用於自身免疫性病症的治療組合物的製作方法
2023-08-03 05:01:46 5
專利名稱：用於自身免疫性病症的治療組合物的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種治療組合物。更詳細地講，本發明涉及一種用於治療、改善或預防自身免疫性病症的治療組合物。
自身免疫性以某種程度存在於每個人且通常是無害的。然而，自身免疫性可引起寬範圍的人類疾病，總稱為自身免疫性疾病、障礙或病症。當個體中存在誤導的免疫反應，其中免疫系統攻擊人體本身而不是異物、外來生物體或其它外來化合物或部分時，有從良性自身免疫到致病性自身免疫的發展，這時會發生自身免疫性病症。這個發展由遺傳影響和由環境觸發器來決定。
免疫反應幾乎總是以炎症為特徵，這表明潛在的修復過程。然而，在自身免疫性病症或疾病的情況下，炎症可以是引起組織損傷的慢性炎症。例如，在類風溼性關節炎中慢性炎症引起對關節和對軟骨的特徵性損傷。這些疾病準確的起因和病理生理學過程並沒有完全知道。
當前對自身免疫性病症的治療通常關注疼痛的處理、給予抗炎藥物、替代損失的物質(例如，糖尿病中胰島素的供應)或給予一種或多種免疫抑制劑。這些治療通常是全身性的而不是局部的，且像這樣的治療可在身體其他部位引起不良反應。
當這些方法可暫時減輕病症或減少它們的發展時，他們通常的作用為直接抵抗實際的物理狀態或效果而不是消除、減少或改變病症的根本原因或病原學。例如，已知許多自身免疫反應涉及T-細胞介導的反應，因此提供對作用於該反應的自身免疫性病症的治療是有益的。
自身免疫由自身抗體(直接抗身體的抗體)和與宿主抗原有反應的T-細胞的存在來證明。自身免疫性病症可以是全身性的，例如全身性紅斑狼瘡，或是器官特異性的，例如甲狀腺炎。自身免疫性病症的其他實例包括斯耶格倫(Sjgren)症候群、橋本(Hashimoto)甲狀腺炎、重症肌無力、類風溼性關節炎、青少年(I型)糖尿病、多肌炎、硬皮病、阿狄森(Addison)病、白斑、惡性貧血、腎小球腎炎和肺纖維化。
本發明的目的是提供一種治療組合物，其通過作用於病症的根本原因或各種原因介導對自身免疫性病症的效果。然而，本發明還可有對病症物理狀態或效果的作用。
相應地，本發明提供了一種用於自身免疫性病症的治療組合物，該組合物包含一定劑量的酶和免疫原，該劑量提供有治療需要的個體有益效果。
最好是本發明的組合物介導作用於或影響自身免疫性病症根本原因的反應。例如，其可用於下調T-細胞介導的反應。不希望受理論的束縛，本發明人相信本發明的免疫原通過經由朗氏細胞或樹突細胞或由胸腺介導的作用方式間接地減少T-細胞的活性，該作用重新引導對抗原敏感的淋巴細胞趨向調節功能(如IL-10的生成)或重新引導細胞活性離開免疫原的靶位。
本文使用的術語「免疫原」將定義任何能誘導免疫反應的物質。無意用這個術語限制免疫原的任何性質例如分子量。
在以下描述中，將特別結合類風溼性關節炎的治療來描述本發明。然而，發現本發明在其他疾病的治療中通過選擇合適的免疫原有同等的效用。例如，多發性硬化症可以通過使用髓磷脂鹼性蛋白作為免疫原來治療，甲狀腺炎或Hashimoto氏病可以使用甲狀腺蛋白作為免疫原來治療，和糖尿病可以使用胰島素或β-細胞蛋白作為免疫原來治療。此外，可以使用免疫原的組合或混合物，尤其是在涉及或與一種或多種免疫原相關的病症中。
優選在組合物中使用的酶為肝酶或粘多糖酶。更優選酶為葡糖醛酸糖苷酶，且最優選為β-葡糖醛酸糖苷酶。理想地是，β-葡糖醛酸糖苷酶為β-D-葡糖醛酸糖苷葡糖醛酸糖苷水解酶(glucuronosideglucuronosohydrolase)(註冊號EC 3.2.1.31)。發現酶的來源對組合物的活性沒有產生差異，條件是該酶不含防腐劑或山梨醇。因此，有必要純化酶以使它能在本發明的組合物中使用。可以使用任何純化方法，但發現使用凝膠過濾層析或切向流過濾是方便的。
優選酶純化至濃度至少為20,000Fishman單位/mg，且在組合物中存在的濃度為200-10,000單位/ml，理想地為1,000-5,000單位/ml。
發現其它蛋白的汙染，即使是非常低的水平都會影響酶的活性。因此優選組合物中存在穩定劑和/或活化劑。優選穩定劑和/或活化劑為惰性蛋白質部分，例如硫酸魚精蛋白或1，10二氨基癸烷。優選穩定劑和/或活化劑存在的濃度最高達20mg/l。當穩定劑和/或活化劑為硫酸魚精蛋白時，優選存在的濃度為1-10mg/l，更優選為3-9mg/l且理想地為約6mg/L(等於6μg/ml)。
組合物還可以包含羥基部分。優選所述羥基部分由含有至少兩個羥基部分的多元醇提供，且更優選由含有至少兩個羥基部分的糖或二元醇提供。優選的羥基部分來源為1，3環己二醇。優選1，3環己二醇存在的濃度最高達20μg/l，更優選1，3環己二醇存在的濃度為0.1-10μg/l，且理想地為1μg/l。發現1，3環己二醇的立體化學對本發明沒有不利影響，因此可以使用順式、反式或外消旋混合物。
優選組合物被緩衝至中性或酸性pH。更優選組合物被緩衝至5-6.5的pH，且理想地是組合物被緩衝至pH 5.9。
在本發明的優選實施方案中，其中組合物用於治療類風溼性關節炎，優選的免疫原為膠原或其片段、衍生物、綴合物、類似物或其它產物，或其具有膠原-型結構或活性，無論是天然、合成或修飾來源均可。下文使用的術語「膠原」將包括如上所述的這類膠原產物。優選膠原以溶液存在。膠原可以來自任何來源，但優選膠原不含防腐劑、山梨醇或其它添加劑。因此，有必要純化膠原使其能在本發明的組合物中使用。可以使用任何純化方法，但發現使用凝膠過濾層析或切向流過濾是方便的。
存在於組合物中的膠原濃度可以為10-1×1015分子/ml。更優選存在於組合物中的膠原濃度可以為1×104-1×1013分子/ml。通常，存在於組合物中的膠原濃度可根據需要的劑量而變化，因此預期有三個範圍膠原劑量的組合物可用，這些劑量濃度將由高到低變化。高濃度範圍的組合物將以1×1010-1×1015分子/ml階數的濃度含有膠原，且更優選含有約1×1012-1×1013分子/ml。理想地是高濃度組合物將含有2.5×1013分子/ml。對於中等濃度範圍的組合物，優選膠原存在的濃度階數為1×109-1×1013分子/ml，且更優選含有約1×1010-1×1012分子/ml。理想地是中等濃度的組合物將含有2.5×1011分子/ml。對於低濃度範圍的組合物，優選膠原存在的濃度階數為1×102-1×108分子/ml，且更優選含有約1×104-1×107分子/ml。理想地是中等濃度的組合物含有2.5×105分子/ml。
優選組合物還包含糖胺聚糖或其混合物或組合。可以使用任何糖胺聚糖但優選糖胺聚糖選自透明質酸鹽(D葡萄糖醛酸N乙醯基D葡萄糖胺)、硫酸軟骨素(1，3，4或6硫酸D葡萄糖醛酸N乙醯基D半乳糖胺)、硫酸皮膚素(D葡萄糖醛酸或L艾杜糖醛酸N乙醯基D半乳糖胺)、硫酸角質素(硫酸D半乳糖N乙醯基D葡萄糖胺)和硫酸乙醯肝素(D葡萄糖醛酸或L艾杜糖醛酸N乙醯基D葡萄糖胺)。最優選的糖胺聚糖為6-硫酸-軟骨素。
優選糖胺聚糖以0.1-1.0mg/ml的濃度存在於組合物，最優選0.5mg/ml。理想地是糖胺聚糖不含防腐劑或糖，且為了保證這一點有必要在使用前純化糖胺聚糖。方便的純化方法包括凝膠過濾層析或切向流過濾。
本發明的組合物可以任何常規方式全身或局部給藥，例如經口、胃腸外、皮內、局部、直腸、鼻途徑，通過局部注射或通過經皮輸注。目前優選組合物通過皮下注射給藥，優選通過皮內注射，或以任何形式的經皮輸注。不需要將組合物局部給予自身免疫性區域，尤其是在類風溼性關節炎中，但在其他病症中可優選這樣做以便將禁忌症減至最少或促進在具體位置的效果。
在一個優選的實施方案中，組合物於給藥前短時間內製備或甚至給藥前立即製備。在該實施方案中，組合物可以兩種製劑提供，一種酶製劑和一種膠原製劑，於給藥前彼此引入並混合。在該實施方案中，酶溶液含有穩定化酶、羥基部分且該酶為緩衝溶液；其中所有組分按如上所述存在。膠原溶液含有膠原和糖胺聚糖，按如上所述緩衝。優選給藥的組合物含有膠原溶液多於酶溶液，更優選至少兩倍量的膠原溶液(按體積計)，且理想地為約4份膠原溶液對一份酶溶液(按體積計)。
相應地，本發明也提供一種用於製備本發明組合物的試劑盒，該試劑盒包含酶溶液和免疫原溶液，這兩種溶液在給予有治療需要的個體前彼此引入並混合。這種試劑盒可以多室或多管分配器例如注射器的形式存在。
本發明的組合物可以在形成和使用期間保存。例如組合物可以冷凍、乾燥、冷凍乾燥、低壓凍幹、封囊或進一步用合適選擇的對組合物體內活性有很少或沒有不利效應的防腐劑保存，或用任何藥學中常用或已知的其它保藏技術來保存。當組合物為乾燥、冷凍乾燥或其他方式形成的固體時，該組合物可以形成片劑、膠囊劑、錠劑或其它固體劑型，用於口服給藥或重新組成以溶液或液體形式來使用，例如用於注射。當組合物被冷凍時，可很方便地將組合物或其組分以劑量單位量冷凍，任選在注射器中，以便於個體或醫學從業者使用。
可用任何藥學上可接受的溶劑製備液體形式的組合物。類似地，本發明組合物可使用常用粘合劑、賦形劑、溶媒和其它標準配藥添加劑。
本發明也提供了一種治療或預防自身免疫性病症的方法，該方法包括給予有治療需要的個體治療有效量的組合物，該組合物包含酶和免疫原。
本發明還提供了一種治療、改善或預防類風溼性關節炎的方法，該方法包括給予有治療需要的個體治療有效量的組合物，該組合物包含β-葡糖醛酸糖苷酶和膠原。
本發明也提供了治療有效量的酶和免疫原在製備用於治療或預防自身免疫性病症的藥物中的用途。
本發明的再一方面也提供了β-葡糖醛酸糖苷酶和膠原在製備用於治療類風溼性關節炎的藥物中的用途。
在最後一個實施方案中，本發明提供了一種用於治療類風溼性關節炎的組合物，該組合物包含0.5-2.5mg/mlβ-葡糖醛酸糖苷酶、6μg/ml硫酸魚精蛋白、1μg/m1，3環己二醇和0.5mg/ml硫酸軟骨素，緩衝至pH 5.9並還包含2.5×1013、2.5×1011或2.5×105分子/ml膠原。
現在將通過實施例並結合以下附圖描述本發明的實施方案，其中
圖1為顯示對照組(B組)關節炎病程的圖。
圖2為顯示A組和B組疾病病程隨時間變化比較的圖。
圖3顯示了在第29天A、B和C各個實驗組的關節炎嚴重程度。
圖4為顯示B組和C組的疾病病程隨時間變化比較的圖。
圖5顯示了在第52天A、B和C各個實驗組的關節炎嚴重程度，且表明高劑量治療顯著減少了峰關節炎評分。
實施例1β-葡糖醛酸糖苷酶(EC 3.2.1.31)(從海產軟體動物鮑屬midae(Haliotis midae)(南非鮑魚)獲得)用凝膠過濾層析純化以除去存在的任何防腐劑或山梨醇。
將純化的β-葡糖醛酸糖苷酶加入到pH 5.9的緩衝溶液中得到最終濃度1.5mg/ml。加入1，3環己二醇(Sigma，Poole，Dorset，UK)，得到最終濃度1μg/ml。攪拌下加入硫酸魚精蛋白BP以防止沉澱，得到最終濃度6μg/ml。
天然II型膠原單獨用凝膠過濾層析純化除去存在的任何防腐劑或山梨醇。
將純化的膠原溶於溶液中並緩衝至pH 5.9，得到最終膠原濃度2.5×1013。向該溶液中加入硫酸軟骨素得到最終濃度0.5mg/ml。
將0.01ml酶溶液加入到0.04ml膠原溶液中並混合。將0.05ml一次性大劑量濃注(bolus)組合物在小鼠關節炎模型中皮內注射。測量爪的重量和體積，與僅接受溶媒、僅接受膠原或僅接受β-葡糖醛酸糖苷酶的對照小鼠對比。
實施例2β-葡糖醛酸糖苷酶/II型膠原在膠原誘導的DBA/1小鼠關節炎中的作用地點測試樣品由McEwen Laboratories Ltd.Pangbourne，Berkshire，England製備。使用英國布里斯托大學醫學科學學院，病理學和微生物學系的測試設備。
研究方案研究方案如下研究開始日期 2004年2月2日測定完成日期 2004年3月24日研究目的本研究設計用於測定兩個測試劑量的II型膠原與β-葡糖醛酸糖苷酶聯合使用對膠原誘導的關節炎發生率及嚴重程度的影響。選擇雄性DBA/1小鼠用於研究，並用II型膠原(小雞)的完全弗氏佐劑溶液作為引發刺激物引發關節炎。II型膠原和β-葡糖醛酸糖苷酶作為獨立的樣品提供治療。將樣品於4℃保存並於注射前立即混合。在誘導後第10天以單劑量皮下注射到頸背進行治療。從第17天到第52天每周兩次通過觀察關節發紅和腫脹來給動物的臨床關節炎記分。研究中心是盲的。
材料與方法小鼠6周齡的三十隻雄性DBA/1小鼠從Harlan Olac獲得。將動物在Bristol大學醫學科學學院的動物房裡供養，直至研究開始前達到12周齡。第0天所有的小鼠通過在尾部基底注射給予100μg小雞II型膠原的完全弗氏佐劑乳化液(CII/CFA)。於第10天通過皮下注射到頸背進行治療，然後從第17天到第52天每周兩次給臨床關節腫脹記分。
治療β-葡糖醛酸糖苷酶(E.C.3.2.1.31)(從海產軟體動物鮑屬midae(Haliotis midae)獲得)以凍乾粉提供。該粉末經過用大小排阻(凝膠過濾)層析進一步純化(以除去冷凍乾燥過程中或作為穩定劑使用的任何山梨醇和鹽)，並用pH 5.9的緩衝液稀釋成2mg/ml的濃度。向該溶液中加入1×10-8mg/ml的1，3-環己二醇和6×10-5mg/ml的硫酸魚精蛋白。然後將該溶液無菌填充至管形瓶中，並於2℃至8℃保存直至使用。
II型膠原(從小雞軟骨獲得)以凍乾粉末提供，並按如上所述進行凝膠過濾層析來進一步純化。然後將該粉末用含有0.5mg/ml硫酸軟骨素(由鯊魚軟骨純化得到)的pH 5.9的緩衝液稀釋。使用兩種代表約50ng/ml和50fg/ml濃度的稀釋液，分別將它們無菌分配到管形瓶中，並於2℃至8℃保存直至使用。
由McEwen Laboratories Ltd提供治療並標記如下1.酶A...............如上所述的β-葡糖醛酸糖苷酶溶液2.CII A...............如上所述50fg/ml的膠原
3.酶Bg...............緩衝液對照4.CII B...............緩衝液對照5.酶C...............如上所述的β-葡糖醛酸糖苷酶溶液6.CII C...............如上所述50ng/ml的膠原在生命階段結束前樣品的鑑別由McEwen Laboratories記錄但不向Bristol大學公開。在給每隻動物注射200μl前10分鐘內，將A、B和C樣品在1ml的注射器中混合。將樣品於4℃保存直至使用，並在從冰箱取出後直到注射點都放在冰上保存。
實驗組(n＝10/組)A組第0天CII/CFA，第10天用混合物A治療B組第0天CII/CFA，第10天用混合物B治療C組第0天CII/CFA，第10天用混合物C治療終點臨床記分關節腫脹。從第17天到第52天每周檢查動物兩次。在每次檢查時，根據(0＝正常；1＝整個關節輕微腫脹或個別趾炎症；2＝整個關節中等腫脹並有多於一個趾發紅和/或炎症；3＝中等關節炎症且發紅擴展到多個趾，有一些骨改變體徵；4＝嚴重關節炎症且發紅擴展到多個趾，有明顯的骨改變體徵。)對四肢的每一個都給出評分。
結果樣品解碼。屍體剖檢後將治療樣品的鑑別向研究中心報告。
在這個模型中對照組(B)中疾病具有預期的發生率和嚴重程度。在檢查的第一天，疾病以非常低的水平存在，但發生率和嚴重程度從第17天直至存活階段結束髮生提高(圖1)。這個發展與預期的該模型關節炎病程一致。對照組的整體疾病水平與在該檢測設備進行的許多相似實驗比較是嚴重的。
在低劑量治療組中，與對照組相比疾病發生有所延遲(圖2)。這表明單點(single point)T檢驗揭示A組和B組的關節炎嚴重程度有顯著性差異，如在第29天測試那樣(圖3)。其後，A組的疾病嚴重程度增加。儘管與B組對比其在整個實驗期間保持減少，但總體曲線表明第29天後沒有顯著治療效果。
在高劑量治療組中，從第25天到實驗結束疾病低於B組(圖4)。C組的疾病沒有遵循該模型關節炎的正常病程。對於大多數試驗感染疾病的動物比正常動物數量更低，且該組的疾病嚴重程度整體大大低於預期。除了兩隻動物以外，C組的疾病嚴重程度保持極低。這兩隻動物缺乏保護表明C組數據集的方差相對比較高。然而，在第42、46和52天對C組和B組比較表明，關節炎的嚴重程度顯著更低(Mann-Whitney U檢驗)。第52天的數據(因為該日疾病記分最高)如圖5顯示。此外，用KruskaL Wallis後檢驗(post-test)法進行Annova分析表明C組的疾病水平與B組比較有總體的顯著性差異(p＝0.0196)。
結論在實驗中兩個治療劑量均改變了關節炎病程。低劑量治療中更不明顯的減少(其表現為疾病發展的延遲)在實驗中是顯著的。高劑量治療中觀察到的疾病病程改變提示具有有效的抗關節炎作用。當在相似的實驗過程中給予確定的抗關節炎藥物時，C組中疾病減少的水平在可見範圍內。單一治療後觀察到這個保護水平的事實是令人高度鼓舞的。當疾病發展時，低劑量治療水平的提高可通過給予更多劑量來實現。
權利要求
1.一種用於治療自身免疫性病症的治療組合物，所述組合物包含一定劑量的酶和免疫原，該劑量提供有治療需要的個體有益的效果。
2.權利要求1的組合物，其中所述酶為肝酶或粘多糖酶。
3.權利要求1或權利要求2的組合物，其中所述酶為β-葡糖醛酸糖苷酶。
4.權利要求3的組合物，其中所述β-葡糖醛酸糖苷酶為β-D-葡糖醛酸糖苷葡糖醛酸糖苷水解酶(註冊號EC 3.2.1.31)。
5.前述權利要求中任一項的組合物，其中所述酶存在的濃度為200-10,000 Fishman單位/ml。
6.權利要求5的組合物，其中所述酶存在的濃度為1,000-5,000單位/ml。
7.權利要求5的組合物，其中所述酶存在的濃度為0.5-2.5mg/ml。
8.前述權利要求中任一項的組合物，所述組合物還包含穩定劑和/或活化劑。
9.權利要求8的組合物，其中所述穩定劑和/或活化劑為惰性蛋白質部分。
10.權利要求8或權利要求9的組合物，其中所述穩定劑和/或活化劑為硫酸魚精蛋白或1，10二氨基癸烷。
11.權利要求8-10中任一項的組合物，其中所述穩定劑和/或活化劑存在的濃度最高達20mg/l。
12.權利要求8-10中任一項的組合物，其中所述穩定劑和/或活化劑存在的濃度為3-9mg/l。
13.前述權利要求中任一項的組合物，所述組合物還包含羥基部分。
14.權利要求13的組合物，其中所述羥基部分由糖或二元醇提供。
15.權利要求13或權利要求14的組合物，其中所述羥基部分由1，3環己二醇提供。
16.權利要求13-15中任一項的組合物，其中所述羥基部分存在的濃度最高達20μg/l。
17.前述權利要求中任一項的組合物，所述組合物被緩衝至酸性或中性pH。
18.權利要求17的組合物，所述組合物被緩衝至pH為5-6。
19.前述權利要求中任一項的組合物，所述組合物還包含膠原。
20.權利要求19的組合物，其中所述膠原存在的濃度為10-1×1015分子/ml。
21.權利要求19的組合物，其中所述膠原存在的濃度為1×104-1×1014分子/ml。
22.前述權利要求中任一項的組合物，所述組合物還包含糖胺聚糖。
23.權利要求22的組合物，其中所述糖胺聚糖選自透明質酸鹽(D葡萄糖醛酸N乙醯基D葡萄糖胺)、硫酸軟骨素(4或6硫酸D葡萄糖醛酸N乙醯基D半乳糖胺)、硫酸皮膚素(D葡萄糖醛酸或L艾杜糖醛酸N乙醯基D半乳糖胺)、硫酸角質素(硫酸D半乳糖N乙醯基D葡萄糖胺)和硫酸乙醯肝素(D葡萄糖醛酸或L艾杜糖醛酸N乙醯基D葡萄糖胺)。
24.權利要求22或權利要求23的組合物，其中所述糖胺聚糖為6-硫酸-軟骨素。
25.權利要求22-24中任一項的組合物，其中所述糖胺聚糖存在的濃度為0.1-1.0mg/ml。
26.權利要求22-24中任一項的組合物，其中所述糖胺聚糖存在的濃度為0.5mg/ml。
27.前述權利要求中任一項的組合物，所述組合物為適用於經皮輸注或皮內注射的製劑。
28.前述權利要求中任一項的組合物，所述組合物於給藥前短時間內製備或甚至於給藥前立即製備。
29.一種用於製備前述權利要求中任一項組合物的試劑盒，所述試劑盒包含酶溶液和免疫原溶液，這兩種溶液在給予有治療需要的個體前彼此引入並混合。
30.一種治療或預防自身免疫性病症的方法，所述方法包括給予有治療需要的個體治療有效量的組合物，該組合物包含酶和免疫原。
31.一種治療、改善或預防類風溼性關節炎的方法，所述方法包括給予有治療需要的個體治療有效量的組合物，該組合物包含β-葡糖醛酸糖苷酶和膠原。
32.治療有效量的酶和免疫原在製備用於治療或預防自身免疫性病症的藥物中的用途。
33.β-葡糖醛酸糖苷酶和膠原在製備用於治療類風溼性關節炎的藥物中的用途。
34.一種用於治療類風溼性關節炎的組合物，所述組合物包含1,000-5,000 Fishman單位/ml的β-葡糖醛酸糖苷酶、6μg/mL硫酸魚精蛋白、1μg/mL 1，3環己二醇和0.5mg/mL硫酸軟骨素以及濃度選自2.5×1012、2.5×1010和2.5×104分子/ml的膠原，該組合物被緩衝至pH 5.9。
35.一種組合物，所述組合物基本上如上文中所述並結合及如實施例1所舉例說明。
全文摘要
描述了一種用於治療、改善或預防自身免疫性病症的治療組合物。該組合物包含適用於治療病症的酶和免疫原。該組合物可以常規方式給藥但優選通過皮內注射給藥。
文檔編號A61P37/00GK1802172SQ200480015651
公開日2006年7月12日 申請日期2004年4月7日 優先權日2003年4月7日
發明者S·麥克尤恩 申請人:埃皮迪姆有限公司