川芎嗪衍生物在製備治療肝纖維化藥物中的應用的製作方法
2023-08-03 07:08:01 1
專利名稱：川芎嗪衍生物在製備治療肝纖維化藥物中的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種化學名為2，5_ 二羥甲基-3，6-二甲基吡嗪的川芎嗪衍生物 (H168)，尤其是涉及H168在製備抗肝纖維化藥物中的應用。
背景技術：
肝纖維化(Hepatic Fibrosis)是繼發於各種形式慢性肝損傷(包括病毒性肝炎， 酗酒，藥物作用，代謝性疾病)之後組織修復過程中的代償反應，也是慢性肝病發展為肝硬化必經的病理過程。肝炎是我國發病率較高的疾病之一，就目前而言我國的肝病狀況不容樂觀，肝纖維化的發病率持續上升，現已成為我國衛生部門最關心、重視的課題之一。纖維化的實質是肝內細胞外基質(Extracellular matrix, ECM)合成大於降解導致大量ECM過度沉積。ECM主要來源於肝星狀細胞Ofepatic stellate cells，HSC)，又稱儲脂細胞、Ito細胞、維生素A儲存細胞等，是肝臟間質細胞之一，位於肝細胞與竇內皮細胞間的Disse腔內，約佔肝臟非實質細胞總數的1/3，與肝竇內皮細胞和肝細胞緊密接觸。正常時呈靜止狀態，不合成或僅合成少量基質，但在肝組織損傷時刺激HSC活化並轉變為肌成纖維細胞(Myofibroblasts-like cells，MFB)，收縮遷移表現為細胞增殖。活化的HSC 形態和功能的改變奠定了 HSC在纖維化形成中的關鍵作用，HSC激活和增生是纖維化發生的中心環節。探討抑制HSC活化和誘導其凋亡的機制及尋找有效的抗纖維化的藥物至關重要，已引起國內外學者越來越多的關注。近年來，國內外學者針對肝纖維化的形成機制，提出了一系列抗肝纖維化治療藥物和方法，如腎上腺皮質素、幹擾素等治療，但療效不佳。秋水仙在抗肝纖維化方面的療效得到了肯定，但毒副作用大，不宜長期使用。中藥複方及單體藥物抗肝纖維化的作用一直是國內外科研及臨床研究的重點和熱點。目前，我國已出現相關抗肝纖維化的複方，但其均為中藥大複方粗製劑，具有服用量大，服用周期長，療效不確切，治療機理不明確等缺點。中藥單體的研究近年來取得了較大成果，如薑黃素抗肝纖維化的機制已經明確，但胃腸道不易吸收。這就迫使我們需要尋求一種新的易吸收的、適合於臨床應用的藥物。川芎(ligusticum chuanxiong)，為傘形科蒿木屬植物的根莖，性辛、溫，辛香行散，溫通血脈，功能活血行氣，消散淤血，祛風止痛，被前人譽為血中之氣藥。川芎嗪是由川芎的根莖提取的有效成分，學名為2，3，5，6-四甲基吡嗪(tetramethylpyrazine，TMP)，為吡嗪類生物鹼。分子式=C8H1J2，分子量136. 20，無色針狀結晶，熔點80-82°C (顯微測定)， 沸點190°C。具有特殊異臭，有吸溼性，易升華。易溶於熱水、石油醚，溶於氯仿、稀鹽酸，微溶於乙醚，不溶於冷水。川芎嗪有活血化瘀，抗血小板凝聚，擴張小動脈，改善微循環，抗氧化，拮抗鈣離子及抗纖維化等作用。近年來，川芎嗪抗組織器官纖維化方面的作用受到關注，其對心肌纖維化、肺纖維化、腎纖維化都有公認的療效，而且川芎嗪發揮以上抗纖維化作用的機制基本相同。鑑於川芎嗪具有代謝快、半衰期短等不利於臨床應用的藥代學特點，對川芎嗪代謝產物的活性進行分析，確定川芎嗪抗肝纖維化活性的必須部位和可取代部位，通過構效分析，初步確定川芎嗪的吡嗪環為其藥效必須部位，所連接的四個取代基為可修飾基團，因此有目的性和針對性地對川芎嗪側鏈進行改造，得到所需要的抗肝纖維化藥物，化學名為2，5_ 二羥甲基-3，6-二甲基吡嗪的川芎嗪衍生物。利用川芎嗪衍生物抗肝纖維化的研究，還未見有報導。
發明內容
發明目的為了解決上述問題，本發明的目的在於提供一種2，5- 二羥甲基_3， 6-二甲基吡嗪在製備抗纖維化疾病中的應用，所述疾病為肝纖維化。技術方案本發明的技術方案是體內研究觀察H168對大鼠肝功能的檢測及肝纖維化相關指標的測定等。本發明採用大鼠肝纖維化模型及肝星狀細胞細胞株HSC-T6，研究H168 在大鼠整體、體外的細胞水平、分子水平上對HSC-T6的增殖、凋亡和相關信號轉導通路中關鍵蛋白表達情況等作用效果，揭示H168抗肝纖維化藥物的分子機制，確定其可能的作用靶點，為製備抗肝纖維化藥物提供了重要依據。本發明所涉及的抗肝纖維化藥物，是H168按照常規的藥物製劑工藝製備成一種適合臨床上使用的藥物製劑，並具備顯著的抑制細胞增殖和誘導凋亡的療效。有益效果所述川芎嗪衍生物代號H168，是傘形科藁本屬植物川芎中分離所得的生物鹼類化合物川芎嗪的衍生物，其化學名稱是2，5_ 二羥甲基-3，6-二甲基吡嗪，分子式為 C8H12N2O2,其結構式如下
H3C N CH2OH
HOH2C 八 N 八CH3 ι所述的H168主要通過體內觀察H168對大鼠肝功能的檢測及肝纖維化相關指標的測定；體外對肝星狀細胞增殖、凋亡等來研究H168抗肝纖維化作用。實驗表明，H168具有優良的抗肝纖維化效果，不管是在整體對大鼠肝纖維化模型，還是抑制細胞增殖，誘導細胞凋亡都有很強的作用。所述的H168是一種具有抗肝纖維化作用的新化合物，可以用於製備抗肝纖維化藥物。
圖1為H168對HSC-T6增殖的影響；圖2為H168對HSC-T6的細胞毒性作用；圖3為不同濃度H168對HSC-T6細胞凋亡率的影響；圖4為H168對HSC-T6的Bcl_2、Bax和Caspase-3蛋白表達的影響。
具體實施例方式體內試驗實施例1 觀察H168對大鼠肝纖維化的作用1. 1 動物清潔級SD大鼠60隻，雄性，體質量QOO士20) g，由上海斯萊克公司提供，許可證號SCXK (滬)2007-0005。1. 2藥物與主要試劑H168 (由南京中醫藥大學李偉教授惠贈)，CCl4(南京化學試劑廠產品批號 20090120)，ALT,AST,ALP測定試劑盒(購自南京建成生物工程研究所)，LN、HA、PCIIIELISA 試劑盒(自上海西諾生物科技有限公司)。1. 3主要儀器全自動生化儀(日立型號7020)。1. 4動物分組隨機分為5組，每組12隻。1.5動物模型的建立將CCl4製成50%橄欖油劑，按lml/kg體重在每隻大鼠腹腔注射，第一周三次，第二周後每周二次，同時餵以10%的酒精飲料，共六周。除正常組(腹腔注射相同體積生理鹽水)外，餘組均同步予以造模。1. 6治療方法藥物治療組每日治療1次，一周6日，灌胃給藥H168100mg/kg、200mg/kg、300mg/ kg，共6周。模型組每日1次，一周6日，灌胃給200mg/kg生理鹽水，共6周。1. 7指標檢測治療與造模結束後，將所有的大鼠通過頸總動脈取血，離心後分離血清，使用半自動生化儀檢測大鼠ALT (丙氨酸轉氨酶)、AST (天門冬氨酸轉氨酶)、ALP (血清鹼性磷酸酶) 含量，使用ELISA試劑盒檢測大鼠血清HA(透明質酸)、LN(層粘連蛋白)、PCIII (III型前膠原)的含量。1. 8統計學方法實驗數據用均數士標準差(χ士s)表示，採用EXCEL軟體進行統計分析。組間均數比較用方差分析，t檢驗，以P < 0. 05為差別有統計學意義。1. 9 結果H168對大鼠血清指標ALT、AST、ALP的影響ALT、AST、ALP主要為細胞內酶，正常機體血清中這三種酶活性很低，當肝細胞損傷時，細胞內酶大量入血，從而引起血液中這三種酶的活性升高，臨床上也用ALT、AST、ALP作為比較敏感的肝功能檢測指標，它的升高標誌著肝細胞膜和細胞器的損傷。(見表一)表一各組大鼠血清指標ALT、AST、ALP檢測結果(χ士 s)
Group 生理鹽水組
模型組
低劑量組
N 12
9
10 11 11
ALT 40.11±8.12 68.32±11.89** 55.25士 12.73** 51.14±13.45* 46.35±10.12*
5
AST 120.31±28.91 181.25±69.54** 127.81 士 30.15** 127.32±35.76* 115.42±29.15
ALP 243. 69±89.25 312.33±99.15* 300.15士63.65* 279.45±71.15* 271.31±63.45
中劑量組高劑量組
(與正常組相比*P < 0. 05，**P < 0. 01)H168對大鼠纖維化血清指標HA、LN、PCI11的影響HA是一種廣泛存在於細胞外基質中的高分子多糖，由肝內間質細胞主要是HSCs 合成，主要由肝竇內皮細胞進行降解。因此，HA可以反映肝臟的損傷程度和纖維化的發展變化。LN是一種大分子非膠原糖蛋白，由肝星狀細胞合成後主要分布於基底膜的透明層中。 肝纖維化，肝星狀細胞大量合成和分泌膠原、LN等間質成分，形成完整的基底膜。PCIII是 III型前膠原分泌至肝細胞外沉積前，PCIII升高反映的是肝臟纖維增生活躍。(見表二)表二 各組大鼠血清肝纖維化指標HA、LN、PCIII檢測結果(χ士 s)
權利要求
1.2,5- 二羥甲基-3，6- 二甲基吡嗪在製備抗纖維化疾病中的應用，所述疾病為肝纖維化。
全文摘要
本發明屬於製藥領域，公開了川芎嗪衍生物(2，5-二羥甲基-3，6-二甲基吡嗪)在製備抗肝纖維化藥物中的應用。該川芎嗪衍生物的化學名為2，5-二羥甲基-3，6-二甲基吡嗪，其分子式為C8H12N2O2。本發明研究發現該川芎嗪衍生物從體內和體外實驗均表現出良好的抗肝纖維化作用。
文檔編號A61P1/16GK102198137SQ20111008308
公開日2011年9月28日 申請日期2011年4月2日 優先權日2011年4月2日
發明者嚴令耕, 倪春豔, 呂旋, 張峰, 李偉, 王愛雲, 鄭仕中, 陸茵 申請人:南京中醫藥大學