生物測定器及用其進行底物定量的方法
2023-08-02 14:07:41 1
專利名稱：生物測定器及用其進行底物定量的方法
發明的背景本發明涉及簡便地實施底物高精度定量用的生物測定器，及使用該生物測定器的底物定量法。
以往，順利地進行試樣液的稀釋和攪拌等、簡易地將試樣液中的特定成分定量的方法，有將特定成分與以特定成分為底物的氧化還原酶在電子傳遞體的存在下進行反應，將還原的電子傳遞體進行電化學氧化，從此氧化電流值求出特定成分的濃度的方法。
該方法通常採用第2517153號公報揭示的生物測定器來進行。
該生物測定器系在絕緣基板上用篩網印刷等方法形成由作用極和對極組成的電極系，在此電極系上形成含有氧化還原酶和電子傳遞體的試藥層。在此絕緣基板上，蓋板和隔板組合製成生物測定器。
這樣的生物測定器通過使用各種氧化還原酶可定量測定各種特定成分。
作為生物測定器的一個例子，可以葡萄糖測定器加以說明。
葡萄糖的定量方法，通常知道的有將葡萄糖氧化酶和氧化電極或過氧化氫電極組合的方式(例如，鈴木周一編的「生物測定器」講習社)。
葡萄糖氧化酶作為反應系統的電子傳遞體，選擇性地將底物β-D-葡萄糖氧化成D-葡萄糖酸-δ-內酯。與此反應同時，氧被還原成過氧化氫。用氧電極測定此時的氧耗量，或以用白金電極等的過氧化氫電極測定過氧化氫的生成量，可進行葡萄糖的定量。
然而，在上述方法中，因測定對象的不同，受溶存氧濃度的影響很大，且在無氧的條件下不能測定。
於是，開發了不使用氧作為電子傳遞體而用氰鐵酸鉀(フエリシアン化カリウム)、二茂鐵衍生物、苯醌衍生物等金屬配合物等有機化合物作為電子傳遞體類型的葡萄糖測定器。
這種類型的葡萄糖測定器可將已知量的葡萄糖氧化酶和電子傳遞體以安定狀態負載於電極上，可將電極系和試藥層在接近乾燥的狀態下成為一體。
這樣的葡萄糖測定器是一次性使用型的，只要在插入測定器中的測定頭中加入檢體試樣，即可容易地測定葡萄糖濃度，因此，近年來引起了人們的重視。
如上所述，從一系列酶促反應結果生成的電子傳遞體的還原體在電極上氧化所需要的氧化電流值，可定量測定試樣中的底物。
在試樣中，可含有易氧化物質，當電子傳遞體的還原體在電極上氧化時，同時因氧化而產生氧化電流，使測定結果產生正誤差。在底物濃度高的情況下，在氧化電流值上更可以見到統計上的離散性。
為了解決這個問題，本發明者提出從一系列酶促反應還原所得電子傳遞體的氧化體在作用極上還原所得的還原電流值來測定底物的方法。用這個方法，即使含有易氧化物質，對測定結果也無不良影響。
然而，用作用極和對極的二電極式測定還原電流值的時候，對應於在作用極上的還原反應，必須在對極上存在還原體。但是，在底物濃度低的時候，電子傳遞體的還原體不足。其結果，在對極上的氧化反應成為快速過程，對所得的還原電流值產生不良影響。
發明的概述本發明的目的在於提供可克服上述不足之處、高精度地定量測定試樣中的底物濃度的生物測定器。
本發明的目的還在於提供用這種生物測定器快速、簡便、高精度地定量測定底物的方法。
本發明提供的生物測定器具有絕緣基板、含在上述基板上形成的作用極和對極的電極系，及在上述電極系上形成的至少含還原酶和電子傳遞體的試藥層，上述對極至少含一種還原型的氧化還原化合物或可電解氧化的金屬。
本發明還提供用上述生物測定器定量測定底物的方法，包括以下步驟在試藥層上添加試樣，使底物與酶反應；將上述步驟中還原所得的電子傳遞體還原的電位外加在作用極上；及測定在上述作用極和對極之間流動的電流值。
在本發明的優選實施方案中，上述對極含二茂鐵或其衍生物作為氧化還原化合物。
在本發明的其它優選實施方案中，上述對極含銀或銅作為可電解氧化的金屬。
在本發明的進一步優選實施方案中，上述對極由可電解氧化的金屬和碳的混合物構成。
附圖的簡單說明
圖1本發明的一個實施例中除去試藥層後的葡萄糖測定器的分解立體圖。
圖2為除去隔板和蓋板後同一葡萄糖測定器主要部分的縱剖面圖。
發明的詳細描述如上所述，本發明的電位定量法先在試藥層中添加試樣，使底物與酶反應。與此酶促反應相伴隨的是，試藥層中的電子傳遞體與底物濃度相對應地被還原。然後，不通過酶促反應進行還原，而是將還原反應系統中殘存電子傳遞體的電位外加到作用極上，通過測定其還原電流而求出底物的濃度。
將試藥層中電子傳遞體調節在一定量，則上述還原電流對應於試樣中的底物濃度。因此，預先測定含一定量底物標準液的還原電流值作成標準曲線，根據此標準曲線可求出試樣中的底物濃度。
這樣，本發明從還原電流進行底物定量，因此，即使試樣中混入易氧化物質，也不會受其影響。
而且，由於對極上含有還原型的氧化還原化合物或可電解氧化的金屬，因此，在試樣中底物濃度低、從而酶促反應結果產生的還原型電子傳遞體少的情況下，在作用極測定還原電流時，對極上的氧化反應也不是規定速度的過程。
本發明的生物測定器是改良對極的產物，因此不必擔心對測定器保存特性的影響。在試藥層上添加氧化還原化合物時，氧化還原化合物對測定器的保存特性有影響，因此，事先調節其影響是不可缺少的。而且，如果採用在對極上含氧化還原化合物和可電解氧化的金屬的本發明，與在試藥層上添加相比，其優點是量多，可與多量的底物相適應。
另一方面，可電解氧化的金屬以銀或銅為佳。也可用鐵和鉛等。
且，上述金屬由於可將其粉末與粘合劑一起製成糊狀等，直接印刷在基板上製成對極，所以可簡化測定器的製作步驟。
從碳粉和粘合劑與上述金屬粉末混合而成的混合物製成對極，可降低製造成本，是令人滿意的。
另外，較好的是，將電極系表面用親水性高分子層被覆，使在基板上形成的電極系的表面不接觸酶和電子傳遞體等，或電極系表面不吸附蛋白質。
形成這種層的親水性高分子，可用聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、多聚賴氨酸等多胺基酸，磺化聚苯乙烯、明膠及其衍生物，丙烯酸或其鹽的聚合物，甲基丙烯酸或其鹽的聚合物，澱粉及其衍生物，馬來酸酐或其鹽的聚合物；羧甲基纖維素、羥丙基纖維素、甲基纖維素、乙基纖維素、羥乙基纖維素、乙基羥乙基纖維素、羧甲基乙基纖維素等纖維素衍生物。其中，以羧甲基纖維素、羥乙基纖維素、羥丙基纖維素、甲基纖維素、乙基纖維素、乙基羥乙基纖維素、羧甲基乙基纖維素為佳。
試藥層中所含的電子傳遞體可用氰鐵酸鉀(フエリシアン化カリウム)、對苯醌、吩嗪甲硫酸酯、亞甲藍、二茂鐵衍生物等。
氧化還原酶可用葡萄糖氧化酶、葡萄糖脫氫酶、醇氧化酶、乳酸氧化酶、乳酸脫氫酶、果糖脫氫酶、尿酸酶、膽甾醇氧化酶、膽甾醇酯化酶，黃嘌呤氧化酶、胺基酸氧化酶等。
上述酶可以幾個組合在一起，如葡萄糖氧化酶和轉化酶、葡萄糖氧化酶和轉化酶及變旋酶以及果糖脫氫酶和轉化酶等。
上述酶和電子傳遞體可溶於試樣液，也可將試藥層固定在基板上等而不溶於試樣液中。在將酶和電子傳遞體固定的情況下，試藥層以含有上述親水性高分子為佳。
而且，試藥層可含有pH緩衝劑。此pH緩衝劑可有磷酸二氫鉀-磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀-磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉-磷酸氫二鉀、磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉、檸檬酸-磷酸氫二鈉、檸檬酸-磷酸氫二鉀、檸檬酸-檸檬酸三鈉、檸檬酸-檸檬酸三鉀、檸檬酸二氫鉀-氫氧化鈉、檸檬酸二氫鈉-氫氧化鈉、馬來酸氫鈉-氫氧化鈉、富馬酸氫鉀-氫氧化鈉、琥珀酸-四硼酸鈉、馬來酸-三(羥甲基)氨基甲烷、三(羥甲基)氨基甲烷-三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸鹽、〔N-(2-羥乙基)哌嗪-N＇-2-乙磺酸〕-氫氧化鈉、〔N-三(羥甲基)甲基-2-氨基乙磺酸〕-氫氧化鈉、〔哌嗪-N,N』-二(2-乙磺酸)〕-氫氧化鈉。
此外，為了順利供給試樣溶液，也可在試藥層上形成卵磷脂層。
以下用實施例說明本發明。
以下的實施例中，作用極、對極和絕緣層的印刷方式例示於具體的實施例，但並不限於實施例的內容。施加於電極的外加電壓也不限於實施例的內容。
圖1是二電極式葡萄糖測定器除去試藥層後的分解立體圖。在聚苯乙烯對苯二酸酯形成的絕緣基板1上，用篩網印刷法印刷銀糊，形成導線2、3。然後，將含樹脂粘合劑的導電性碳糊印刷到基板1上，形成作用極4。此作用極4與導線2接觸。再在基板1上印刷絕緣糊形成絕緣層6。絕緣層6覆蓋在作用極4的外周部，由此使作用極4的露出部分的面積保持一定。然後，將樹脂粘合劑與含氧化還原化合物或可電解氧化的金屬的導電性碳糊或將含樹脂粘合劑的銀、銅等的糊狀物與導線3接觸，進行印刷，形成環狀對極5。
將此絕緣基板1與具有氣孔11的蓋板9和隔板10保持如圖1中點劃線所示的位置關係，粘合，製成生物測定器。在隔板10上設置形成基板與蓋板間試樣液供給路的縫隙13。12相當於此試樣液供給路的開口部。
圖2為除去隔板和蓋板後本發明的生物測定器主要部分的縱剖面圖。
在如圖1所示形成電極系的電絕緣性基板1上，形成含酶類和電子傳遞體的試藥層7，在試藥層7上形成卵磷脂層8。
試藥層7以在電極系上形成的為佳，但在電極系附近如在蓋板側形成、露出於試樣液供給路也可。
實施例1如圖1所示，在基板1上，用樹脂粘合劑與氧化還原化合物-含二茂鐵的導電性碳糊，形成對極，製成含此對極的電極系。
在此電極繫上，滴加葡萄糖氧化酶(ECl.1.3.4，以下簡稱GOD)和氰鐵酸鉀的混合水溶液，乾燥，形成試藥層7。然後，在試藥層7上滴加卵磷脂的甲苯溶液，乾燥，形成卵磷脂層8。
接著，將基板1與蓋板9和隔板10保持如圖1中點劃線所示的位置關係，粘合，製成葡萄糖測定器。
從試樣液供給路的開口部12供給葡萄糖標準水溶液3μl。試樣液到達氣孔11部分，電極系上的試藥層7溶解。試藥層7溶解後，試樣液中的葡萄糖被GOD氧化成葡萄糖酸內酯。通過該酶促反應，氰鐵酸離子還原成氰亞鐵酸離子。
供給試樣液一定時間後，以對極5為基準，在作用極4上外加1.0V的電壓。通過外加此電壓，在作用極上，未還原的殘存氰鐵酸鉀發生還原反應。然後，在對極上，發生對極中所含二茂鐵的氧化反應，二茂鐵成為二茂鐵離子。然後，測定外加電壓5秒後的還原電流值。
所得的電流值隨著葡萄糖濃度的增加而減少。總之，由於對極上含二茂鐵，反應系統中還原體充分存在，所得的電流值顯示出取決於作用極上氰鐵酸離子的還原反應。所得的電流應答值的測定精度高。
實施例2在與實施例1同樣的電極上滴加羧甲基纖維素(以下簡稱CMC)水溶液，乾燥，形成CMC層。在此CMC層上，與實施例1同樣地形成試藥層和卵磷脂層。
然後，與實施例1同樣地製作葡萄糖測定器，測定對葡萄糖標準液的應答，與實施例1同樣地得到離散度小的應答特性。
實施例3除了用含已知量抗壞血酸的葡萄糖水溶液之外，與實施例2同樣地測定電流應答值。
結果，得到與用不含抗壞血酸的葡萄糖標準水溶液的實施例2同樣的應答特性。
比較例1用與實施例3同樣的測定器和含抗壞血酸的葡萄糖標準水溶液，在以對極為基準的作用極上外加0.5V電壓，測定5秒鐘後的氧化電流值。
結果，隨著標準水溶液中抗壞血酸量的增加，電流應答值也增加。
實施例4除了用乙烯基二茂鐵作為氧化還原化合物外，與實施例2同樣地製作葡萄糖測定器，測定對葡萄糖標準水溶液的應答，得到與實施例2同樣的應答特性。
實施例5除了用銀糊形成圖1的對極5之外，與實施例1同樣地製作葡萄糖測定器。
從試樣液供給路的開口部12供給葡萄糖標準水溶液3μl。試樣液到達氣孔11部分，電極系上的試藥層7溶解。試藥層7溶解後，試樣液中的葡萄糖被GOD氧化成葡萄糖酸內酯。通過該酶促反應，氰鐵酸離子還原成氰亞鐵酸離子。
供給試樣液一定時間後，以對極5為基準，在作用極4上外加0.8V的電壓。通過外加此電壓，在作用極上，通過酶促反應未還原的氰鐵酸鉀發生還原反應。然後，對極的銀被氧化成銀離子。然後，測定外加電壓5秒後的還原電流值。所得的電流值隨著葡萄糖濃度的增加而減少。總之，因為用銀製作對極，使反應系統中還原體充分存在，所得的電流值顯示出取決於作用極上氰鐵酸離子的還原反應。所得的電流應答值的測定精度高。
實施例6除了用銅糊形成對極5之外，與實施例5同樣地製作葡萄糖測定器。測定對葡萄糖標準液的應答，得到與實施例5同樣的應答特性。
實施例7除了用銀和碳的混合糊形成圖1的對極5之外，與實施例5同樣地製作葡萄糖測定器。測定對葡萄糖標準液的應答，得到與實施例5同樣應答特性。
實施例8除了用含已知量抗壞血酸的葡萄糖水溶液作試樣液之外，與實施例5同樣地測定電流應答值。
結果，得到與用不含抗壞血酸的葡萄糖標準水溶液的實施例5同樣的應答特性。
比較例2用與實施例5同樣的測定器和含抗壞血酸的葡萄糖標準水溶液，以對極為基準，在作用極上外加0.5V電壓，測定5秒鐘後的電流值。
結果，隨著標準水溶液中抗壞血酸量的增加，電流應答值也增加。
權利要求
1．生物測定器，其特徵在於具有絕緣基板、含在上述基板上形成的作用極和對極的電極系，及在上述電極系上或其附近形成的至少含還原酶和電子傳遞體的試藥層，所述對極至少含一種還原型的氧化還原化合物或可電解氧化的金屬。
2．如權利要求1所述的生物測定器，其中所述氧化還原化合物為二茂鐵或其衍生物。
3．如權利要求1所述的生物測定器，其中所述對極由至少一種可電解氧化的金屬和碳的混合物製成。
4．如權利要求1所述的生物測定器，其中所述可電解氧化的金屬為銀或銅。
5．如權利要求1所述的生物測定器，其中所述試藥層還含有親水性高分子。
6．用生物測定器定量測定底物的方法，該生物測定器具有絕緣基板、在所述基板上形成的作用極和含至少一種還原型氧化還原化合物或可電解氧化的金屬對極組成的電極系、在所述電極系上或其附近形成的至少含氧化還原酶和電子傳遞體的試藥層，該方法包括以下步驟在所述試藥層上添加試樣，使底物與酶反應；將使上述步驟中還原所得的電子傳遞體還原的電位外加在作用極上；及測定在所述對極和作用極之間的電流值。
全文摘要
本發明公開了底物定量測定法中所用的生物測定器,所述底物定量法由以下步驟組成:在電子傳遞體的氧化體存在下,將試樣中的底物與對所述底物起特異性反應的氧化還原酶進行反應;將使上述步驟中還原所得的電子傳遞體還原的電位外加在作用極上;及測定在所述作用極和對極之間的電流值。該生物測定器具有絕緣基板、含在所述基板上形成的作用極和對極的電極系,及在所述電極系上或其附近形成的至少含氧化還原酶和電子傳遞體的試藥層,所述對極含至少一種還原型氧化還原化合物或可電解氧化的金屬。
文檔編號G01N33/543GK1220394SQ98119449
公開日1999年6月23日 申請日期1998年9月29日 優先權日1997年9月29日
發明者池田信, 吉岡俊彥, 南海史朗 申請人:松下電器產業株式會社