一種抗草甘膦轉基因水稻的製備方法

2023-08-03 04:58:46

一種抗草甘膦轉基因水稻的製備方法
【專利摘要】本發明提供了一種抗草甘膦轉基因水稻的製備方法。該方法是將草甘膦抗性基因通過表達載體轉化農桿菌，利用該農桿菌侵染水稻愈傷組織，將愈傷組織轉移到含草甘膦的選擇培養基上進行篩選，挑選抗性愈傷，經分化、生根、煉苗、移栽，得到對草甘膦具有抗性的轉基因水稻，分子鑑定結果顯示外源基因已穩定地表達。本發明得到的抗草甘膦轉基因水稻除了帶有抗草甘膦除草劑基因外，不含其它篩選標記基因，可作為商品化抗除草劑水稻品種，減少後期流程，加快育種步伐。本發明方法操作簡便、轉基因植株拷貝數低，遺傳性狀穩定，具有良好的市場應用前景。
【專利說明】—種抗草甘膦轉基因水稻的製備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及植物轉基因【技術領域】，具體地，涉及一種抗草甘膦轉基因水稻的製備方法。
【背景技術】
[0002]稻田雜草與水稻在水、肥、生長空間上進行競爭，直接影響水稻的產量。近年來直播和拋秧等栽培方法的使用，使得稻田的雜草危害變得日益嚴重；特別是新型稻田雜草一雜草稻一的出現，給稻田除草提出了難題。另外，隨著農村人口往城市遷移速度的加快，水稻種植的規模化和機械化是一個可預見的趨勢，這使得傳統的人工除草的方法變得不現實。施用除草劑是解決這些新出現的問題的最佳方案之一，因此，抗除草劑水稻將具有非常大的實際需求和市場潛力。
[0003]草甘膦(glyphosate)別名N-(膦羧甲基)甘氨酸；農達(Roundup);鎮草寧；膦甘酸，是一種非選擇性、無殘留、滅生性除草劑，對多年生根雜草非常有效，廣泛用於橡膠、桑、茶、果園及甘蔗地。施用草甘膦後，進入植物體內的草甘膦分子與磷酸烯醇丙酮酸競爭性地結合EPSPS (5-烯醇丙酮醯-莽草酸-3-磷酸合成酶)的活性位點，終止了芳香族胺基酸的合成途徑，造成苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸等胺基酸的缺乏，最終導致植物死亡。利用源於細菌、植物抗性細胞系的Epsps基因可以大大提高植物對草甘膦的耐受性。在轉基因抗除草劑作物的研製中，最負盛名、推廣面積最大、經濟效益最高的是抗草甘膦作物。現已研製成功的抗草甘膦作物有:大豆、玉米、油菜、棉花、甜菜、水稻、菸草、花生、番茄、馬鈴薯、向日葵、胡蘿蔔、洋蔥、春小麥、苜蓿、波菜、南瓜、百脈根等20多種植物。由於抗草甘膦作物在世界各地的推廣與大面 積種植，影響了除草劑新品種的篩選與開發、世界除草劑銷售市場以及食品工業，還引起了作物栽培方式及耕作制度的深刻變革。可以預見其耐性基因工程的市場前景廣闊(Wang X J, Lang Z H, Shan A S，Huang D F.Advances in mechanism ofherbicide inhibiting amino acid biosynthesis and herbicide-tolerant transgenicplants.China Biotechnology，2008，28 (2):110-116.)
[0004]目前的水稻遺傳轉化方法主要是用以潮黴素為篩選劑的農桿菌介導法。例如HieiY,Ohta S，Komori T.Efficient transformation of rice(0ryza sativa L.)mediatedby Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries ofthe T-DNA.[J]PlantJournal, 1994 (6)，通過潮黴素篩選，獲得粳稻「越光」的轉基因植株；沈革志，張建軍，殷麗青，等.根癌農桿菌介導Ds轉座因子的水稻遺傳轉化[J].上海農業學報.1998 (04)；劉巧泉，等.根癌農桿菌介導的水稻高效轉化系統的建立[J].植物生理學報.1998 (03)獲得「中花11」的轉基因植株；孫建昌，馬靜，何玉科，等.農桿菌介導法轉化寧夏水稻的研究[J].寧夏農林科技.2009 (01)，獲得「優育28」的轉基因植株。但是利用該篩選方法培育出的轉基因水稻會帶入多餘的篩選標記基因，給未來的品種應用帶來麻煩。也有少量轉化方法以Bar基因作為篩選標記基因，用除草劑草丁膦作為篩選劑得到抗草丁膦的轉基因水稻植株。例如文獻【黎垣慶，劉剛，嚴文貴，等.轉bar基因水稻除草劑抗性遺傳研究及其應用[J].雜交水稻2000 (01)、查中萍，萬丙良，殷得所，等.農桿菌介導的氮高效利用轉基因水稻植株的獲得[J].湖北農業科學.2011 (24)】。相對於草丁膦，草甘膦具有價格便宜，在土壤中易分解、無殘留，對生態環境的潛在影響小等優點，從而成為了世界範圍內施用面積最大的除草劑，這也為抗草甘膦除草劑作物的培育提出了更高的要求，迫切需要一種大規模商業化生產抗草甘膦水稻的方法。

【發明內容】

[0005]本發明的目的在於提供一種抗草甘膦轉基因水稻的製備方法。
[0006]本發明通過以下技術方案實現:構建包含草甘膦抗性基因Epsps-1和Epsps-2的遺傳轉化載體，通過農桿菌介導的遺傳轉化方法、以草甘膦作為篩選劑，成功地將草甘膦抗性基因轉入到水稻愈傷組織中，並培育出抗草甘膦除草劑的轉基因水稻植株，藉助PCR方法分析鑑定陽性轉基因植株，Southern Blot方法鑑定外源基因拷貝數,試紙條檢測Epsps-1或Epsps-2蛋白表達情況,分子鑑定結果顯示外源基因已穩定地表達。
[0007]本發明提供的抗草 甘膦轉基因水稻的製備方法，包括以下步驟:
[0008](I)將含草甘膦抗性基因的表達載體轉化入農桿菌中；
[0009](2)將步驟(1)的農桿菌菌液侵染水稻的胚性愈傷組織；
[0010](3)將步驟(2)的愈傷組織轉移到添加了草甘膦的選擇培養基上進行篩選，挑選抗性愈傷組織；
[0011](4)將抗性愈傷組織轉入分化培養基分化，將分化形成的再生小苗轉入生根培養基中培養，幼苗生根後煉苗、移栽，得到抗草甘膦轉基因水稻。
[0012]其中，步驟(1)所述的表達載體為pZZOOOll或pZZOOOl3。
[0013]進一步地，所述pZZOOOll載體的構建方法為:合成Epsps-1基因，序列如SEQID N0.1所示；將Epsps-1基因與PU130載體該載體為pCambia3300的衍生載體，其構建過程是:pCambia3300經XhoI和HindIII酶切處理，用Pubi取代P35s_Bar部分得到PU130。分別用BamHI和SacI酶切，將酶切後的Epsps-1基因與PU130載體連接，得到中間載體 Pub1-Epsps-1-35spolyA,即 pZZ00002 ;分別用 Hind III 和 PmeI 對 pZZ00002 和P35s-gfp-35spolyA進行雙酶切，再將酶切後的二者連接，轉化大腸桿菌感受態細胞得到遺傳轉化載體PZZ00011。
[0014]進一步地，所述pZZ00013載體的構建方法為:合成Epsps-2基因，序列如SEQ IDN0.2所示；將Epsps-2基因與PU130載體分別用BamHI和SacI酶切，將酶切後的Epsps-1基因與PU130載體連接，得到中間載體Pub1-Epsps-2-35spolyA，即pZZ00003 ;分別用HindIII和PmeI對pZZ00003和P35s-gfp-35spolyA進行雙酶切，再將酶切後的二者連接，轉化大腸桿菌感受態細胞得到遺傳轉化載體PZZ00013。
[0015]在pZZOOOll和pZZ00013載體的構建方法中，所述的P35s-gfp-35spolyA是以pCambial381載體為模板，以SEQ ID N0.12和SEQ ID N0.13所示的核苷酸序列為上、下遊引物，通過PCR方法擴增得到的。
[0016]PCR 擴增 P35s-gfp_35spolyA 的 50 μ L 反應體系為:10 X La Taq Buffer5 μ L,
2.5mM dNTP4 μ L,上、下遊引物各 I μ L，pCambial381 模板 I μ L，LA Taq0.5 μ L,ddH2037.5 μ L0[0017]反應條件為:95°C, 5min ；95 °C，40s，55 °C，40s，72 °C，2min，25 個循環；72 °C,10min，4°C保存。1%瓊脂糖凝膠回收P35s-gfp_35spolyA片段。
[0018]Hind ΙΙΙ/PmeI 酶切回收 PCR 片段和質粒 pZZ00002 (Pub1-Epsps-l_35spolyA)或PZZ00003 (Pub1-Epsps-2-35spolyA)，體系為:10XNEB4,10 μ L ； 100XBSAl μ L ；Hind III，
2μ L ；PmeI,2 μ L ；PCR片段或質粒5-10 μ L ;加滅菌ddH20至總體系100 μ L。酶切條件為37°C,3-5h0
[0019]使用QIAGEN PCR Purifcation Kit試劑盒純化回收目標片段。
[0020]連接上述兩個酶切片段(P35s-gfp-35spolyA片段和pZZ00002或pZZ00003)，體系為:10Xligase buffer, 2 μ L ;長片段 I μ L ;短片段 7 μ L ；ligase, I μ L ;加 ddH20 至總體系20 μ L0連接條件為16°C，2-4h。
[0021]熱激轉化大腸桿菌感受態細胞(DH5 α )得到遺傳轉化載體ρΖΖΟΟΟΙ 1/ρΖΖ00013，並將遺傳轉化載體轉化入農桿菌中，進行測序分析，結果顯示該農桿菌中含有Epsps-1基因或Epsps-2基因。
[0022]本發明方法中，所述的選擇培養基以N6為基本培養基，並添加2.5mg/L的2，4_D，250mg/L羧苄青黴素和草甘膦。
[0023]進一步地，選擇培養基中草甘膦的終濃度為8(T300mg/L。
[0024]本發明製備抗草甘膦轉基因水稻的方法中，應用的農桿菌為EHA105。
[0025]優選地，本發明方法中所述的水稻為粳稻。
[0026]更優選地，所述的粳稻為空育131和/或R187。
[0027]本發明方法利用草甘膦作為篩選劑，培育出的水稻品種除了帶有抗草甘膦除草劑的基因外不含有其它的篩選標記基因，可以直接作為抗除草劑的品種進行商業化生產，極大地減少了後期的流程，加快了育種步伐。本發明方法具有效率高、操作簡便、轉基因植株拷貝數低、遺傳性狀穩定等優點，為大規模商業化生產抗草甘膦水稻提供了可能。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0028]圖1為遺傳轉化載體的T-DNA區示意圖，其中圖1A為Epsps-1基因遺傳轉化載體(pZZOOOll)的T-DNA區示意圖；圖1B為Epsps-2基因遺傳轉化載體(pZZ00013)的T-DNA區示意圖。
[0029] 圖2轉基因植株中外源基因(GFP)在組織中的表達圖。圖2A為外源基因(GFP)在轉化粳稻根部的表達圖；圖2B為外源基因(GFP)在轉化粳稻葉部的表達圖。a:含Epsps-1的載體轉化空育131得到的苗；b:含Epsps-2的載體轉化空育131得到的苗；c:野生型空育131 ；d:含Epsps-1的載體轉化R187得到的苗；e:含Epsps-2的載體轉化R187得到的苗；f:野生型R187
[0030]圖3轉基因植株中外源基因(Epsps-1/Epsps-2)PCR擴增結果圖。圖3A =Epsps-1基因轉化粳稻品種空育131所得到的部分轉基因植株PCR擴增圖；圖3B:Epsps-2基因轉化粳稻品種空育131所得到的轉基因植株PCR擴增圖；圖30 =Epsps-1基因轉化粳稻品種R187所得到的轉基因植株PCR擴增圖；圖3D:Epsps-2基因轉化粳稻品種R187所得到的轉基因植株PCR擴增圖。M:為2KB Marker分子量標準；1_20:本發明製備的轉基因植株編號；N:陰性對照；P:陽性對照；圖片左側數字:轉化實驗編號。[0031]圖4轉基因植株拷貝數檢測圖。Epsps-1和Epsps-2轉化粳稻品種空育131以及Epsps-1和Epsps-2轉化粳稻品種R187植株Southern_blot檢測圖。每個樣品分別來自於獨立的轉化事件，圖上標示出了相應的目標基因和受體品種。
[0032]圖5Epsps試紙條檢測轉基因植株中蛋白(Epsps_l/Epsps_2)表達的結果。圖5A:Epsps-1和Epsps-2轉化粳稻品種空育131植株蛋白檢測圖；圖5B:Epsps_l和Epsps-2轉化梗稻品種R187植株蛋白檢測圖。
[0033]圖6轉基因植株噴施草甘膦除草劑後的表型圖，草甘膦噴施濃度0.6% (V/V)0【具體實施方式】
[0034]以下實施例用於說明本發明，但不用來限制本發明的範圍。在不背離本發明精神和實質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬於本發明的範圍。
[0035]若未特別指明，實施例中所用的化學試劑均為常規市售試劑，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段。
[0036]實施例1Epsps-1和Epsps-2基因的合成與遺傳轉化載體的構建
[0037]1、人工合成草甘膦抗性基因 Epsps-1 (US_RE39247)和 Epsps-2 (CN88103827.X)，其核苷酸序列分別如SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示。
[0038]2、以PU130載體為骨架(PU130載體的構建過程是:pCambia3300載體經XhoI和HindIII酶切處理，用Pubi取代P35s-Bar部分得到PU130)，構建遺傳轉化載體，分別命名為pZZOOOll和pZZ00013。兩個遺傳轉化載體的T-DNA區域示意圖見圖1A，圖1B。 [0039](I)把人工合成的基因Epsps-1和Epsps-2經BamHI和SacI酶切，插入經BamHI和SacI酶切處理過的PU130，分別獲得中間載體pZZ00002 (Pub1-Epsps-l_35spolyA)、pZZ
00003(Pub1-Epsps-2-35spolyA)。
[0040](2) PCR 擴增 P35s-gfp_35spolyA。
[0041]反應體系:10X La Taq Buffer5 μ L,
[0042]
【權利要求】
1.一種抗草甘膦轉基因水稻的製備方法，包括以下步驟: (1)將含草甘膦抗性基因的表達載體轉化入農桿菌中； (2)將步驟(1)的農桿菌菌液侵染水稻的胚性愈傷組織； (3 )將步驟(2 )的愈傷組織轉移到添加了草甘膦的選擇培養基上進行篩選，挑選抗性愈傷組織； (4)將抗性愈傷組織轉入分化培養基分化，將分化形成的再生小苗轉入生根培養基中培養，幼苗生根後煉苗、移栽，得到抗草甘膦轉基因水稻。
2.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，步驟(1)所述的表達載體為pZZOOOll或PZZ00013。
3.如權利要求2所述的方法，其特徵在於，所述pZZOOOll載體的構建方法為:合成Epsps-1基因，序列如SEQ ID N0.1所示^fEpsps-1基因與PU130載體分別用BamHI和SacI酶切，將酶切後的Epsps-1基因與PU130載體連接，得到中間載體Pub1-EpSpS-1-35SpolyA，即 pZZ00002 ;分別用 Hind III 和 PmeI 對 pZZ00002 和 P35s-gfp_35spolyA 進行雙酶切，再將酶切後的二者連接，轉化大腸桿菌感受態細胞得到遺傳轉化載體pZZOOOll。
4.如權利要求2所述的方法，其特徵在於，所述pZZ00013載體的構建方法為:合成Epsps-2基因，序列如SEQ ID N0.2所示^fEpsps_2基因與PU130載體分別用BamHI和SacI酶切，將酶切後的Epsps-1基因與PU130載體連接，得到中間載體Pub1-EpSpS-2-35SpolyA，即 pZZ00003 ;分別用 Hind III 和 PmeI 對 pZZ00003 和 P35s-gfp_35spolyA 進行雙酶切，再將酶切後的二者連接，轉化大腸桿菌感受態細胞得到遺傳轉化載體PZZ00013。
5.如權利要求3或4所述的方法，其特徵在於，所述的P35s-gfp-35spolyA是以pCambial381載體為模板，以SEQ ID N0.12和SEQ ID N0.13所示的核苷酸序列為上、下遊引物，通過PCR方法擴增得到的。
6.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述的選擇培養基以N6為基本培養基，並添加2.5mg/L的2，4-D，250mg/L羧苄青黴素和草甘膦。
7.如權利要求6所述的方法，其特徵在於，選擇培養基中草甘膦的終濃度為8(T300mg/L0
8.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述的農桿菌為EHA105。
9.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述的水稻為粳稻。
10.如權利要求9所述的方法，其特徵在於，所述的粳稻為空育131和/或R187。
【文檔編號】A01H5/00GK104004781SQ201310058935
【公開日】2014年8月27日 申請日期:2013年2月25日 優先權日:2013年2月25日
【發明者】張琳, 馬崇烈, 魏晶, 夏秀雲, 王維鵬, 李晨, 章旺根 申請人:中國種子集團有限公司