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRESGVPSRFS GSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYAYPWTFGQGTKVEIKR(SEQ ID NO :11)，和 CLl序列；和(c) 第三多肽，其包含第二 Fc多肽，其中重鏈可變結構域和輕鏈可變結構域以複合物存在並形成單抗原結合臂，其中第一和第二 Fc多肽存在於複合物中並形成Fc區，與包含所述抗原結合臂的Fab分子相比較而言，該Fc區增加了所述抗體片段的穩定性。在一些實施方案中， 第一多肽包含

圖1中所描述的Fc序列(SEQ ID NO 12)並且第二多肽包含圖2中所述的Fc 序列(SEQ ID N0:13)。在一些實施方案中，第一多肽包含圖2中所述的Fc序列(SEQ ID NO 13)並且第二多肽包含圖1中所描述的Fc序列(SEQ ID NO 12)。在一些實施方案中，該抗-c-met抗體包含(a)包含重鏈可變結構域的第一多肽， 所述多肽包含序列EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYWLHWVRQAPGKGLEWVGMIDPSNSDTRFNPNFKDRFT ISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCATYRSYVTPLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGC LVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCD KTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPS DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO 14) ； (b)包含輕鏈可變結構域的第二多肽，該多肽包含序列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKSSQSLLYTSSQKNYLAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRESGVPSRFS GSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYAYPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFY PREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SE Q ID NO 15)；和包含Fc序列的第三多肽，該多肽包含序列CPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREE QYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK( SEQ ID NO :13)，其中重鏈可變結構域和輕鏈可變結構域以複合物存在並形成單抗原結合臂，其中第一和第二 Fc多肽存在於複合物中並形成Fc區，與包含所述抗原結合臂的Fab分子相比較而言，該Fc區增加了所述抗體片段的穩定性。在一個實施方案中，該抗-c-met抗體包含重鏈可變結構域，該重鏈可變結構域包含圖1中所描述的CDR1-HC，CDR2-HC和CDR3-HC序列(SEQ ID NO :4，5，和/或9)中的一條或多條。在一些實施方案中，該抗體包含輕鏈可變結構域，該輕鏈可變結構域包含圖1 中所描述的CDR1-LC，CDR2-LC和CDR3-LC序列(SEQID而1，2，和/或3)中的一條或多條。在一些實施方案中，該重鏈可變結構域包含圖1中所描述的FR1-HC，FR2-HC，FR3-HC和 FR4-HC序列(SEQ ID NO 21-24) 0在一些實施方案中，該輕鏈可變結構域包含圖1中所描述的 FR1-LC, FR2-LC, FR3-LC 和 FR4-LC 序列(SEQ ID NO :16-19)。適用於本發明的方法的其它抗-c-met抗體在本文中描述並且是本領域中已知的。一方面，抗-c-met抗體包括至少一個特性，其促進抗體片段內的Fc序列的異二聚化而使同二聚化最小。這樣的一種或多種特性改善了免疫球蛋白群體的產量和/或純度和 /或同質性。在一個實施方案中，該抗體包含Fc突變，其構成「凸起(「knobs")」和「孔洞」(〃 holes")，如W02005/063816中描述。例如孔洞突變可以是Fc多肽中T366A，L368A 和/或料07￥中的一種或多種，並且空腔(cavity)突變可以是T366W。本發明的方法可用於影響任何適當的病理狀態。例如，本發明的方法可用於治療不同癌症，實體瘤和軟組織腫瘤等均可。本發明的治療可改善的癌症的非限制性實例包括乳腺癌(breast cancer)、結腸直腸癌(colorectal cancer)、直腸癌(rectal cancer)、 # 小細 Ifi月市· (non-small cell lung cancer) > # - M ^ ik E ^ (non-Hodgkins Iymphoma(NHL))、腎細胞癌(renal cell cancer)、前列腺癌(prostate cancer)、肝癌 (liver cancer)、姨腺癌(pancreatic cancer)、軟組織肉瘤(soft-tissue sarcoma)、卡波濟肉瘤(kaposi' s sarcoma)、類癌瘤的癌瘤(carcinoid carcinoma)、頭禾口頸癌(head and neck cancer)、黑素瘤(melanoma)、卵巢癌(ovarian cancer)、胃癌(gastric cancer)、間皮瘤(mesothelioma)、和多發性骨髓瘤(multiple myeloma) 0在某些方面，癌症是轉移的。 在其它方面，癌症是非轉移的。在一些實施方案中，該癌症是非小細胞肺癌、腎細胞癌、胰腺癌、胃癌、膀胱癌 (bladder cancer)、食管癌(esophageal cancer)、間皮瘤、黑素瘤、乳腺癌、甲狀腺癌 (thyroid cancer)、結腸直腸癌、頭和頸癌、骨肉瘤(osteosarcoma)、前列腺癌、或成膠質細胞瘤(glioblastoma) ο在一些實施方案中，受試者的癌表達c-met。在一些實施方案中，受試者的癌表達 EGFR0在一些實施方案中，受試者的癌顯示c-met和/或EGFR表達、擴增、或激活。在一些實施方案中，來自於受試者的血清表達高水平的IL8(顯示高水平的IL8表達，如IL8蛋白表達)。在一些實施方案中，來自於受試者的血清表達高於大約150pg/ml的 IL8，或在一些實施方案中，高於大約50pg/ml的IL8。在一些實施方案中，來自於受試者的血清表達高於大約10pg/ml，20pg/ml，30pg/ml或更高的IL8。測量IL8血清濃度的方法是本領域已知的並且一種方法在本實施例中描述。在一些實施方案中，來自於受試者的血清表達高水平的HGF(顯示高水平的HGF 表達，如HGF蛋白表達)。在一些實施方案中，來自於受試者的血清表達高於大約5，000, 10，000，或 50，000pg/ml 的 HGF。抗-c-met抗體可連續施用或與EGFR拮抗劑組合在相同組合物中或作為單獨的組合物施用。抗-c-met抗體和EGFR拮抗劑的施用可同時進行，例如作為單一組合物或作為兩種或多種不同組合物，使用相同或不同的施用途徑。備選地或另外地，可以任何順序連續進行施用。備選地或另外地，該步驟可作為以任何順序的連續和同時的組合實施。在某些實施方案中，兩種或多種組合物的施用之間可存在的間隔範圍在數分鐘至數天-數周至數月。例如，可以首先施用EGFR拮抗劑，隨後是抗-c-met抗體。然而，也涵蓋了同時施用或首先施用抗-c-met抗體。取決於待治療的具體癌症適應症，本發明的組合治療可與另外的治療劑進行組合，如化療劑、VEGF拮抗劑，或與另外的療法如放射性療法或手術進行組合。許多已知的化療劑可在本發明的組合治療中使用。優選地將使用治療具體適應症的標準的那些化療劑。 在組合中將使用的每種治療劑的劑量或頻率優選地與當該相應藥劑不與其它一種或多種藥劑一起使用時的劑量或頻率相同或更低。本發明也提供預後的方法。因此，公開的方法可提供用於方便、有效並可能經濟的方式獲得對評估病症將來的進程(包括對正在治療的患者選擇適當的療法)有用的數據和 fn息ο另一方面，本發明提供評價患有或懷疑患有癌症的患者的方法，該方法包括基於來自於該患者生物學樣品中的IL8的表達與對照樣品中IL8的表達的比較預測該患者癌症的預後；其中患者生物學樣品中相對於對照樣品中的IL8的表達對該患者的癌症是預後性的。在一些實施方案中，該方法還包括(a)從患者獲得生物學樣品(例如在治療前和/或治療過程中)；和(b)檢測在該生物學樣品(一個或多個)中的IL8的表達。在一些實施方案中，患者生物學樣品中相對於對照樣品中IL8表達的增加對該患者的癌症是預後性的。在一些實施方案中，患者生物學樣品中相對於對照樣品中IL8表達的降低對該患者的癌症是預後性的。另一方面，本發明提供用於評價正在進行癌症治療的患者的方法，該方法包括基於來自於該患者的生物學樣品(例如血清)中的IL8的表達與在治療前採集的該患者生物學樣品中IL8的表達的比較預測該患者的癌症預後，其中正在進行治療的患者血清中IL8 的表達相對於治療前樣品中表達而言降低對該患者的癌症是預後性的。在一些實施方案中，癌症的預後包括對下述任何一個或多個提供預言或預測(預後)對治療(例如，用c-met拮抗劑(如抗c-met抗體)或用c-met拮抗劑和EGFR拮抗劑)的反應，c-met拮抗劑(如抗-c-met抗體)或c-met拮抗劑和EGFR拮抗劑的活性，對治療(例如，用c-met拮抗劑或用c-met拮抗劑和EGFR拮抗劑)的反應，治療(例如，用 c-met拮抗劑或用c-met拮抗劑和EGFR拮抗劑)的活性，易患癌症或診斷為癌症的患者的存活時間，無復發存活時間，易患癌症或診斷為癌症的患者的無進展存活時間，易患癌症或診斷為癌症的一組患者的反應率，易患癌症或診斷為癌症的一組患者的反應時間，和/或易患癌症或診斷為癌症的患者中轉移的可能性。在一些實施方案中，存活時間預言或預測為增加。在一些實施方案中，存活時間預言或預測為降低。在一些實施方案中，無復發存活時間預言或預測為增加。在一些實施方案中，無復發存活時間預言或預測為減少。在一些實施方案中，反應率預言或預測為增加。在一些實施方案中，反應率預言或預測為減少。在一些實施方案中，反應時間預言或預測為增加。在一些實施方案中，反應時間預言或預測為降低。在一些實施方案中，轉移可能性預言或預測為增加。在一些實施方案中，轉移可能性預言或預測為降低。另一方面，本發明提供選擇對於患有或懷疑患有癌症的患者的治療的方法，該方法包括(a)基於來自於該患者生物學樣品中的IL8的表達與對照樣品中IL8的表達的比較預測該患者癌症的預後，其中患者生物學樣品中相對於對照樣品中的IL8的表達對該患
14者的癌症是預後性的，和(b)步驟(a)之後，選擇對於該患者的癌症治療，其中該治療的選擇基於在步驟(a)中確定的患者的預後。在一些實施方案中，該方法還包括(C)獲得患者的生物學樣品；(d)檢測在該生物學樣品中的IL8的表達，其中在該患者生物學樣品中IL8 的表達對癌症是預後性的。在一些實施方案中，患者生物學樣品中相對於對照樣品中IL8 表達的增加對該患者的癌症是預後性的。在一些實施方案中，患者生物學樣品中相對於對照樣品中IL8表達的降低對該患者的癌症是預後性的。另一方面，本發明提供選擇對於正在進行癌症治療的患者的治療的方法，該方法包括(a)基於來自於該患者生物學樣品(例如血清)中的IL8的表達與治療前採集的該患者生物學樣品中IL8的表達的比較預測該患者癌症的預後，其中正在進行治療的患者血清中IL8的表達相對於治療前樣品中表達而言對該患者的癌症是預後性的，和(b)步驟(a) 之後，選擇對於該患者的癌症治療，其中該治療的選擇基於在步驟(a)中確定的患者的預後。在一些實施方案中，該方法還包括(c)獲得患者的生物學樣品；(d)檢測在該生物學樣品中的IL8的表達，其中在該患者生物學樣品中IL8的表達對癌症是預後性的。在一些實施方案中，患者生物學樣品中相對於對照樣品中IL8表達的增加對該患者的癌症是預後性的。在一些實施方案中，患者生物學樣品中相對於對照樣品中IL8表達的降低對該患者的癌症是預後性的。附圖簡述圖1 描述了 MetMAb (0A5D5v2)的構架(FR)、CDR、第一恆定結構域(CL或CHl)和 Fc區(Fe)的胺基酸序列。所描述的Fc序列包含「孔洞」(空腔)突變T366S，L368A和 Y407V，如 WO 2005/063816 中所描述。圖2 描述了包含「凸起」("knob")(隆凸)突變T366W的Fc多肽的序列，如WO 2005/063816中所描述。在一個實施方案中，包含這種序列的Fc多肽與包含圖1的Fc序列的Fc多肽形成複合物從而產生Fc區。圖3 在小鼠、大鼠和食蟹猴(cynomolgus monkey)中進行單次IV或IP推注劑量的MetMAb後平均血清MetMAb濃度-時間曲線圖。如圖所示MetMAb在第0天給藥。圖4 在KP4胰腺癌異種移植物模型中在多種劑量水平的單次IV推注劑量的 MetMAb後平均腫瘤體積-時間曲線圖。如圖所示MetMAb在第0天給藥。圖5:平均腫瘤體積-劑量曲線圖。在第21天的組平均腫瘤體積=Σ (第21天腫瘤體積-相同動物在第0天的腫瘤體積)/η。圖6 在ΚΡ4異種移植物模型中不同給藥方案的IV推注劑量的MetMAb之後平均腫瘤體積-時間曲線圖。箭頭表示劑量組的給藥時間如下(從頂排到底排)頂部箭頭 MetMAb 0. 825mg/kg 每周一次(QlW)；中間箭頭MetMAb 1. 25mg/kg 每兩周一次(Q2W)；底部箭頭=MetMAb 2. 5mg/kg每三周一次(Q3W)。在該圖中〃 0A5D5"是指MetMAb。菱形表示 PBS對照。圖7 在KP4異種移植物模型中單次IV推注劑量或IV輸注MetMAb後平均腫瘤體積-時間曲線圖。MetMAb如圖所示進行給藥。圖8 在攜帶H596非小細胞肺癌腫瘤huHGF_SCID轉基因小鼠中在IV推注劑量之後平均腫瘤體積-時間曲線圖。MetMAb如圖所示進行給藥。圖9 說明對於MetMAb的理論人群Η /PD腫瘤進展模型，由直接KP4腫瘤生長
15抑制的兩區室(two-compartment)非線性1 模型構成。CL =總清除率的非飽和清除部分；CLd =區室間清除率；Kmltl =在50 % Vmaxlo的MetMAb血清濃度；Vmaxltl =總清除的飽和清除部分的最大藥物去除；Vl =表觀中心分布體積；V2 =表觀外周分布體積；IC5tl = Michaelis-Menten常數，代表導致50%細胞生長抑制的MetMAb血清濃度；IMax =最大 MetMAb腫瘤生長抑制效應常數；KGN = KP4腫瘤細胞系體內淨生長率；C = MetMAb血清濃度。圖10 來自於15mg/kg Q3麗etMAb模擬實驗的代表性I3K曲線圖和MTC值。PK = 藥物代謝動力學特徵曲線(pharmacokinetic profile) ；MTC =最小腫瘤穩定MetMAb濃度。圖11 對應於圖10中所示1 曲線圖和MTC值的腫瘤質量模擬實驗。AUC =曲線下MetMAb血清面積；MTC =最小腫瘤穩定MetMAb濃度。圖12 :1期劑量漸增(dose escalation)研究設計。圖13 1期劑量漸增研究中患者診斷、治療組和施用周期。在劑量-漸增階段中每個患者的MetMAb暴露周期。除非另有註明，所有患者由於進展性疾病脫離研究。圖14 每個劑量組中每個藥物代謝動力學時間點的MetMAb血清濃度在所有患者中進行平均。對每個組用均值(士SD)MetMAb濃度相對於時間進行作圖。圖15 使用PK/PD建模來確定人中MTC中值(median)，其是基於臨床前腫瘤異種移植物研究和種間比例確定來進行。人中血清中MetMAb的MTC確定為15ug/mL。使用基於來自這種1期研究觀察到的1 數據的模擬實驗來鑑定15mg/kg Q3W劑量(箭頭)，其在 90%的患者中獲得大於或等於MTC的穩態谷濃度。MTC =最小腫瘤穩定濃度，PK =藥物代謝動力學，PD =藥效學；SS =穩態，Q3W =每三周一次。圖16 =Met的抑制可能影響循環配體HGF的水平。通過基於ELISA的方法測量血清HGF水平。數據以基線HGF表達降序呈現。總體而言，用MetMAb處理時似乎有很小或沒有HGF表達的增加。然而顯示最高水平的基線HGF表達的兩個患者表現出顯著的HGF表達降低。對於患者11009，藥物治療後HGF水平降低70%並且保持低水平。C=周期，D=天， HGF =肝細胞生長因子，M =男性，F =女性，ClDl，C2D1，C3D1 給藥前；C1D2 給藥後24h。圖17 血清IL8水平的評價。數據以基線IL8表達的降序呈現。總體而言，具有高於正常對照的基線血清IL8水平的大部分患者在MetMAb輸注後有血清IL8的降低。在 4周期間健康志願者IL8的受試者內變異是 3-10pg/ml。IL8 =白細胞介素8，MSD =中間測量發現(meso scale discovery)，C =周期，D =天，M =男性，F =女性，C1D1，C2D1， C3D1 給藥前；C1D2 給藥後24h。圖18 參與劑量漸增階段的所有患者的最佳腫瘤反應。一位患者未進行評價，因為該患者在第一評價時間點之前有進展；另一位患者的CT評價在這些數據收集的時間不能獲得。標明了患者數目和腫瘤類型。SLD=最長直徑的總和。圖19 患者11009的CT和MRI掃描。左上組患者11009在2007年8月的CT掃描。右上組患者11009的CT掃描，這使得她有資格登記進入MetMAbI期試驗。左下組CT 掃描顯示完全反應。右下組:MRI掃描確認了完全反應。圓圈標明了腫瘤的位點。圖20 患者11009的標本組織的免疫組織化學染色。患者11009的標本胃腺癌樣本的免疫組織化學染色揭示腫瘤細胞中有中度的膜和胞質c-met表達和胞質和膜周邊HGF 表達。
詳細描述I.定義術語"肝細胞生長因子"或"HGF"，用於本文時，除非另有說明，是指任何天然或變體(天然的或合成的)HGF多肽，其能夠在允許此類過程發生的條件下激活HGF/c-met 信號傳導途徑。術語"野生型HGF" —般是指包含天然存在HGF蛋白的胺基酸序列的多肽。 術語"野生型HGF序列"一般是指在天然存在的HGF中發現的胺基酸序列。c-met是HGF 的已知受體，通過c-met在生物學上完成HGF的細胞內信號傳導。術語"HGF變體"用於本文時是指這樣的HGF多肽，其包括天然HGF序列中一個或多個胺基酸突變。任選地，一個或多個胺基酸突變包括胺基酸置換(一個或多個)。「天然序列」多肽包含與來自自然的多肽具有相同的胺基酸序列的多肽。因此，天然序列多肽可以具有來自任何哺乳動物的天然存在的多肽的胺基酸序列。所述天然序列多肽可以從自然分離或可以通過重組或合成方式產生。術語「天然序列」多肽具體地包括多肽的天然存在的截短或分泌形式(例如，細胞外結構域序列)，天然存在的變體形式(例如， 可變剪接形式)和多肽的天然存在的等位基因變體。多肽「變體」指與天然序列多肽具有至少約80%胺基酸序列同一性的生物學活性多肽。此類變體包括例如其中在多肽的N末端或C末端添加或缺失一個或多個胺基酸殘基的多肽。通常，變體將會與天然序列多肽具有至少約80%胺基酸序列同一性，更優選地至少約90%胺基酸序列同一性，以及甚至更優選地至少約95%胺基酸序列同一性。「 EGFR 「是指受體酪氨酸激酶多肽表皮生長因子受體，其在Ullrich等， Nature (自然)(1984)309 :418425中描述，另外也稱為Her-I和c-erbB基因產物，以及其變體如EGFRvIII。EGFR的變體也包括缺失、置換和插入變體，例如在Lynch等(New England Journal of Medicine (新英格蘭醫學雜誌)2004，350 :2129)，Paez 等(Science (科學)2004，304 :1497)，Pao 等(PNAS 2004，101 13306)中描述的那些。「生物學樣品"(可相互替換地稱為「樣品」或「組織或細胞樣品」)涵蓋從個體獲得的多種樣品類型並可用於診斷或檢測測定中。該定義涵蓋生物學來源的血和其它液體樣品，實體組織樣品如活組織檢查樣品或組織培養物或由其衍生的細胞，以及其後代。該定義也包括在它們獲得後以任何方式操作的樣品，如用試劑處理，增溶，或富集某些成分如蛋白或多核苷酸，或包埋在半固體或固體基質中用於切片的目的。術語"生物學樣品"涵蓋臨床樣品，並也包括培養物中的細胞、細胞上清液、細胞裂解物、血清、血漿、生物學液體和組織樣品。生物學樣品的來源可以是實體組織，來自於新鮮、冷凍和/或儲存的器官或組織樣品或活組織檢查或抽吸；血液或任何血液成分；體液如腦脊液、羊水、腹水或間質液；來自於受試者懷孕或發育的任何時間的細胞。在一些實施方案中，生物學樣品從原發或轉移腫瘤中獲得。生物學樣品可含有本身與組織不天然混合的化合物如防腐劑、抗凝劑、緩衝劑、 固定劑、營養素、抗生素、或諸如此類的。「抗-c-met抗體"是以足夠親和力和特異性結合c-met的抗體。所選擇的抗體通常具有針對c-met的足夠強的結合親和力，例如所述抗體可以以介於IOOnM-IpM之間的Kd值結合人c-met。抗體親和力可以通過例如基於表面等離子共振(surface plasmon resonance)的測定法(諸如BIAcore測定法，如PCT申請公開號W02005/012359所記載的)；酶聯免疫吸附測定法(ELISA)；和競爭測定法(例如RIA)來測定。在某些實施方案中，該抗-c-met抗體可在靶向和介入其中涉及c-met活性的疾病或病症中用作治療劑。另外，所述抗體可以進行其它生物學活性測定法，例如為了評估其作為治療劑的效力。此類測定法是本領域已知的，而且依賴於所述抗體的靶抗原和預期用途。『『 c-met激活〃是指c-met受體的激活或磷酸化。通常，c-met激活導致信號轉導(例如由c-met受體的細胞內激酶結構域磷酸化c-met或底物多肽中的酪氨酸殘基所導致)。c-met激活可由c-met配體(HGF)結合感興趣的c_met受體來介導。HGF結合c_met 可激活c-met的激酶結構域並由此導致c-met中酪氨酸殘基的磷酸化和/或另外的底物多肽(一個或多個)中的酪氨酸殘基的磷酸化。「EGFR拮抗劑」(互換地稱為「EGFR抑制劑」)是幹擾EGFR激活或功能的藥劑。EGFR 抑制劑的實例包括EGFR抗體；EGFR配體的抗體；小分子EGFR拮抗劑；EGFR酪氨酸激酶抑制劑；反義和抑制性RNA(例如，shRNA)分子(見例如，W02004/87207)。優選地，EGFR抑制劑是結合EGFR的抗體或小分子。在一些實施方案中，EGFR抑制劑是靶向EGFR的藥物。在特定實施方案中，EGFR抑制劑與EGFR的結合親和力(解離常數)約為1，OOOnM以下。在另一個實施方案中，EGFR抑制劑與EGFR的結合親和力約為IOOnM以下。在另一個實施方案中，EGFR抑制劑與EGFR的結合親和力約為50nM以下。在一個特定的實施方案中，EGFR抑制劑與EGFR共價結合。在一個特定的實施方案中，EGFR抑制劑以1，OOOnM以下的IC50抑制EGFR細胞傳導。在另一個實施方案中，EGFR抑制劑以500nM以下的IC50抑制EGFR信號傳導。在另一個實施方案中，EGFR抑制劑以50nM以下的IC50抑制EGFR信號傳導。在某些實施方案中，EGFR拮抗劑降低或抑制，至少10%, 20%, 30%,40%, 50%,60%, 70%,80%, 90%或更高的EGFR的表達水平或生物學活性。"EGFR激活」指EGFR的激活或磷酸化。一般情況下，EGFR激活導致信號轉導(例如，其由EGFR受體的細胞內激酶結構域磷酸化EGFR或底物多肽中的酪氨酸殘基所導致)。 EGFR激活可以由結合包含EGFR的EGFR 二聚體的EGFR配體所介導。EGFR配體與EGFR 二聚體的結合可以激活二聚體中的一個或多個EGFR的激酶結構域並且由此導致在一個或多個EGFR中的酪氨酸殘基的磷酸化和/或在另外的底物多肽(一個或多個)中的酪氨酸殘基的磷酸化。用於本文時，術語"EGFR-靶向藥物"是指結合EGFR並抑制EGFR激活的治療齊U。此類藥劑的實例包括結合EGFR的抗體和小分子。結合EGFR的抗體的實例包括MAb 579 (ATCC CRL HB 8506)，MAb 455 (ATCC CRL HB8507)，MAb 225 (ATCC CRL 8508)，MAb 528 (ATCC CRL 8509)(參見美國專利No. 4，943，533，Mendelsohn等)及其變體，如嵌合的225(C225或西妥昔單抗(Cetuximab) ；ERBUTIX )和改型的人225 (Η225)(參見，WO 96/40210，Imclone Systems Inc.) ；IMC-11F8，其是全人的、EGFR-靴向抗體(Liiclone)； 結合II型突變的EGFR的抗體(美國專利No. 5，212，290)；結合EGFR的人源化和嵌合抗體，如美國專利No. 5，891，996中所描述；和結合EGFR的人抗體，如ABX-EGF (參見 W098/50433, Abgenix) ；EMD 55900 (Stragliotto 等 Eur. J. Cancer 32A :636-640 (1996))； EMD7200 (matuzumab)，其是針對EGFR的人源化EGFR抗體，與EGF和TGF- α兩者競爭EGFR 的結合；和mAb 806或人源化mAb 806 (Johns等，J.Biol. Chem.(生物化學雜誌)279 ( ) 30375-30384 (2004))。抗-EGFR抗體可與細胞毒性劑綴合，從而產生免疫綴合物(參見，例如EP659，439A2，Merck Patent GmbH)。結合EGFR的小分子的實例包括ZD1839或吉非替尼
18(IRESSA ；Astra Zeneca) ；CP-358774 或厄洛替尼(TARCEVA ;Genentech/0SI)；和 AG1478， AG1571(SU 5271 ； Sugen) ；EMD-7200。短語"基因擴增"是指這樣的過程，通過該過程多拷貝的基因或基因片段在特定細胞或細胞系中形成。被複製的區(一段擴增的DNA)常常被稱為「擴增子」。通常，所產生的信使RNA(mRNA)的量，即基因表達的水平，也與該特定基因表達產生的拷貝數成比例的增加。「酪氨酸激酶抑制劑"是這樣的分子，其在一些程度上抑制酪氨酸激酶如c-met 受體的酪氨酸激酶活性。「顯示c-met和/或EGFR表達、擴增或激活」的癌症或生物學樣品是在診斷測試中，表達(包括過表達)c-met和/或EGFR，具有擴增的c-met和/或EGFR基因，和/或其它證明c-met和/或EGFR激活或磷酸化的癌症或生物學樣品。「不顯示c-met和/或EGFR表達、擴增或激活」的癌症或生物學樣品是在診斷測試中，不表達(包括過表達)c-met和/或EGFR，不具有擴增的c-met和/或EGFR基因，和/ 或其它未證明c-met和/或EGFR激活或磷酸化的癌症或生物學樣品。「顯示c-met和/或EGFR激活〃的癌症或生物學樣品是在診斷測試中，證明 c-met和/或EGFR的激活或磷酸化的癌症或生物學樣品。此類激活可直接確定(例如通過 ELISA測量c-met和/或EGFR磷酸化)或間接確定。「不顯示c-met和/或EGFR激活〃的癌症或生物學樣品是在診斷測試中，未證明 c-met和/或EGFR的激活或磷酸化的癌症或生物學樣品。此類激活可直接確定(例如通過 ELISA測量c-met和/或EGFR磷酸化)或間接確定。「顯示c-met和/或EGFR擴增「的癌症或生物學樣品是在診斷測試中具有擴增的c-met和/或EGFR基因的癌症或生物學樣品。「不顯示c-met和/或EGFR擴增「的癌症或生物學樣品是在診斷測試中不具有擴增的c-met和/或EGFR基因的癌症或生物學樣品。「磷酸-ELISA測定(phospho-ELISA assay)，，在本文中指在酶聯免疫吸附測定法 (ELISA)中評估一種或多種c-met和/或EGFR的磷酸化的測定，其中使用檢測磷酸化的 c-met和/或EGFR的試劑(通常是抗體)、底物或下遊信號傳導分子。優選的是，使用檢測磷酸化c-met和/或EGFR的抗體。該測定可對細胞裂解物、優選來自新鮮的或冷凍的生物學樣品的細胞裂解物進行。"c-met和/或EGFR過表達或擴增」的癌細胞指與同一組織類型的非癌細胞相比， 具有顯著更高水平的c-met和/或EGFR蛋白質或基因的癌細胞。此類過表達可以是由基因擴增或者轉錄或翻譯增加引起的。可在診斷或預後測定中通過評估細胞表面上存在的 c-met和/或EGFR蛋白質水平的升高(例如通過免疫組化測定，IHC)來測定c-met和/或 EGFR的過表達或擴增。備選地/另外地，可測量細胞中編碼c-met和/或EGFR的核酸的水平，例如通過螢光原位雜交(FISH ；參見1998年10月公布的W098/4M79)、Southern印跡或聚合酶鏈反應(PCR)技術，諸如定量實時PCR(qRT-PCR)。在上述測定法之外，熟練從業人員還可利用多種體內測定法。例如，可將患者體內細胞暴露於任選用可檢測標記物例如放射性同位素標記的抗體，並且可評估該抗體與患者體內細胞的結合，例如通過外部掃描放射性或通過分析取自事先已暴露於所述抗體的患者的活組織檢查。
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「不過表達或擴增c-met和/或EGFR"的癌症細胞是指與同一組織類型的非癌細胞相比，不具有高於正常水平的c-met和/或EGFR蛋白質或基因的癌症細胞。術語「突變」在用於本文時指特定蛋白質或核酸(基因，RNA)分別相對於野生型蛋白質或核酸的胺基酸或核酸序列的差異。突變的蛋白質或核酸可以由基因的一個等位基因(雜合的)或兩個等位基因(純合的)表達或者在其中找到，而且它可以是體細胞的或種系的。在本發明中，突變一般是體細胞的。突變包括序列重排，諸如插入、缺失、和點突變 (包括單核苷酸/胺基酸多態性)。蛋白質「表達」指基因中所編碼的信息轉換成信使RNA(mRNA)，然後轉換成蛋白質。在本文中，「表達」目的蛋白質(諸如HER受體或HER配體)的樣品或細胞指其中測定出存在編碼該蛋白質的mRNA，或蛋白質(包括其片段)的樣品或細胞。術語〃白細胞介素8〃或〃 IL8"或〃 IL-8"，用於本文時，除非另外指明，是指任何天然或變體(天然的或合成的)IL8多肽，其能夠在允許此類過程發生的條件下激活 IL8信號傳導途徑。術語"野生型IL8" —般是指包含天然存在IL8蛋白的胺基酸序列的多肽。術語"野生型IL8序列"一般是指在天然存在的IL8中發現的胺基酸序列。術語「VEGF」或「VEGF-A」用於指165個胺基酸的人血管內皮細胞生長因子及相關的121個、189個和206個胺基酸的人血管內皮細胞生長因子，如Leung等科學(kience)， 246 :1306(1989)；和 Houck 等分子內分泌學(Mol. Endocrin.)，5 1806 (1991)，所記載的， 及其天然存在等位基因形式和加工形式。VEGF-A是包括VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E、 VEGF-F和PlGF的基因家族的一部分。VEGF-A主要結合兩種高親和力受體酪氨酸激酶， 即VEGFR-I (Flt-I)和VEGFR-2 (Flk-1/KDR)，後者是VEGF-A血管內皮細胞有絲分裂信號的主要遞質。另外，已經鑑定出neuropilin-Ι作為肝素-結合VEGF-A同種型受體，並可能在血管發育中發揮作用。術語「VEGF」或「VEGF-A」還指來自非人物種(諸如小鼠、大鼠或靈長類動物)的VEGF。有時，來自特定物種的VEGF用如下術語表示，諸如hVEGF表示人 VEGF或mVEGF表示鼠VEGF。術語「VEGF」還用於指包含165個胺基酸的人血管內皮細胞生長因子的胺基酸第8-109位或第1-109位的多肽截短形式或片段。在本申請中可通過例如〃 VEGF(8-109), 「 「 VEGF(1-109) 〃或〃 VEGF165〃表示對任何此類形式的VEGF的引述。「截短的」天然VEGF的胺基酸位置如天然VEGF序列中所示的編號。例如，截短的天然 VEGF中的第17位胺基酸(甲硫氨酸)也是天然VEGF中的第17位(甲硫氨酸)。截短的天然VEGF具有與天然VEGF相當的對KDR和Flt-I受體的結合親和力。術語"VEGF變體"用於本文時是指在天然VEGF序列中包括一個或多個胺基酸突變的VEGF多肽。任選地，該一個或多個胺基酸突變包括胺基酸置換(一個或多個)。為了對本文描述的VEGF變體速記命名的目的，請注意數字是指根據推定的天然VEGF的胺基酸序列(在Leimg等，見上文和Houck等，見上文中提供)的胺基酸殘基位置。"VEGF生物學活性」包括與任何VEGF受體的結合或任何VEGF信號傳導活性如調節正常和異常血管發生和血管生成二者Perrara和Davis-Smyth(1997)內分泌綜述 (Endocrine Rev.) 18 4-25 ；Ferrara (1999)分子醫學雜誌(J. Mol. Med.) 77 :527-543)；促進胚胎血管發生和血管生成(Carmeliet等.(1996)自然(Nature) 380 :4；35_439 ;Ferrara 等.(1996)自然(Nature) 380 :439-442)；和調節雌性生殖道的周期性血管增殖，以及骨生長和軟骨形成(Ferrara等.(1998)自然醫學(Nature Med.) 4 :336-340 ；Gerber 等.(1999)自然醫學(Nature Med.) 5 =623-628) 0除了作為血管發生和血管生成中的生血管因子之外，VEGF還作為多效生長因子在其它生理過程中顯示了多種生物學效應，如內皮細胞存活， 血管滲透性和血管舒張，單核細胞趨化作用和鈣流入Perrara和Davis-Smyth (1997)，見上文，和 Cebe-Suarez 等，細胞分子生命科學(Cell. Mol. Life. Sci). 63 :601-615(2006)。 而且，最近的研究已經報導了 VEGF對於數種非內皮細胞類型，如視網膜色素上皮細胞、胰管細胞和許旺細胞的促有絲分裂作用。Guerrin等.(19%)細胞生理學雜誌 (J. Cell Physiol.) 164 :385-394 ；Oberg-Welsh 等(1997).分子細胞內分泌學(Mol. Cell. Endocrinol). 126 :125-132(1997) ；Sondell 等.神經科學雜誌(J. Neurosci.) 19 5731-5740(1999)。「血管發生抑制劑」或「抗血管發生劑」指直接或是間接抑制血管發生、血管生成、 或不想要的血管通透性的小分子量物質、多核苷酸、多肽、分離的蛋白質、重組蛋白、抗體、 或其綴合物或融合蛋白。應當理解抗血管發生劑包括結合和阻斷血管發生因子或其受體的血管發生活性的那些藥劑。例如，抗血管發生劑是上文定義的血管發生劑的抗體或其它拮抗劑，例如VEGF-A、或VEGF-A受體(例如KDR受體或Flt-I受體)的抗體，抗-PDGFR抑制劑如GLEEVEC (甲磺酸伊馬替尼(Imatinib Mesylate) )0抗血管發生劑還包括天然血管發生抑制劑，例如制管張素、內皮生長抑素等。參見例如Klagsbrun和D』 Amore生理學年評(Annu. Rev. Physiol.) 53 :217-39 (1991) ；Streit 和 Detmar 癌基因(Oncogene) 22 3172-3179(2003)(例如列舉惡性黑素瘤中抗血管發生療法的表3) ；Ferrara和Alitalo 自然藥物(Nature Medicine) 5 :1359-1364(1999) ；Tonini 等癌基因(Oncogene) 22 6549-6556(2003)(例如列舉已知抗血管發生因子的表2)；及Sato, Int. J. Clin. Oncol. 8 200-206(2003)(例如列舉臨床試驗中所使用的抗血管發生藥劑的表1)。"VEGF拮抗劑」指能夠中和、阻斷、抑制、消除、降低或幹擾VEGF活性(包括其與一種或多種VEGF受體的結合)的分子(肽基或非肽基)。在某些實施方案中，VEGF拮抗劑將VEGF的表達水平或生物學活性降低或抑制至少10 %、20 %、30 %、40 %、50 %、60 %、 70%,80%,90%或更多。在一個實施方案中，受到VEGF拮抗劑抑制的VEGF是VEGF(8-109)、 VEGF (1-109)或VEGF165。可用於本發明方法的VEGF拮抗劑包括特異性結合VEGF的肽基或非肽基化合物，諸如抗VEGF抗體及其抗原結合片段、特異性結合VEGF的多肽或其片段；和特異性結合VEGF由此使其隔絕與一種或多種受體(例如可溶性VEGF受體蛋白質或其VEGF 結合片段、或嵌合VEGF受體蛋白質)結合的受體分子及衍生物；至少與編碼VEGF多肽的核酸分子的片段互補的反義核鹼基(nucleobase)寡聚物；至少與編碼VEGF多肽的核酸分子的片段互補的小RNA ；靶向VEGF的核酶；針對VEGF的肽體(ρ印tibody) 』及VEGF適配體。術語「抗VEGF抗體」指以足夠親和力和特異性結合VEGF的抗體。所選擇的抗體通常具有針對VEGF的足夠強的結合親和力，例如所述抗體可以以介於IOOnM-IpM之間的Kd 值結合hVEGF。抗體親和力可以通過例如基於表面等離子共振的測定法(諸如BIAcore測定法，如PCT申請公開號W02005/012359所記載的)；酶聯免疫吸附測定法(ELISA)；和競爭測定法(例如RIA)來測定。在某些實施方案中，本發明的抗-VEGF抗體可在靶向或幹擾其中涉及VEGF活性的疾病或病症中用作治療劑。另外，該抗體可以進行其它生物學活性測定法，例如為了評估其作為治療劑的效力。此類測定法是本領域已知的，而且依賴於所述抗體的靶抗原和預期用途。實例包括HUVEC抑制測定法(如在下文實施例中描述的)；腫瘤細胞
21生長抑制測定法(如例如W089/06692所描述的)；抗體依賴性細胞的細胞毒性(ADCC)和補體介導的細胞毒性(CDC)測定法(美國專利5，500，36 ；及激動性活性或造血測定法(參見TO95/27062)。抗VEGF抗體通常不會結合其它VEGF同源物，諸如VEGF-B、或VEGF-C，也不結合其它生長因子，諸如P1GF、PDGF或bFGF。在某些實施方案中，抗VEGF抗體包括與雜交瘤ATCC HB 10709所生成的單克隆抗VEGF抗體A4. 6. 1結合相同表位的單克隆抗體；重組人源化抗-VEGF單克隆抗體(根據I^resta等癌症研究(CancerRes.) 57 :4593-4599(1997)產生)。在一個實施方案中，該抗-VEGF 抗體是「貝伐珠單抗(Bevacizumab，BV) 」、也稱為「rhuMAb VEGF」或「AVASTIN 」。 其包含突變的人IgGl構架區和來自鼠抗hVEGF單克隆抗體A. 4. 6. 1 (其阻斷人VEGF結合其受體)的抗原結合互補性決定區。貝伐珠單抗大約93%的胺基酸序列(包括大部分構架區)衍生自人IgGl，而大約7%的序列衍生自鼠抗體A4. 6.1。貝伐珠單抗具有約149,000 道爾頓的分子量，而且是糖基化的。貝伐珠單抗已經被FDA批准用於聯合其它化學治療方案來治療轉移性結腸直腸癌(metastatic colorectal cancer(CRC))和非小細胞肺癌 (NSCLC)。Hurwitz 等，N. Engl. J. Med.(新英格蘭醫學雜誌)350 :2335-42(2004) ；Sandler 等，N. Engl. J.Med.(新英格蘭醫學雜誌)355 :2M2_5(K2006)。目前，貝伐珠單抗在許多正在進行的臨床試驗中進行研究以用於治療多種癌症適應症。Kerbel，J. Clin. Oncol.(臨床腫瘤學)19 :45S-51SQ001) ；De Vore 等，Proc. Am. Soc. Clin. Oncol. 19 :485a. (2000)； Hurwitz 等，Clin. Colorectal Cancer 6 :66-69 (2006) ； Johnson 等，Proc. Am. Soc. Clin. Oncol. 20 :315a(2001) ；Kabbinavar 等 J. Clin. Oncol.(臨床腫瘤學)21 :60-65(2003)； Miller 等，Breast Can. Res. Treat. 94 =Suppl 1 :S6 (2005)。貝伐珠單抗和其它人源化抗VEGF抗體進一步記載於2005年2月沈日授權的美國專利號6，884，879。另外的抗體包括G6或B20系列抗體(例如G6-3UB20-4. 1)，如PCT
發明者亞瑟·E·雷耶斯二世, 史蒂夫·艾普勒, 埃米·C·彼得森, 尼爾森·L·瓊布, 布蘭登·C·本德, 普裡蒂·赫格德, 項洪, 馬克·麥錢特 申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司