基因表達的定量的製作方法

2023-08-03 00:40:51

專利名稱：基因表達的定量的製作方法
背景技術：
在許多病理學的狀況，例如不同的良性和惡性腫瘤、神經系統紊亂、心臟病和自身免疫紊亂中檢測和定量差異表達的基因可對這些病理學狀況的診斷、預後和治療有用。基因表達的定量也可用於診斷感染性的疾病和在分子水平上追蹤藥物或毒素的作用。例如，基因表達數據可用於確定藥物或毒素的藥理學機制(Libutti et al.，Microarray technology and gene expression analysis for thestudy of angiogenesis.Expert Opin Biol Ther.2002 Jun；2(5)545-56)。
用於轉錄本檢測和定量的方法傳統上包括基於Northern-印跡雜交、核糖核酸酶保護分析、和逆轉錄酶聚合酶鏈式反應(RT-PCR)的方法。然而，除缺少靈敏性(除RT-PCR外)的缺點外，這些方法只可用於粗略地評估來自不同來源的樣本間每種轉錄本的相對表達的變化。基於RT-PCR的不同方法是為了診斷目的的最合適的定量方法，因為它們是很靈敏的並且因此只需要合乎診斷測試所需的小的樣本規模。
如果想要比較樣品之間，甚至相同樣品內的基因表達，需要絕對定量樣品中轉錄本的拷貝數。然而，由於PCR反應固有的非線性特性，利用基於PCR的方法很難定量核酸的拷貝數。PCR擴增可從指數階段變化到試劑耗盡或酶鈍化的平臺期階段。經常地，必須分別確定PCR的指數階段，其可能包括在不同時間點對PCR反應進行取樣或利用不同稀釋度的模板進行PCR。進一步地，由於模板間擴增效率的差異，不能在線性範圍中直接比較不同PCR產物的起始數量。傳統上在擴增完成後進行PCR產物的檢測。一般地，通過瓊脂糖凝膠電泳、用溴化乙啶染色、並且用紫外光顯現來區別PCR反應產物等分的大小。備選地，可以用螢光染料或放射性的分子標記引物。比較樣品間的條帶強度容許定性地估計擴增的模板的相對起始濃度，但是這個方法不是定量的並且不能確定絕對的拷貝數。
已經描述了許多基於定量的RT-PCR的方法，包括利用PCR和互補的DNA(cDNA)陳列的RNA定量法(Shalon et al.，Genome Research6(7)639-45，1996；Bernard et al.，Nucleic Acids Research24(8)1435-42，1996)、基於引物延伸反應的固相迷你測序方法(美國專利號6,013,431，Suomalainen et al.Mol.Biotechnol.Jun；15(2)123-31，2000)、離子對高效液相色譜(Doris et al.J.Chromatogr.A May 8；806(1)47-60，1998)、和5′核酸酶分析或實時RT-PCR(Holland et al.Proc Natl Acad Sci USA887276 7280，1991)。
研製提供靈敏和精確的定量mRNA轉錄本的方法將是有用的，其可以是容易地自動化操作的，並且規模擴大至容許測試大量樣品，以及克服與PCR擴增相關的問題。這種方法能夠診斷不同的病理學狀況，包括病毒、細菌和寄生蟲，以及不同的良性和惡性腫瘤、神經系統紊亂、心臟病和自身免疫紊亂。這種方法也提供以診斷、預後和治療為目的的定量令人感興趣的轉錄本，並且最終便於基因組藥理學的應用。這種方法也可提供對基因表達有影響的大量試劑的篩選。
發明概述本發明涉及測定樣品中靶核酸的數量的方法，其中使用的標準物被設計成與目標基因或″靶核酸序列″相比具有一個鹼基的差異。使用這種標準物與″增加″標準物與測試的核酸樣品中的差異的方法的結合可，利用例如，正好在突變位點進行的鹼基延伸反應，容許以相同的效率擴增標準和靶核酸，從而有助於定量靶核酸。此後使用定量″增加的″標準和靶核酸樣品的手段來確定靶核酸的數量。在優選的實施方案中，定量手段是質譜法。
本發明的方法是靈敏的、精確的和高度可重複的，並且它也不依賴於PCR循環的數目，而極大地使分析簡單化。本發明的方法是獨特的，因為可同時測量相同基因的不同等位基因，可獲得對基因表達的絕對定量，因此可直接比較來自不同實驗的數據，並且可用於高-通量分析而幾乎不需要為了PCR進行優化。另外，該方法容許精確地測定生物標本，例如人的液體(血清、血漿等)中的傳染物，例如病毒、細菌和寄生蟲的拷貝數。
本發明提供定量生物標本中靶基因/核酸的數量或靶基因/核酸的多元性的方法，包括將已知濃度的核酸標準加入生物標本中，其中該標準被設計成與靶核酸序列具有一個鹼基的差異；例如利用聚合酶鏈式反應用的靶和標準核酸擴增樣品，通過例如用磷酸酶(例如Shrimp鹼性磷酸酶)處理擴增樣品以除去過量的dNTPs，並因此通過例如靶和標準核酸樣品中的不同鹼基來增加標準和測試核酸之間的核酸差異。標準和靶核酸產生2種不同的產物，一般具有1個至2個鹼基的差異，隨後進行定量。可根據擴增樣品中存在的標準物的數量來計算轉錄本的濃度。
例如，本發明能夠檢測，更重要的是定量傳染物。它可容易地用於高通量的方法，其中在384-規格的矽晶片上可以定量大約100個傳染物。
在一個優選的實施方案中，利用MALDI-TOF質譜法(例如，利用Sequenom′s MassArrayTM系統)根據″增加的″靶和標準核酸產物的不同質量進行定量，其中使用質譜中峰值的比率來計算標準物和靶核酸的比率。可以根據擴增前樣品中使用/加入的標準的初始量來計算轉錄本的濃度。
在一個優選的實施方案中，利用引物延伸方法來增強標準和靶核酸之間的核酸差異。
在另一個實施方案中，利用螢光標記的dNTP/ddNTP進行鹼基延伸來增強PCR後靶和標準中的核酸差異。
在另一實施方案中，利用不同染料標記的ddNTPs增強PCR後靶和標準中的核酸差異，其中將不同染料標記的ddNTPs差異性地摻入到引物延伸反應中的靶和標準核酸中。
在一個實施方案中，利用實時PCR來增強PCR後靶和標準中的核酸差異。
在另一個實施方案中，利用基於雜交的方法來增強PCR後靶和標準中的核酸差異，其中2種寡核苷酸特異於設計用於雜交的靶或標準。
在另一個實施方案中，利用熱測序技術來增強PCR後靶和標準中的核酸差異。
在另一個實施方案中，利用使用人工的單核苷酸多態性(SNP)作為內參照的第三浪潮侵入分析(Third Wave Invader assay)來增強PCR後靶和標準中的核酸差異。在備選的實施方案中，當使用焦磷酸測序時，不需要預擴增。
在一個實施方案中，靶核酸是來自至少一種傳染物的核酸。
在另一實施方案中，本發明提供一種試劑盒，其包括至少一個，優選幾個不同的引物，該引物被設計成與不同小瓶中的至少一種，優選幾種靶核酸相差一個核酸，或優選地與所有的標準核酸相差一個核酸，該標準核酸以已知的預定濃度存在於適於PCR的緩衝液中，或在直接的增強反應中如上所述增加標準物和相應靶核酸之間的差異。該試劑盒也包括說明反應條件和利用標準核酸測量靶核酸數量的手冊。本發明預期的試劑盒包括但不限於用於確定生物樣品中傳染物數量的試劑盒和確定在施用醫藥或藥物後，或由於例如腫瘤的疾病狀況而預期有增減的一種或多種轉錄本的數量的試劑盒。
附圖簡述

圖1顯示用於測量基因表達的實時競爭性PCR和質譜方法的流程圖。為簡單起見，只顯示一個DNA鏈。在該流程圖中也顯示延伸的oligos一般為約20個鹼基，而不是7個鹼基。
圖2顯示相同濃度相同oligo的峰面積分布。使用0.3μm的Oligo47954(5′-ATGGCCACAGTTGTATCA-3′)，並且將15nL點樣到用3-羥基吡啶甲酸(HPA)預點樣的矽晶片上。相同晶片的不同位置、相同濃度斑點的oligos的絕對峰面積顯示平均峰面積為12395(任意數)和標準偏差為3737的適度變異性。
圖3A和3B顯示質譜中峰面積比與oligo的濃度比準確相關。Courtesy of Kal Tang(Sequenom)。利用MassArrayTM(Sequenom)分析4.5nL的不同比率的2種oligo混合物溶液(1∶1、1∶2、1∶5、1∶10、1∶20)。圖3A顯示質譜，而圖3B顯示質譜中實際濃度比率對信號強度(峰面積)比率的折線圖。
圖4A-4E顯示以不同比率混合的僅有一個鹼基不同的2種DNA模板的質譜。在圖4A中比率是1∶1；在圖4B中比率是3∶1；在圖4C中比率是10∶1；在圖4D中比率是1∶3；而在圖4E中比率是1∶10，但是總濃度固定(2×10-7μg/μL)。通過PCR(30個循環)、鹼基延伸(40個循環)來擴增模板，然後點樣到用3-羥基吡啶甲酸(HPA)預點樣的矽晶片上，並且用MALDI-TOF分析。
圖5顯示推定的DNA濃度比和測量的DNA濃度比(由峰面積比表示)之間的相關性。PCR擴增分別是20、30和40個循環，結果是不依賴於PCR-循環。各個數據點重複4次(n＝4)並顯示誤差線。
圖6A-6H顯示利用實時競爭性PCR和質譜的基因表達(GAPDH、HMBS和CXCR4)分析。
發明詳述本發明涉及測量樣品中基因表達或核酸量的新方法。這個方法組合了競爭性的PCR(聚合酶鏈式反應)、鹼基延伸以及此後進行的測量。該方法可用於直接測量特異性基因的拷貝數，或比較來自不同樣品的特異性基因的上調或下調。
將已知濃度的標準核酸(DNA或RNA)加入RNA樣品(用於RNA標準)或逆轉錄產物(用於DNA標準)中。然後通過PCR擴增包括標準物的逆轉錄產物。將該標準物設計成與目標基因，即靶核酸相比具有一個鹼基突變的差異。因此，在PCR中以相同的效率擴增標準物和靶核酸。可利用例如正好在突變位點處進行的鹼基延伸反應來鑑定這2種核酸。
因此通過多種方式中的任何一種，優選通過質譜(MALDI-TOF，或矩陣輔助的雷射解吸電離-飛行時間)測量PCR產物的數量。來自標準物和目標基因的產物之間的峰面積比代表了標準物和目標基因的比率。既然已知標準的濃度，可以計算目標基因的濃度。
在至少下列的方面中，本發明的方法是獨特的。首先，可選擇基因的自然突變來構建標準物。因此，不僅可以測量基因的表達水平，而且可以確定表達基因的基因型。第二，PCR中單一點突變的使用確保了幾乎等同的擴增。這消除了由其他競爭性PCR方法中的差異擴增產生的問題，在這些競爭性的PCR中，所述的標準物一般與基因是不同長度的。
在優選的實施方案中，鹼基延伸和MALDI-TOF MS檢測的組合也消除了來自常規的檢測方法，例如凝膠電泳遇到的形成異源雙鏈的問題。來自標準物的延伸產物也在MALDI-TOF MS中起內標準的作用。因此，當加入到反應中的標準物的數量是已知的時，可定量地測量核酸的數量。
這個方法具有至少下列優點。首先，這個方法在PCR中幾乎不需要優化。第二，這個方法不依賴於PCR循環的數目。第三，該方法是高度精確的、靈敏的和可重複的。第四，該方法可用於高通量的基因表達分析，其中在一個384-矽晶片上可以測量至少50-100個、甚至達到至少1000個基因的表達。
如下列實施例所示，通過這個方法分析在人的培養細胞中GAPDH、HMBS和CXCR4的表達可產生與其他方法一致的結果。
如在此所使用的，術語″生物樣品″是指從任何來源(例如人、動物、植物、細菌、真菌、原生生物、病毒)獲得的任何生物材料。為了用於本發明，該生物樣品應包含核酸分子。用於本發明的合適的生物樣品的實例包括固體材料(例如組織、細胞沉澱顆粒、活檢樣品)和生物液體(例如尿液、血液、唾液、羊水、漱口劑)。
可利用本領域已知的許多方法中的任何一種從特定的生物樣品分離核酸分子，其中選擇適於特定的生物樣品的特定分離方法。
病毒、細菌、真菌和其他感染性的生物體包含與宿主細胞中含有的序列不同的獨特的核酸序列。檢測或定量特異於感染性生物體的核酸序列對於診斷或監測感染是很重要的。感染人和動物，並且可通過已公開的方法檢測的致病病毒的實例包括逆轉錄病毒科(例如，人類免疫缺陷性病毒、例如HIV-1(也稱為HTLV-III、LAV或HTLV-III/LAV、參見Ratner，L.et al.，Nature，Vol.313，Pp.227-284(1985)；Wain Hobson，S.et al，Cell，Vol.40Pp.9-17(1985))；HIV-2(參見Guyader et al.，Nature，Vol.328，Pp.662-669(1987)；歐洲專利
發明者C·R·坎託爾, C·丁 申請人:波士頓大學信託人