一種埃博黴素b的發酵生產工藝的製作方法

2023-07-05 05:19:21

專利名稱：一種埃博黴素b的發酵生產工藝的製作方法
技術領域：
本發明屬於埃博黴素B的生產技術領域，涉及一種埃博黴素B的發酵生產工藝。
背景技術：
埃博黴素B (Epothilone B)是粘細菌纖維堆囊菌(Sorangium cellulosum)產生的一種聚酮次級代謝產物，它與臨床上廣泛應用的抗腫瘤化療藥物紫杉醇具有相同的穩定微管活性，且對紫杉醇耐藥的腫瘤細胞具有活性。另外埃博黴素來源於微生物代謝產物的特徵使其被人們認為是一種比紫杉醇類藥物更具市場前途的抗癌藥物。埃博黴素的發現可以追溯到上世紀八十年代德國國家生物技術研究中心(GBF) 的微生物學家對土壤中粘細菌的大量研究工作。1987年他們在尋找抗真菌藥物時發現了一株粘細菌(Sorangium cellulosum So ce90)能產生一類具有微弱抗真菌活性的大環內酯類化合物，命名為Epothilone (埃博黴素)。當時這個化合物並沒有引起研究人員的重視。 1995年默克實驗室的研究人員發現了埃博黴素具有和紫杉醇類似的促微管聚合活性。從此，埃博黴素以其比紫杉醇更好的水溶性，更簡單的結構，對紫杉醇抗性腫瘤細胞的高活性以及可以通過微生物發酵製備而迅速成為繼紫杉醇之後發現的促微管聚合化合物中最令人興奮的研究熱點。目前諾華、施貴寶、默克、羅氏等大型跨國製藥公司都在埃博黴素藥物的臨床研究上投入了大量的人力物力，美國FDA於2007年10月16日批准施貴寶公司的埃博黴素產品(Ixab印ilone，BMS-247550, IxempraTM，「伊沙匹隆」)單用或與卡培他濱合用治療對其他化療藥物無效的轉移性或局部晚期乳腺癌。預期未來將有多種埃博黴素藥物上市。與臨床研究相比，埃博黴素的生產技術遠遠落後。其主要的瓶頸在於發酵產量低， 粘細菌發酵製備埃博黴素的產量僅在mg/L發酵液水平。其中有兩個重要原因，第一是埃博黴素對生產菌株的毒性和反饋抑制作用較大程度導致埃博黴素發酵產量很難提高；第二個導致埃博黴素生產成本高的原因是發酵結束後產物中存在大量埃博黴素同系物，導致目標產物分離純化成本非常高。如何提高埃博黴素的發酵產量，降低生產成本成為目前埃博黴素藥物研發的一個重要方向。

發明內容
本發明解決的問題在於提供一種埃博黴素B的發酵生產工藝，提高埃博黴素B的發酵生產能力，降低生產成本。本發明是通過以下技術方案來實現一種埃博黴素B的發酵生產工藝，包括以下步驟1)按IOOml接種1 IOmg菌種的比例，將纖維堆囊菌(Sorangium cellulosum) 接種於發酵液中，然後加入菌種質量100 800倍的特異性吸附埃博黴素B的分子印跡聚合物，在25 :35°C下搖床發酵96 192h ；2)發酵完成後，分離並收集發酵液中的吸附了埃博黴素B的分子印跡聚合物，然後用甲醇多次萃取，將埃博黴素B從分子印跡聚合物中分離出來，分別收集含有埃博黴素B 的甲醇和分子印跡聚合物。所述的發酵液中含有黃豆粉20 50g/L、玉米澱粉5 10g/L、磷酸二氫鈉1 2g/L、磷酸氫二鈉 1 2g/L、MgS04 ·7Η20 2 5g/L、FeSO4 · 7Η20 0· 1 0. 5g/L、CaCl2 2 5g/L、MnCl2 0. 1 0. 5g/L 和葡萄糖 10 15g/L, pH 為 7. 2 7. 5。在發酵培養時還進行葡萄糖的補加在發酵培養的第1 4 每隔30min按每 IOOml發酵液加入0. 05 0. 2g葡萄糖的比例補加，在第48h至發酵結束每隔10 15min 按每IOOml發酵液加入0. 1 0. 4g葡萄糖的比例補加。所述的發酵液中還含有土豆澱粉、葡聚糖、甘露糖中的一種，其含量為5 10g/L ；所述的發酵液中還含有蛋白腖、水解乳蛋白、玉米蛋白粉、黃豆粉、KN03、NH4SO4中的一種作為氮源，氮源的含量為2 8g/L。所述的分子印跡聚合物的製備為按照埃博黴素B:功能單體交聯劑引發劑溶劑=1 0 6) (20 30) (0.6 1) (3 20)的摩爾比，將上述反應原料加入到反應容器中，在保護氣氛下超聲振蕩20 30min，在攪拌下通入氮氣20 30min ；然後在45 55°C下聚合反應12 24h,再在55 65°C下聚合反應8 12h ；聚合反應完成後將反應產物破碎、研磨、過篩後得到粒徑為40 60 μ m的聚合反應物；所述的功能單體為甲基丙烯酸；所述的交聯劑為乙二醇二甲基丙烯酸酯；將收集的聚合反應物用水充分洗滌後，然後用乙酸甲醇體積比=1 9 3 7 的混合溶液連續洗滌，脫去埃博黴素B，冷凍乾燥後得到埃博黴素B的分子印跡聚合物。所述的引發劑為偶氮二異丁腈或過氧化二苯甲醯；所述的溶劑為去離子水、甲醇或乙腈。所述的搖床的轉速為100 160r/min。所述的纖維堆囊菌(Sorangiumeellulosum)為 ATCC15384、ATCC25569 或 ATCC25531。所述的纖維堆囊菌(Sorangium cellulosum)為經過理化誘變、原生質體融合或 Genome shuffling改造而篩選到的高產菌株。與現有技術相比，本發明具有以下有益的技術效果本發明提供的埃博黴素B的發酵生產工藝，通過以下改進1)添加特異性吸附埃博黴素B的分子印跡聚合物；幻對培養基的改進，包括對碳源、氮源的組合；幻葡萄糖的脈衝式的補加以消除葡萄糖抑制效應；更進一步還可以對纖維堆囊菌進行理化誘變、雜交或原生質體融合而篩選到的高產菌株，從而提高埃博黴素B的產量。在埃博黴素B發酵生產時添加特異性吸附埃博黴素B的分子印跡聚合物，這樣在發酵時分子印跡聚合物在達到吸附平衡之前將持續的吸附發酵時產生的埃博黴素B，解決了埃博黴素B發酵時的反饋抑制作用，實現連續液體發酵生產埃博黴素B ；另一方面，埃博黴素B被分子印跡聚合物吸附，也有利於其在發酵產物中的分離，只要離心分離收集作為沉澱的分子印跡聚合物，就可以將其從發酵液中分離，然後再從分子印跡聚合物將埃博黴素B萃取出來就可以了，而分子印跡聚合物經過乾燥處理還可以重複使用。在添加分子印跡聚合物和葡萄糖的脈衝式的補加以後，埃博黴素B的產量達到了48mg/L，與目前的發酵生產水平O^ig/L)相比提高了 1倍。而培養基的進一步優化可分別取一種碳源，一種氮源和共有成分組成液體培養基，分析各個培養基的發酵產量，優選出最優碳源和氮源。


圖1為改進工藝後的埃博黴素B產量分析的HPLC譜圖。
具體實施例方式本發明通過在進行發酵時將添加作為吸附劑的分子印跡聚合物，以便於埃博黴素 B的連續生產和分離，以及培養基和葡萄糖補充兩個方面的改進，以提高埃博黴素B產量。 下面結合具體的實施例對本發明做進一步的詳細說明，所述是對本發明的解釋而不是限定。實施例1分子印跡聚合物的製備及埃博黴素B的發酵，包括以下步驟1)分子印跡聚合物的製備按以下比例將埃博黴素B lmmol、甲基丙烯酸4mmol，乙二醇二甲基丙烯酸酯 20mmol，偶氮二異丁氰10mg，乙腈3ml混合裝入反應管，通氮排氧30min，在氮氣保護下將反應管封口，置於50°C水浴中聚合M小時，再於60°C水浴中聚合12小時得到聚合反應產物；將得到的反應產物破碎、研磨、過篩得到粒徑40-60 μ m的聚合物顆粒；將得到的聚合物顆粒於用水洗滌後，再用乙酸甲醇(體積比1 9)混合溶液中通過索氏萃取器抽提48h，達到規定的萃取時間後再用甲醇抽提二次，每次12h，印跡聚合物真空冷凍乾燥(溫度-20°C、壓力20Pa)得到埃博黴素B分子印跡聚合物吸附劑。2)埃博黴素B的發酵將製備得到的分子印跡聚合物作為吸附劑，按發酵液的體積/接種纖維堆囊菌 ATCC25531細胞乾重/分子印跡聚合物的質量=100ml/10mg/3g的用量投入到埃博黴素B 的發酵液中；發酵液的組成為黃豆粉20g/L，玉米澱粉5g/L，磷酸二氫鈉2g/L，磷酸氫二鈉2g/ L, MgSO4 · 7H20 5g/L, FeSO4 · 7H20 0. lg/L, CaCl2 5g/L, MnCl2O. lg/L,葡萄糖 lOg/L, pH7. 2 ；發酵溫度為30°C，發酵搖床轉速為120rpm，發酵時間為96小時；在發酵培養時還進行葡萄糖的補加在發酵培養的第1 4 每隔30min按每 IOOml發酵液加入0. Ig葡萄糖的比例補加，在第4 至發酵結束每隔IOmin按每IOOml發酵液加入0. 2g葡萄糖的比例補加；將上述發酵結束的含有分子印跡聚合物的發酵液置於2500rpm的離心機上分離 30分鐘進行分離分子印跡聚合物，棄去上清液，下層沉澱物即為分離到的含有埃博黴素B 的分子印跡聚合物。3)埃博黴素B的分離埃博黴素B的洗脫採用溶劑萃取法以甲醇作為萃取液，常溫下將含有埃博黴素B的分子印跡聚合物在索氏萃取器中用甲醇重複萃取3次後，再用大量甲醇充分洗滌分子印跡聚合物數次；
含有埃博黴素B的甲醇溶液旋轉蒸發(轉速為lOOrpm，溫度為40°C )回收甲醇， 甲醇重複利用；蒸乾甲醇後獲得剩餘固形物即為埃博黴素B粗品。甲醇洗滌過的埃博黴素B的分子印跡聚合物，經真空乾燥、研磨、過40 60 μ m篩或真空乾燥即可重複使用，能夠保證高效吸附埃博黴素B的使用次數為3次。將含埃博黴素B的甲醇0. 22 μ m微孔濾膜過濾後，作為HPLC分析的樣品，定量分析其產品含量。HPLC分析條件為色譜柱為AT LiCHROM C18反相柱；檢測波長為M9nm ；流動相的製備工藝為取350mL超純水與650mL甲醇混勻，然後用乙酸調pH為4 ；流速為Iml/ min ；進樣量為10 μ L ；埃博黴素B的保留時間為11. 5min。檢測結果如圖1所示，其中埃博黴素B保留時間處峰面積定量分析其含量，結果顯示其含量為獲得埃博黴素B發酵產量為48mg/L。實施例2分子印跡聚合物的製備及埃博黴素B的發酵，包括以下步驟1)分子印跡聚合物的製備按以下比例將埃博黴素B lmmol、甲基丙烯酸3mmol，乙二醇二甲基丙烯酸酯 25mmol，偶氮二異丁氰10mg，甲醇8ml混合裝入反應管，通氮排氧30min，在氮氣保護下將反應管封口，置於45°C水浴中聚合M小時，再於65°C水浴中聚合12小時得到聚合反應產物；將得到的反應產物破碎、研磨、過篩得到粒徑40-60 μ m的聚合物顆粒；將得到的聚合物顆粒於用水洗滌後，再用乙酸甲醇(體積比3 7)混合溶液中通過索氏萃取器抽提48h，達到規定的萃取時間後再用甲醇抽提二次，每次12h，印跡聚合物真空冷凍乾燥(溫度-20°C、壓力20Pa)得到埃博黴素B分子印跡聚合物吸附劑。2)埃博黴素B的發酵將製備得到的分子印跡聚合物作為吸附劑，按發酵液的體積/接種纖維堆囊菌 ATCC15384細胞乾重/分子印跡聚合物的質量=100ml/5mg/2g的用量投入到埃博黴素B的發酵液中；發酵液的組成為黃豆粉10g/L，10g/L 土豆澱粉，玉米澱粉5g/L，蛋白腖5g/L，磷酸二氫鈉 lg/L，磷酸氫二鈉 lg/L，MgSO4 · 7H20 3g/L，FeSO4 · 7H20 0. 5g/L，CaCl2 2g/L，MnCl2 0. 5g/L，葡萄糖 lOg/L, pH7. 2 ；發酵溫度為30°C，發酵搖床轉速為120rpm，發酵時間為96小時；在發酵培養時還進行葡萄糖的補加在發酵培養的第1 4 每隔30min按每 IOOrnl發酵液加入0. 05g葡萄糖的比例補加，在第4 至發酵結束每隔IOmin按每100ml發酵液加入0. Ig葡萄糖的比例補加。將上述發酵結束的含有分子印跡聚合物的發酵液置於2500rpm的離心機上分離 30分鐘進行分離分子印跡聚合物，棄去上清液，下層沉澱物即為分離到的含有埃博黴素B 的分子印跡聚合物。3)埃博黴素B的分離埃博黴素B的洗脫採用溶劑萃取法以甲醇作為萃取液，常溫下將含有埃博黴素B的分子印跡聚合物在索氏萃取器中用甲醇重複萃取3次後，再用大量甲醇充分洗滌分子印跡聚合物數次；含有埃博黴素B的甲醇溶液旋轉蒸發(轉速為lOOrpm，溫度為40°C)回收甲醇，甲醇重複利用；蒸乾甲醇後獲得剩餘固形物即為埃博黴素B粗品。甲醇洗滌過的埃博黴素B的分子印跡聚合物，經真空乾燥、研磨、過40 60 μ m篩或真空乾燥即可重複使用。實施例3分子印跡聚合物的製備及埃博黴素B的發酵，包括以下步驟1)分子印跡聚合物的製備按以下比例將埃博黴素B Immol、甲基丙烯酸3. 5mmol,乙二醇二甲基丙烯酸酯 30mmol，偶氮二異丁氰5mg，乙腈3ml混合裝入反應管，通氮排氧30min，在氮氣保護下將反應管封口，置於50°C水浴中聚合M小時，再於60°C水浴中聚合12小時得到聚合反應產物；將得到的反應產物破碎、研磨、過篩得到粒徑40-60 μ m的聚合物顆粒；將得到的聚合物顆粒於用水洗滌後，再用乙酸甲醇(體積比3 7)混合溶液中通過索氏萃取器抽提48h，達到規定的萃取時間後再用甲醇抽提二次，每次12h，印跡聚合物真空冷凍乾燥(溫度-20°C、壓力20Pa)得到埃博黴素B分子印跡聚合物吸附劑。2)埃博黴素B的發酵將製備得到的分子印跡聚合物作為吸附劑，按發酵液的體積/接種纖維堆囊菌 ATCC25569細胞乾重/分子印跡聚合物的質量=100ml/5mg/2g的用量投入到埃博黴素B的發酵液中；發酵液的組成為黃豆粉10g/L，10g/L葡聚糖，玉米澱粉5g/L，NH4S045g/L,磷酸二氫鈉 lg/L，磷酸氫二鈉 lg/L，MgSO4 · 7H20 3g/L，FeSO4 · 7Η200· 5g/L，CaCl2 2g/L，MnCl2 0. 5g/L，葡萄糖 lOg/L, pH7. 2 ；在發酵培養時還進行葡萄糖的補加在發酵培養的第1 4 每隔30min按每 IOOml發酵液加入0. Ig葡萄糖的比例補加，在第4 至發酵結束每隔15min按每IOOml發酵液加入0. 4g葡萄糖的比例補加。發酵溫度為30°C，發酵搖床轉速為120rpm，發酵時間為96小時；將上述發酵結束的含有分子印跡聚合物的發酵液置於2500rpm的離心機上分離 30分鐘進行分離分子印跡聚合物，棄去上清液，下層沉澱物即為分離到的含有埃博黴素B 的分子印跡聚合物。3)埃博黴素B的分離埃博黴素B的洗脫採用溶劑萃取法以甲醇作為萃取液，常溫下將含有埃博黴素B的分子印跡聚合物在索氏萃取器中用甲醇重複萃取3次後，再用大量甲醇充分洗滌分子印跡聚合物數次；含有埃博黴素B的甲醇溶液旋轉蒸發(轉速為lOOrpm，溫度為40°C)回收甲醇，甲醇重複利用；蒸乾甲醇後獲得剩餘固形物即為埃博黴素B粗品，獲得埃博黴素B發酵產量為52mg/L。甲醇洗滌過的埃博黴素B的分子印跡聚合物，經真空乾燥、研磨、過40 60 μ m篩或真空乾燥即可重複使用。實施例4分子印跡聚合物的製備及埃博黴素B的發酵，包括以下步驟1)分子印跡聚合物的製備按以下比例將埃博黴素B Immol、甲基丙烯酸3. 5mmol,乙二醇二甲基丙烯酸酯30mmol，偶氮二異丁氰5mg，甲醇3ml混合裝入反應管，通氮排氧30min，在氮氣保護下將反應管封口，置於50°C水浴中聚合M小時，再於60°C水浴中聚合12小時得到聚合反應產物；將得到的反應產物破碎、研磨、過篩得到粒徑40-60 μ m的聚合物顆粒；將得到的聚合物顆粒於用水洗滌後，再用乙酸甲醇(體積比1 9)混合溶液中通過索氏萃取器抽提48h，達到規定的萃取時間後再用甲醇抽提二次，每次12h，印跡聚合物真空冷凍乾燥(溫度-20°C、壓力20Pa)得到埃博黴素B分子印跡聚合物吸附劑。2)埃博黴素B的發酵將製備得到的分子印跡聚合物作為吸附劑，按發酵液的體積/接種纖維堆囊菌 ATCC25531細胞乾重/分子印跡聚合物的質量=100ml/lmg/4g的用量投入到埃博黴素B的發酵液中；發酵液的組成為黃豆粉10g/L，10g/L甘露糖，玉米澱粉5g/L，蛋白腖5g/L，磷酸二氫鈉 lg/L，磷酸氫二鈉 lg/L，MgSO4 · 7H20 3g/L，FeSO4 · 7Η200· 5g/L，CaCl2 2g/L，MnCl2 0. 5g/L，葡萄糖 lOg/L, pH7. 2 ；發酵溫度為35°C，發酵搖床轉速為IOOrpm，發酵時間為192小時；在發酵培養時還進行葡萄糖的補加在發酵培養的第1 4 每隔30min按每 IOOml發酵液加入0. 05g葡萄糖的比例補加，在第4 至發酵結束每隔15min按每IOOml發酵液加入0. 4g葡萄糖的比例補加。將上述發酵結束的含有分子印跡聚合物的發酵液置於2500rpm的離心機上分離 30分鐘進行分離分子印跡聚合物，棄去上清液，下層沉澱物即為分離到的含有埃博黴素B 的分子印跡聚合物。3)埃博黴素B的分離埃博黴素B的洗脫採用溶劑萃取法以甲醇作為萃取液，常溫下將含有埃博黴素B的分子印跡聚合物在索氏萃取器中用甲醇重複萃取3次後，再用大量甲醇充分洗滌分子印跡聚合物數次；含有埃博黴素B的甲醇溶液旋轉蒸發(轉速為lOOrpm，溫度為40°C)回收甲醇，甲醇重複利用；蒸乾甲醇後獲得剩餘固形物即為埃博黴素B粗品，獲得埃博黴素B發酵產量為50mg/L。甲醇洗滌過的埃博黴素B的分子印跡聚合物，經真空乾燥、研磨、過40 60 μ m篩或真空乾燥即可重複使用。實施例5分子印跡聚合物的製備及埃博黴素B的發酵，包括以下步驟1)分子印跡聚合物的製備按以下比例將埃博黴素B lmmol、甲基丙烯酸2mmol，乙二醇二甲基丙烯酸酯 20mmol，偶氮二異丁氰5mg，含甲醇20%的去離子水3ml混合裝入反應管，通氮排氧30min， 在氮氣保護下將反應管封口，置於50°C水浴中聚合M小時，再於60°C水浴中聚合12小時得到聚合反應產物；將得到的反應產物破碎、研磨、過篩得到粒徑40-60 μ m的聚合物顆粒；將得到的聚合物顆粒於用水洗滌後，再用乙酸甲醇(體積比2 8)混合溶液中通過索氏萃取器抽提48h，達到規定的萃取時間後再用甲醇抽提二次，每次12h，印跡聚合物真空冷凍乾燥(溫度-20°C、壓力20Pa)得到埃博黴素B分子印跡聚合物吸附劑。
2)埃博黴素B的發酵發酵菌株的Genome shuffling改造利用纖維堆囊菌ATCC25569作為起始菌株， 理化工藝誘變篩選高產埃博黴素B菌株3-6株，利用纖維堆囊菌原生質體融合體系，獲得誘變高產菌株的融合雜種，並且融合雜種和誘變高產菌株回交4-5次，通過雜交菌株後代選擇、產量分析和基因組鑑定，可獲得高產埃博黴素B shuffling改造菌株；將製備得到的分子印跡聚合物作為吸附劑，按發酵液的體積/接種纖維堆囊菌 ATCC25569Genome shuffling改造菌株乾重/分子印跡聚合物的質量=100ml/2mg/8g的用量投入到埃博黴素B的發酵液中；發酵液的組成為黃豆粉10g/L，土豆澱粉10g/L，玉米蛋白粉5g/L，KNO3 5g/L，磷酸二氫鈉 lg/L，磷酸氫二鈉 lg/L，MgSO4 · 7H20 3g/L，FeSO4 · 7H20 0. 5g/L，CaCl2 2g/L，MnCl2 0. 5g/L，葡萄糖 lOg/L, pH7. 2 ；發酵溫度為^°C，發酵搖床轉速為120rpm，發酵時間為120小時；在發酵培養時還進行葡萄糖的補加在發酵培養的第1 4 每隔30min按每 IOOml發酵液加入0. Ig葡萄糖的比例補加，在第4 至發酵結束每隔15min按每IOOml發酵液加入0. 2g葡萄糖的比例補加。將上述發酵結束的含有分子印跡聚合物的發酵液置於2500rpm的離心機上分離 30分鐘進行分離分子印跡聚合物，棄去上清液，下層沉澱物即為分離到的含有埃博黴素B 的分子印跡聚合物。3)埃博黴素B的分離埃博黴素B的洗脫採用溶劑萃取法以甲醇作為萃取液，常溫下將含有埃博黴素B的分子印跡聚合物在索氏萃取器中用甲醇重複萃取3次後，再用大量甲醇充分洗滌分子印跡聚合物數次；含有埃博黴素B的甲醇溶液旋轉蒸發(轉速為lOOrpm，溫度為40°C )回收甲醇，甲醇重複利用；蒸乾甲醇後獲得剩餘固形物即為埃博黴素B粗品，獲得埃博黴素B發酵產量為58mg/L。甲醇洗滌過的埃博黴素B的分子印跡聚合物，經真空乾燥、研磨、過40 60 μ m篩或真空乾燥即可重複使用。
權利要求
1.一種埃博黴素B的發酵生產工藝，其特徵在於，包括以下步驟1)按IOOml接種1 IOmg菌種的比例，將纖維堆囊菌(Sorangiumcellulosum)接種於發酵液中，然後加入菌種質量100 800倍的特異性吸附埃博黴素B的分子印跡聚合物， 在25 35°C下搖床發酵96 19 ；2)發酵完成後，分離並收集發酵液中的吸附了埃博黴素B的分子印跡聚合物，然後用甲醇多次浸提，將埃博黴素B從分子印跡聚合物中分離出來，分別收集含有埃博黴素B的甲醇和分子印跡聚合物。
2.如權利要求1所述的埃博黴素B的發酵生產工藝，其特徵在於，所述的發酵液中含有黃豆粉20 50g/L、玉米澱粉5 10g/L、磷酸二氫鈉1 2g/L、磷酸氫二鈉1 2g/L、 MgSO4 ·7Η202 5g/L、FeS04 ·7Η20 0· 1 0. 5g/L、CaCl2 2 5g/L、MnCl2 0· 1 0. 5g/L 禾口葡萄糖10 15g/L，pH為7. 2 7. 5。
3.如權利要求1或2所述的埃博黴素B的發酵生產工藝，其特徵在於，在發酵培養時還進行葡萄糖的補加在發酵培養的第1 4 每隔30min按每IOOml發酵液加入0. 05 0. 2g葡萄糖的比例補加，在第48h至發酵結束每隔10 15min按每IOOml發酵液加入 0. 1 0. 4g葡萄糖的比例補加。
4.如權利要求2所述的埃博黴素B的發酵生產工藝，其特徵在於，所述的發酵液中還含有土豆澱粉、葡聚糖、甘露糖中的一種，其含量為5 10g/L ；所述的發酵液中還含有蛋白腖、水解乳蛋白、玉米蛋白粉、ΚΝ03、ΝΗ4504ψ的一種作為氮源，氮源的含量為2 8g/L。
5.如權利要求1所述的埃博黴素B的發酵生產工藝，其特徵在於，所述的分子印跡聚合物的製備為按照埃博黴素B:功能單體交聯劑引發劑溶劑=1 0 6) (20 30) (0.6 1) (3 20)的摩爾比，將上述反應原料加入到反應容器中，在攪拌下通入氮氣20 30min ；然後在45 55°C下聚合反應12 Mh，再在55 65°C下聚合反應 8 12h ；聚合反應完成後將反應產物破碎、研磨、過篩後得到粒徑為40 60 μ m的聚合反應物；所述的功能單體為甲基丙烯酸；所述的交聯劑為乙二醇二甲基丙烯酸酯；收集的聚合反應物並用水充分洗滌後，然後用乙酸甲醇體積比=1 9 3 7的混合溶液浸提多次，脫去埃博黴素B，冷凍乾燥後得到埃博黴素B的分子印跡聚合物。
6.如權利要求5所述的埃博黴素B的發酵生產工藝，其特徵在於，所述的引發劑為偶氮二異丁腈或過氧化二苯甲醯；所述的溶劑為去離子水、甲醇或乙腈。
7.如權利要求5所述的埃博黴素B的發酵生產工藝，其特徵在於，所述的搖床的轉速為 100 160r/min。
8.如權利要求1所述的埃博黴素B的發酵生產工藝，其特徵在於，所述的纖維堆囊菌 (Sorangium cellulosum)為 ATCC15384、ATCC25569 或ATCC25531。
9.如權利要求1所述的埃博黴素B的發酵生產工藝，其特徵在於，所述的纖維堆囊菌 (Sorangium cellulosum)為經過理化誘變、雜交、原生質體融合或Genome shuffling改造而篩選到的高產菌株。
10.一種埃博黴素B的分子印跡聚合物的製備方法，其特徵在於，包括以下步驟按照埃博黴素B:功能單體交聯劑引發劑溶劑=1 0 6) (20 30) (0.6 1) (3 20)的摩爾比，將上述反應原料加入到反應容器中，在保護氣氛下超聲振蕩20 30min，在攪拌下通入氮氣20 30min ；然後在45 55°C下聚合反應12 24h,再在55 65°C下聚合反應8 12h ；聚合反應完成後將反應產物破碎、研磨、過篩後得到粒徑為40 60 μ m的聚合反應物；所述的功能單體為甲基丙烯酸；所述的交聯劑為乙二醇二甲基丙烯酸酯；所述的引發劑為偶氮二異丁腈或過氧化二苯甲醯；所述的溶劑為去離子水、甲醇或乙腈；將收集的聚合反應物用水充分洗滌後，然後用乙酸甲醇體積比=1 9 3 7的混合溶液連續洗滌，脫去埃博黴素B，冷凍乾燥後得到埃博黴素B的分子印跡聚合物。
全文摘要
本發明公開了一種埃博黴素B的發酵生產工藝，即提高埃博黴素B生產菌株纖維堆囊菌的埃博黴素B發酵產量的工藝。該工藝包括1)發酵過程中埃博黴素B分子印跡聚合物吸附劑的添加；2)適合纖維堆囊菌產生的黃豆粉、玉米澱粉等的選定；3)發酵過程中葡萄糖脈衝添加等步驟，從而使得埃博黴素B的纖維堆囊菌發酵生產產量達到50mg/L的水平。
文檔編號C12P17/18GK102373252SQ20111034609
公開日2012年3月14日 申請日期2011年11月4日 優先權日2011年11月4日
發明者李慧, 陳松, 龔國利 申請人:陝西科技大學