用於分析能量代謝中極性代謝物的方法

2023-07-05 07:08:56 1

專利名稱：用於分析能量代謝中極性代謝物的方法
用於分析能量代謝中極性代謝物的方法本發明涉及極性代謝物的分析並提供了用於分析極性代謝物的方法，其包括在允許直接破壞生物樣品所包含的細胞的條件下用包含相分離劑和揮發性中性銨鹽的提取緩衝液提取生物樣品，通過色譜法分離提取物所包含的極性代謝物，並分析所分離的極性代謝物。此外，考慮了用於淬滅包含細胞物質的生物樣品的方法。極性代謝物諸如羧化代謝物或磷酸化代謝物佔細胞的代謝組物的高達90 %。相應地，代謝組學，即代謝組物的系統和比較分析，在極大程度上涉及極性代謝物的分析。目前提供的用於代謝組學的分析技術主要是基於以液相色譜或氣相色譜為基礎的質譜或以液相色譜或氣相色譜為基礎的NMR(核磁共振)譜。在代謝組學中氣相色譜的應用的缺點是必須將代謝物轉換成氣相而不未破壞分子。應用衍生化以改善所述的轉換。然而，衍生化也具有一些缺點，因為人工衍生化能產生有時幾乎與真實代謝物無法區分的代謝物。液相色譜既不需要轉換成氣相也不需要衍生化。然而，對於極性代謝物的分離是不太有效的。此外，由於生物樣品中過多的蛋白質類、肽類和無機鹽的存在，對於極性代謝物的分離效能通常被顯著地降低。因此，期望的是把氣相色譜的精確分離特性與能被應用於液相色譜的溫和的條件結合。這樣，將會避免上述的缺點。因此，雖然還沒有用於代謝物的有效的提取和分析的方法，但卻是迫切需要的。本發明涉及用於分析極性代謝物的方法包括i)在允許直接破壞生物樣品所包含的細胞的條件下，用包含相分離劑和揮發性中性銨鹽的提取緩衝液提取生物樣品，ii)通過色譜法分離步驟i)中所獲得的提取物所包含的極性代謝物，和iii)分析步驟ii)中所獲得的分離的極性代謝物。本文所應用的術語「生物樣品」是指包含來自所有生物來源的生物物質的樣品。 應當理解的是生物物質應包括代謝物。生物樣品所包含的優選的物質是細胞物質，諸如細胞或細胞碎片。因此，優選地，生物樣品包含懸浮細胞、貼壁細胞或組織或它們的任何碎片。 優選的生物樣品包含來自臨床樣品的生物物質，包括體液樣品，優選血液、血漿、血清、淋巴液、汗液、唾液、淚液、精液、陰道液、糞便、尿液或腦脊液，或由例如通過活組織檢查從細胞、組織或器官所獲得的樣品。還優選地，生物樣品代表有機體的各種狀況的一種，例如它可是源自健康的或患病的有機體，用藥物治療或未治療的有機體等。還包括包含微生物諸如細菌或真菌或者植物、植物部分(諸如葉、莖、根或花)或植物種子的生物樣品。本文所應用的術語「代謝物」是指小分子化合物，諸如代謝途徑的酶的底物、所述途徑的中間體或通過代謝途徑所獲得的產物。代謝途徑為本領域所公知且可在種屬之間不同。優選地，所述的途徑至少包括三羧酸循環、呼吸鏈、光合作用、光呼吸作用、糖酵解、糖原異生、一磷酸己糖通路、氧化戊糖磷酸途徑、脂肪酸產生和β -氧化、尿素循環、胺基酸生物合成途徑、蛋白降解途徑諸如蛋白酶體降解、胺基酸降解途徑、脂質體、聚酮化合物(包括例如黃酮類和異黃酮類)、類異戊二烯(包括例如萜類、留醇類、留類、類胡蘿蔔素類、葉
4黃素類)、碳水化合物類、苯丙素類及衍生物、生物鹼類、苯環類、吲哚類、吲哚-硫化合物、 卟啉類、花色素類、激素類、維生素類、輔因子諸如輔基或電子載體、木質素、葡萄糖異硫氰酸鹽類、嘌呤類、嘧啶類、核苷類、核苷酸及相關的分子諸如tRNA、微小RNA(miRNA)或mRNA 的生物合成或降解。相應地，小分子化合物代謝物優選地由以下幾類化合物組成醇類、烷烴類、烯烴類、炔烴類、芳香化合物、酮類、醛類、羧酸類、酯類、胺類、亞胺類、醯胺類、氰化物類、胺基酸類、肽類、硫醇類、硫代酸酯類、磷酸酯類、硫酸酯類、硫醚類、亞碸類、醚類，或上述化合物的組合或衍生物。在代謝物中的小分子可以是正常細胞功能、器官功能或動物生長、發育或健康以及植物生長所必需的初級代謝物。此外，小分子代謝物還包括具有重要生態功能的次級代謝物，例如使有機體適應其環境的代謝物。此外，代謝物不局限於所述的初級和次級代謝物還包括人工小分子化合物。所述的人工小分子化合物是源自外源性提供的小分子，其通過有機體施用或攝取，但不是上文定義的初級或次級代謝產物。例如， 人工小分子化合物可以是通過動物的代謝途徑從藥物所獲得的代謝產物。此外，代謝物還包括肽類、寡肽類、多肽類、寡核苷酸類和多聚核苷酸類，諸如RNA或DNA。更優選地，代謝物的分子量為50Da(道爾頓)至30，OOODa，最優選地小於30，OOODa、小於20，OOODa、小於 15，OOODa、小於 10，OOODa、小於 8，OOODa、小於 7，OOODa、小於 6，OOODa、小於 5，OOODa、小於 4，OOODa、小於 3，OOODa、小於 2，OOODa、小於 1，OOODa、小於 500Da、小於 300Da、小於 200Da、 小於lOODa。優選地，代謝物無論如何具有至少50Da的分子量。然而，依據本發明的代謝物的分子量最優選為50Da至1，500Da。在代謝物中，本發明面對的是極性代謝物，即為極性的小分子化合物。從生物樣品提取諸如極性代謝物的分子是已公知的方法，其是基於利用分子的溶解性差別。感興趣的分子可被提取出來，即溶解在提取緩衝液中，並因此從生物來源中移走。可以理解的是基於提取緩衝液的化學性質，可溶解不同種類的分子，並因此從生物樣品物質中分離。本發明的方法，特別是設想從生物樣品中提取極性代謝物。提取可以連續的或分批的方法進行。以生物樣品為例，提取方法優選有機械破壞生物樣品所包含的生物物質的幫助。這樣的幫助優選允許短的和有效的提取時間，優選地小於40秒，小於30秒，小於20秒。這可通過已公知的均勻化技術實現，諸如通過例如pestilling或珠磨進行的細胞研磨，例如Jastfr印(MP生物醫學，德國)。應用於本發明方法中的提取緩衝液包含相分離劑，即對於使分子分離至不同相 (諸如極性分子的相和非極性分子的相)中具有促進和/或改善能力的化合物。優選地，本發明方法所應用的相分離劑包含滷化溶劑。優選地，滷化溶劑具有大於 l.Olg/cm3(在20°C)的密度。更優選地，滷化溶劑選自二氯甲烷、氯仿或四氯乙烯，更優選地，滷化溶劑是二氯甲烷。相分離劑是高度疏水的，且優選地密度高於水，諸如二氯甲烷是本發明方法中優選的。這些相分離劑能夠沉澱樣品中的蛋白質，並因此有助於優選的基於離心方法的蛋白質幹擾物的去除，否則其會干擾代謝物的後續的分析。此外，通過相分離劑的相分離是有利的，因為由於高濃度鹽幹擾物會使有機溶劑在水溶液中的溶解度降低。除了滷化溶劑外，相分離劑優選地還包含低級烷的醇。優選地，所述的醇是乙醇、 甲醇或異丙醇，且最優選乙醇。滷化溶劑和低級烷的醇存在於相分離劑中，優選地以3 1至1 1的比率、且優選地以2 1比率存在。然而，還優選地，相分離劑也可基本上由滷化溶劑構成。
此外，提取緩衝液包含揮發性的生性銨鹽。本文所涉及的揮發性中性銨鹽是可通過冷凍乾燥方法升華的銨鹽。優選地，所述的揮發性中性銨鹽是乙酸銨、甲酸銨或碳酸氫銨。最優選地，所述中性銨鹽是乙酸銨。尤其是乙酸銨促進極性和非極性代謝物的分離，因為僅極性代謝物能溶解於本發明的含有乙酸銨的提取緩衝液中。依據所要進行的用於分析代謝物的分析的類型，分離極性代謝物與非極性代謝物是必需的或有幫助的。這特別是應用於如果將分析含蛋白質的樣品的情況下。優選地，提取緩衝液包含濃度至少為0. 5M的所述的揮發性中性銨鹽。更優選地，濃度在0.75M至1.8M之間，且最優選濃度為1.5M。應理解的是濃度可包括優選在加或減15%、10%或5%的範圍內的較小的偏差。在本發明方法中中性(即非鹼性的)揮發性銨鹽的應用優於鹼性揮發性銨鹽諸如碳酸銨，因為這樣的鹼性鹽可能改變樣品的代謝組成，例如通過裂解磷酸化的代謝物諸如CoA-酯而使之改變。 在本發明方法中所應用的揮發性中性銨鹽，優選地充當包含離子化代謝物和蛋白質的複合物的競爭劑。由於所述的銨鹽的離子交換的性質，所述特定的高濃度中性銨鹽允許所述的離子化代謝物-蛋白質的複合物解離，並因此增加離子化即極性代謝物的收率。提取緩衝液優選還包含其他組分諸如溶劑、穩定劑，或依據提取物的進一步應用， 還包含用於測定的標準物質。應用於提取緩衝液中優選的標準物質在本說明書中的其他部分更詳細地說明。應理解的是本發明也涉及如上詳述的提取緩衝液。步驟i)中的生物樣品的提取原則上能在低於提取緩衝液的沸點的任意溫度進行。優選地，溫度低於95°C，提取更優選在低於-20°C的低溫進行，這是為了避免或降低酶的活性或為了減少在化學上改變(例如降解)樣品中代謝物的化學反應。優選地，在-20 至_80°C的提取溫度進行提取。特別優選的溫度是在-25至-80°C，-30°C至_80°C，-35°C 至-80 "C，-40 "C 至-80 "C，-45 V 至-80 V，-50 V 至-80 V，-55 V 至-80 V，-60 V 至-80 °C，-65 °C 至-80 "C，-70 "C 至-80 "C，且更優選地溫度是-70 °C、_71 °C、-72 °C、-73 °C、~7 4°C、-75 °C、-76 °C、-77 °C、-78 °C、-79 °C、或-80 °C。在本發明方法中通過常規的色譜技術分離所提取的極性代謝物。優選的技術包括毛細管電泳(CE)，陽離子、陰離子交換色譜，離子排阻色譜，反相色譜，正相色譜，親水作用色"1普(hydrophilic liquid interaction chromatography)，免疫親禾口色譜，液才目色i普 (LC)或氣相色譜(GC)以及高壓液相色譜(HPLC)或超高壓液相色譜(UPLC)。最優選地，通過UPLC或HPLC完成分離。對於UPLC應用，在約400至1000巴的工作壓力、更優選地580 至750巴的工作壓力優選應用< 2. 0 μ m尺寸的C18顆粒。UPLC的應用可實現具有高靈敏度的快速分離(小於半小時)且比通常的HPLC方法分離更多的異構體。此外，無機鹽與需要的極性代謝物被更好地色譜分離。更多的優勢是減少色譜峰的拖尾，尤其對於酮基羧酸 (ketocarbonic acid)或多羥基酸是如此，以及由於更好的信噪比而改善檢測限。然後對所分離的極性代謝物進行分析，以測定它們的化學性質和/或用以測定它們的結構。所述的分析可通過測定極性代謝物的物理或化學性質進行，隨後可將其與已知分子的性質進行比較。基於所述的比較，可由於與已知分子匹配的性質而鑑定代謝物。此夕卜，通過應用本發明的方法可定量地或半定量地測定存在於樣品中的代謝物的量。用於分析極性代謝物的優選的技術是基於質譜或基於NMR的技術。優選地，應用質譜，特別是氣相色譜質譜(GC-MQ，液相色譜質譜(LC-MQ，直接注入式質譜或傅立葉變換離子迴旋共振質譜儀(FT-ICR-MS)，毛細管電泳質譜(CE-MQ，高效液相色譜偶聯質譜 (HPLC-MS)，四級杆質譜，任意按順序偶聯質譜，諸如ESI-MS-MS或MS-MS-MS，電感耦合等離子質譜(ICP-MQ，裂解質譜(Py-MQ，離子遷移質譜或飛行時間質譜(TOF)。所述的技術在例如Nissen，Journal of Chromatography A，703，1995 :37-57, US 4，540，884 或 US 5，397，894中公開，其公開內容在此弓I入本文作為參考。最優選地，應用UPLC和ESI-MS/MS。作為備擇項或除了質譜技術之外，以下技術也可被用於代謝物的測定核磁共振 (NMR)、磁共振成像(MRI)、傅立葉變換紅外分析(FT-IR)、紫外(UV)光譜、折射指數(RI)、螢光檢測、放射化學檢測、電化學檢測、光散射(LS)、分散拉曼光譜或火焰離子化檢測(FID)。 這些技術為本領域的技術人員所公知且可被直接應用。此外，也可通過特定的化學或生物檢驗分析極性代謝物。所述的檢驗應包括可以特異地檢測樣品中代謝物的手段。優選地，所述的手段能夠特異地識別代謝物的化學結構， 或者基於其與其他化合物反應的能力或其引起在生物讀出系統上的響應(例如誘導報告基因)的能力能夠特異地鑑定代謝物。能夠特異地識別代謝物化學結構的手段優選是抗體或特異地與化學結構相互作用的其他蛋白質，諸如受體或酶。特異性抗體例如可通過本領域已公知的方法利用代謝物作為抗原而獲得。本文所涉及的抗體包括多克隆和單克隆兩種抗體，及它們的片段，諸如能結合抗原或半抗原的Fv，Fab和F(ab)2片段。本發明也包括人源化雜交抗體，其中顯示需要的抗原特異性的非人供體抗體的胺基酸序列與人受體抗體的序列結合。此外，包括單鏈抗體。供體序列通常至少包括供體的結合抗原的胺基酸殘基，但是也可包括供體抗體的其他結構上和/或功能上相關的胺基酸殘基。通過本領域已公知的方法可製備所述的雜交體。能夠特異地識別代謝物的合適的蛋白質優選是在所述的代謝物的代謝轉化中所涉及的酶。所述的酶可利用代謝物作為底物或可轉化底物為代謝物。此夕卜，所述的抗體可被用作基礎來產生特異地識別代謝物的寡肽。這些寡肽例如應包含針對所述代謝物的酶結合區或口袋。基於合適的抗體和/或酶的測定法可以是RIA(放射免疫分析)、ELISA (酶聯免疫吸附分析)、夾心酶免疫檢測、電化學發光夾心免疫分析(ECLIA)、 離解-增強鑭系元素螢光免疫分析(DELFIA)或固相免疫檢測。此外，也可基於代謝物與其他化合物反應的能力鑑定代謝物，即通過特異的化學反應。而且，代謝物也可由於其引起得到在生物讀出系統響應的能力而被分析。生物響應可以讀出而被檢測，指示包含在樣品中的代謝物的存在和/或量。生物響應可以是例如誘導基因表達或者細胞或有機體的表型響應。本發明的方法應當優選地通過自動化輔助。例如，在提取和/或分離過程中的樣品處理或前處理可通過機器人自動化操作。數據處理和比較優選由合適的電腦程式和資料庫輔助。本文前述的自動化使本發明的方法可以應用於高通量方法中。有利地，已在闡述本發明的研究中發現本發明的方法可以從生物樣品中有效地提取極性代謝物。特別是，在低溫進行提取防止了生物分子的降解，這是由於降低了總體的化學和/或生物反應性，例如使酶保持非活化。如上所述在提取緩衝液中相分離劑的應用導致水相凝固點降低、蛋白質的變性和有效的沉澱以及將疏水性的酶和親水性的(極性的) 代謝物分離在不同的相中。此外，已驚奇地發現以高濃度加入揮發性的中性銨鹽由於其離子交換性質而顯著提高提取率。此外，在後期階段可將所述的揮發性中性銨鹽從提取物中去除，因此，不影響極性代謝物的分析。
在本發明方法的優選的實施方案中在步驟ii)之前通過以下的步驟處理提取物a)將水相旋轉離心，b)將步驟a)中所獲得的上清液冷凍乾燥，和c)將步驟b)中所獲得的冷凍乾燥物溶解在包含離子對生成劑的分析緩衝液中。具體而言，如果如上述進行基於MS的極性代謝物的分析，上述的步驟a)至C)是優選進行的。水相的旋轉離心有效地從水相中保留的極性代謝物去除細胞碎片。優選地， 通過應用0.2μπι至5μπι(標稱截流)的膜過濾器旋轉過濾進行旋轉離心。然後將包含提取緩衝液的極性代謝物和極性組分、諸如揮發性中性銨鹽的旋轉離心步驟的上清液或過濾液，通過標準方法冷凍乾燥。該方法還通過升華去除了揮發性的中性銨鹽，因此，其不可能影響隨後的極性代謝物的色譜分離或分析的步驟。將產生的冷凍乾燥物溶解於用於代謝物的色譜分離和分析的分析緩衝液中。在本發明方法中所應用的分析緩衝液應當包含離子對生成劑。優選地，所述的離子對生成劑是三丁基銨陽離子、三乙基銨陽離子、三丙基銨陽離子或正己基銨陽離子。這些離子對生成劑可以以游離胺形式獲得，然後將其通過質譜相容性酸活化，諸如乙酸或甲酸。優選地，分析緩衝液具有中性至弱酸性ρΗ，更優選ρΗ在6. 0至6. 8之間，最優選 6. 4 至 6. 8。在下文描述了上述方法的優選實施方案的具體方面。在本發明方法的優選的實施方案中，生物樣品是細胞懸浮液。在進行本發明方法之前(即步驟i)之前)，優選地淬滅生物樣品，即直接抑制酶的活性和抑制由於例如氧化的化學修飾。然而，所述淬滅方法通過引起從細胞內「放出」細胞內的代謝物而不影響代謝組成，在特別是要分析細胞內代謝物的情況下是合乎需要的。特別是，對於懸浮細胞，淬滅方法是關鍵的。因此，本發明還涉及淬滅包含細胞物質的生物樣品的方法，所述方法包括以下步驟a)提供包含由包含丙二醇或乙二醇的預先冷卻的淬滅溶液組成的下層相、由惰性相分離劑組成的疏水的中間相、和由生物樣品組成的上層相的離心瓶，其中下層相比中間相具有更高的密度，且中間相比上層相具有更高的密度，和b)使該瓶離心以使生物樣品所包含細胞物質從上層相轉移至下層相。優選地，丙二醇是或包含1，2_丙二醇。還優選地，惰性相分離劑是包含密度1. 01 < P 60° 至-80°C、-65°C至-80"C、-70"C至-80"C，更優選地，溫度是 -70 °C、-71 °C、-72 °C、-73 °C、-74°C、-75 °C、-76 °C、-77 °C、-78 °C、-79 °C、或-80 °C。此外，在上述方法的另一個優選的實施方案中，在離心後從疏水性的中間相去除上層水相併將同位素標記的標準物質加入到下層相。將所述的同位素標記的標準物質應用於回收率的測定和涉及本發明方法的各個實驗的比較。優選地，同位素標記的標準物質是優選微生物細胞、更優選來自於酵母或細菌培養物的細胞提取物，它們在存在同位素標記的底物和/或同位素標記的銨鹽的人工培養基中生長。底物優選用1V標記。優選地，同位素標記的底物是被均勻標記的U13C-葡萄糖或U13C-穀氨酸，而銨來源是1N氯化銨或1N硫酸銨。該提取物是特別有利的，因為各種類別的生物上重要的分子都存在於其中，不過卻帶有同位素標記，這可將其與來源於生物樣品中的非標記的形式區分開。因此，能夠以低成本有效地避免考慮到不同類別的分子而如此昂貴並複雜的標準物質的產生。依據步驟i)去除用於保持水相和淬滅溶液相的分離所加入的疏水性中間相。應該理解的是上述的用於淬滅的方法可被優選地應用於上述分析極性代謝物的方法中，特別是在懸浮細胞被作為生物樣品研究的情況下如此。因此，在用於分析極性代謝物的本發明方法的步驟i)之前，依據上述的方法將細胞懸浮液淬滅。在本發明方法的另一個優選的實施方案中，生物樣品是生長在膜上的貼壁細胞的培養物。本文所應用的術語「膜」是指任意固體支持物，其可在不同瓶之間轉移並允許細胞貼壁並在其上生長。合適的膜是本領域已公知的且包括Track edge膜和任意種類適合用於貼壁細胞的培養的親水性或疏水性支持物。更優選地，依據本發明的方法所應用的膜是 Track edge膜。有利地是所述的膜在提取過程中被破壞，因此將貼壁細胞釋放而無須刮、費力的消化或其他幹擾有效淬滅的操作。優選地，在步驟i)之前，通過直接將膜轉移至具有-20至-80°C溫度的如上文所定義的提取緩衝液中而將生長在所述膜上的貼壁細胞的培養物淬滅。對於提取緩衝液而言的特別優選溫度是-25 至-80°C、_30°C至-80°C、-:35°C至 _80°C、_40°C至 _80°C、_45°C 至-80°C、-50°C至-80°C、-55° 至-80°C、60° 至-80°C、_65°C至-80°C、-70°C至 _80°C， 更優選地，溫度是 _70°C、-71°C、-72°C、-73°C、-74°C、-75°C、-76°C、-77°C、-78°C、-79°C、 或-80°C。還優選地，在步驟i)之前，通過直接將膜轉移至液氮中而將生長在所述膜上的貼壁細胞的培養物淬滅。在所述的轉移時，直接應用約-196°C的溫度。通過將膜轉移進入容器並在液氮中冷凍膜並因此應用約-196°C的溫度，可優選地實現轉移。或者，在步驟i)之前將包含貼壁細胞的培養物的膜用清洗緩衝液衝洗以清除膜上源自介質中的細胞外組分。 隨後，如上所述將膜淬滅。在本發明方法的另一個優選的實施方案中，所述的生物樣品是組織樣品。優選地，也在步驟i)之前在-20至-80°C溫度下通過直接冷凍組織而將所述的組淬滅。用於淬滅的特別優選溫度是-25 至-80°C、_30°C至-80°C、-:35°C至 _80°C、_40°C至 _80°C、_45°C 至-80°C、-50°C至-80°C、-55° 至-80°C、60° 至-80°C、_65°C至-80°C、-70°C至 _80°C， 更優選地，溫度是 _70°C、-71°C、-72°C、-73°C、-74°C、-75°C、-76°C、-77°C、-78°C、-79°C、 或-80°C。還優選地，在步驟i)之前，可通過直接將組織轉移至液氮中，例如通過應用約_196°C的溫度，實現所述的淬滅。將上文涉及的所有參考文獻的全部的公開內容以及其在上文明確提及的特定的公開內容引入本文作為參考。附圖


圖1顯示用於分析生物樣品中極性代謝物的方法的工作流程。圖2分別表明ADP和ATP提取率增加兩倍，且輔酶A和乙醯輔酶A的提取率增加 5至12倍，且當所應用的乙酸銨緩衝液的濃度從等滲條件增加至1500mM時，對於煙醯胺二核苷酸提取率增加最多3倍。圖3顯示組織樣品(人胰腺)——5mg稱重樣品的冷凍乾燥的提取物代表性的色譜圖(上面第一個色譜圖(3A)顯示總的XIC(提取離子流色譜圖)(MRM(多反應監測)的 XIC (80 對)87. 0/43. Oamu (原子質量單位)，預期 RT (保留時間)4. 9，ID 肝 26neu wiff 樣品21(10uL-C4)的PYR(焦穀氨酸)(渦輪噴霧))，第二個色譜圖(3B)顯示氧化還原和能量(MRM 的 XIC (80 對)305. 8/143. Oamu，預期 RT 4. 7，ID 26neu wiff 樣品 21 (10uL_C4) 的GSH(穀胱甘肽)(渦輪噴霧))，第三個色譜圖(3C)顯示TCA(三羧酸循環)(MRM的XIC(80 對)191. 0/73. Oamu，預期 RT 9. 7，ID 肝 26neu wiff 的樣品 21 (10uL_C4)的 ISOCIT (渦輪噴霧))，第四個色譜圖(3D)顯示糖酵解(MRM的XIC(80對)169. 0/97. Oamu，預期RT 6. 6，ID 肝^neu wiff的樣品21 (10uL_C4)的DHAP (磷酸二羥丙酮)(渦輪噴霧))。強度 (cps)在y_軸顯示，保留時間(分鐘，min)在χ-軸顯示。圖4顯示基於實測的細胞內的U13C葡萄糖/U12C-葡萄糖的比率的在極性代謝物提取物中U13C的相對富集量；(A)常規淬滅方法，(B)通過密度離心淬滅。現在通過下文的實施例闡述本發明，該實施例並非意在限制本發明的範圍。
實施例實施例1 淬滅和提取a)細胞懸浮液將350 μ L 1，2-丙二醇加入到許多預裝填了 5個鋼珠並冷卻至_80°C提取瓶中。 此後，在_80°C貯存前在每個瓶中加入350 μ L矽油直到下一步應用。將1毫升典型體積的細胞水懸浮液小心加至油層上部且立即將樣品在15000*g和0°C離心2分鐘。然後，直接將樣品放置在乾冰上並去除上層相。此後，加入包含有1. 5M乙酸銨的水溶液的提取緩衝液
)、同位素標記的細胞提取物)和二氯甲烷(_80°C )。在低溫條件下經過珠磨過程在一步20秒內可實現細胞破裂、蛋白質變性和代謝物提取(應用!^astft 印M設備，MP生物醫學公司)。在上述的條件下經過離心完成相分離。為了完全去除任何細胞碎片，應用上述的條件通過0. 2 μ m過濾材料經旋轉過濾將上層的極性相濾過。濾液部分用水稀釋，冷凍在-80°C，並隨後冷凍乾燥。b)貼壁細胞培養物將結合具有膜底部的插入物的培養皿用於培養貼壁細胞系(例如=Tracked edge 膜，Nunc公司)。為進行細胞取樣，將膜剖離並轉移至預裝填了五個鋼珠和二氯甲烷和乙醇 2 1混合物(_80°C )的提取瓶中。為進行提取，加入1. 5M乙酸銨的水溶液)和同位素標記的細胞提取物G°C)。應用a)中所述的相同的珠磨程序，將細胞和膜完全破碎。應用a)中所述的離心條件去除蛋白質、細胞碎片和膜殘留物並將樣品分離成上層、極性相和下層、非極性相。收集上層相併按照a)所述進行後續操作。c)組織樣品為進行組織取樣，直接將組織冷凍在液氮溫度並隨後冷凍乾燥。隨後，用二氯甲烷
10和乙醇2 1的混合物(_80°C )覆蓋3-5mg的乾燥組織。最後，加入1. 5M乙酸銨的水溶液 (4°C )和同位素標記的細胞提取物)。樣品按照b)所述進行後續操作。實施例2 同位素標記的細胞提取物的產生在產朊假絲酵母(Candida utilis)(保藏在DSMZ sp. 2361)的酵母培養物在搖瓶中在不合胺基酸的YNB (酵母氮源基礎)最小培養基(Sigma)中的U13C-D-葡萄糖(10g/l) 上生長。為了維持需氧條件，利用定軌搖床將瓶子在180rpm，28°C搖動。通過在1000*g和 4°C離心200ml酵母培養物O^lcon管)實現細胞的收集。隨後採用由0. 15M乙酸銨和IOg/ 1 U13C-D-葡萄糖組成的洗滌緩衝液和隨後的離心而洗滌細胞兩次。應用7.5ml2 1 (ν/ ν) 二氯甲烷/乙醇溶液(_80°C )淬滅細胞沉澱物。通過加入2. 5ml 1. 5M乙酸銨的水溶液至所淬滅的樣品中在如a)中所述的低溫條件下進行提取。在提取後，在如a)所述的條件下將樣品離心並收集包含U13C-標記的代謝物的上層相併儲存在_80°C直至下一步應用。實施例3 色譜法分離應用超高壓離子對液相色譜IP-UPLC對磷酸化的和/或羧化的極性代謝物進行色譜分離。用溶劑A(去離子水)和溶劑B(50%乙腈，50%水(ν/ν))進行色譜梯度洗脫，而保持恆定的柱流速0. 4mL/min和柱溫45°C。將揮發性的添加劑三丁基胺加入到兩個洗脫劑中並且應用冰乙酸將PH值調節至6. 2以得到形成離子對的三丁基銨陽離子。將冷凍乾燥的樣品溶解在小體積的洗脫劑A中，然後將1至20μ L的提取物進樣。實施例4:質譜應用負離子模式電噴霧串聯質譜(-ESI-MSMS)評價由UPLC分離的極性代謝物。依據稱為的預定或選擇多反應監測的模式(sMRM)操作串聯MSMS，而用單位解析度進行的特定的質量調節(unique mass adjustments)是確定的。通過不同的質量信號區分各個代謝物的同位素標記的和未標記的形式。實施例5 通過應用高濃度的揮發性提取緩衝液增加提取率實施例5證明通過應用高濃度的揮發性乙酸銨緩衝液用於細胞組織的提取增加了若干代謝物的提取率。在隨後的冷凍乾燥步驟中去除所加入的揮發性緩衝液，而不易揮發的磷酸化代謝物被保留。因此，與常規的條件相比，使細胞組織接觸高鹽緩衝液使得許多與蛋白質結合的代謝物更大程度地釋放出來。該發現對於樣品中低豐度的代謝物具有特別重要的意義。除此之外，增加煙醯胺類(nicotineamides)的提取率大大影響了 NADPH的氧化形式和還原形式之間的比率，其用於指示細胞或樣品中提供的還原當量(圖2)。實施例6 代表性的色譜圖實施例6說明了冷凍乾燥組織的代表性的色譜圖。在低溫條件下提取前，用 U13C-標記的酵母提取物修正(amend) 5mg幹樣品。圖3顯示通過負模式ESI-MSMS應用預定多反應監測的測定的70個質量信號(mass trace)(標記的/未標記的)的色譜圖。根據樣品的天然豐度或標記的酵母，質量豐度的範圍包括三個數量級。除了總模式(XIC)之夕卜，描述了三個廣泛質量提取物，其分別用於指示能量代謝、三羧酸循環(TCA)和糖酵解。實施例7 通過由密度梯度離心的淬滅提高對酶活性的抑制使產朊假絲酵母培養物(sp. 2361)在應用IOg L-I未標記的D-葡萄糖的YNB培養基中生長，並在光學密度4.0 (600nm，Icm光通過)時收集。為了評價由於淬滅方法所導致的偏差，將培養物
(A)迅速地通過0. 2 μ m過濾器，並在通過冷溶劑淬滅前，用含IOg L-1U13C-標記的D-葡萄糖的150mM乙酸銨緩衝液洗滌，和(B)通過應用密度梯度離心方法直接淬滅，而用等量的U13C-D-葡萄糖修正 (amend) 1,2-丙二醇相。應用標準的淬滅方法(例如過濾和快速細胞洗滌)，糖酵解中間體、兩種三羧酸循環的酸及戊糖磷酸途徑的代謝物呈現顯著的13C富集。相反地，通過所述新的密度梯度方法淬滅所述酵母細胞，在糖酵解的及其他的中間體中不存在13C富集根本上證實了糖酵解酶完全失活(圖4)。
權利要求
1.用於分析極性代謝物的方法，其包括i)在允許直接破壞生物樣品所包含的細胞的條件下，用包含相分離劑和揮發性中性銨鹽的提取緩衝液提取生物樣品， )通過色譜法分離步驟i)中所獲得的提取物所包含的極性代謝物，和iii)分析步驟ii)中所獲得的分離的極性代謝物。
2.權利要求1的方法，其中所述的相分離劑包含二氯甲烷。
3.權利要求1或2的方法，其中所述的揮發性銨鹽是乙酸銨、甲酸銨或碳酸氫銨。
4.權利要求1至3中任意一項的方法，其中所述的揮發性中性銨鹽的濃度至少為 0. 5M。
5.權利要求1至4中任意一項的方法，其中步驟i)中所述的提取生物樣品在-20 至_80°C的提取溫度進行。
6.權利要求1至5中任意一項的方法，其中在步驟ii)之前通過下面的步驟處理所述提取物a)將水相旋轉離心，b)將步驟a)中所獲得的上清液冷凍乾燥，和c)將步驟b)中所獲得的冷凍乾燥物溶解在包含離子對生成劑的分析緩衝液中。
7.權利要求1至6中任意一項的方法，其中所述的離子對生成劑是三丁基銨陽離子、三乙基銨陽離子、三丙基銨陽離子或正己基銨陽離子。
8.權利要求1至7中任意一項的方法，其中所述的色譜法是UPLC或HPLC。
9.權利要求1至8中任意一項的方法，其中所述的分析步驟iii)中所獲得的分離的極性代謝物包括質譜法。
10.權利要求9的方法，其中質譜法是ESI-MS/MS。
11.權利要求1至10中任意一項的方法，其中所述的生物樣品是細胞懸浮液。
12.用於淬滅包含細胞物質的生物樣品的方法，所述方法包括以下步驟a)提供包含由包含丙二醇或乙二醇的淬滅溶液組成的下層相、由惰性相分離劑組成的中間相、和由生物樣品組成的上層相的離心瓶，其中下層相比中間相具有更高的密度，且中間相比上層相具有更高的密度，和b)使該瓶離心以使生物樣品所包含細胞物質從上層相轉移至下層相。
13.權利要求12的方法，其中所述的下層相具有-20至_80°C的溫度。
14.權利要求12或13的方法，其中在離心後從下層相中去除上清液並將同位素標記的標準物質加入到下層相。
15.權利要求11的方法，其中，在步驟i)之前，如權利要求12至14中任意一項所定義的那樣將所述細胞懸浮液淬滅。
16.權利要求1至10中任意一項的方法，其中所述的生物樣品是生長在膜上的貼壁細胞的培養物。
17.權利要求16的方法，其中，在步驟i)之前，通過直接將膜轉移至具有-20至-80°C 溫度的如權利要求1至4中任意一項所定義的提取緩衝液中而將生長在所述膜上的貼壁細胞的培養物淬滅。
18.權利要求16的方法，其中，在步驟i)之前，通過直接將膜轉移至液氮中而將生長在所述膜上的貼壁細胞的培養物淬滅。
19.權利要求1至10中任意一項的方法，其中所述的生物樣品是組織樣品。
20.權利要求18的方法，其中，在步驟i)之前，通過直接將組織冷凍至-20至-80°C的溫度或通過應用液氮而將所述組織淬滅。
全文摘要
本發明涉及極性代謝物的分析並提供了用於分析極性代謝物的方法，其包括在允許直接破壞生物樣品所包含的細胞的條件下用包含相分離劑和揮發性中性銨鹽的提取緩衝液提取生物樣品，通過色譜法分離提取物所包含的極性代謝物，並分析所分離的極性代謝物。此外，本發明還涉及用於淬滅包含細胞物質的生物樣品的方法。
文檔編號G01N30/02GK102472741SQ201080030208
公開日2012年5月23日 申請日期2010年7月7日 優先權日2009年7月8日
發明者G·巴爾克, M·多斯特勒, R·洛塞, S·卡瓦略, T·B·沃克 申請人:巴斯夫植物科學有限公司