一株絲枝黴菌株及其生產β-葡萄糖苷酶的方法
2023-07-09 16:49:41
一株絲枝黴菌株及其生產β-葡萄糖苷酶的方法
【專利摘要】一株絲枝黴菌株及其生產β-葡萄糖苷酶的方法，屬於食品生物【技術領域】。本發明提供一株新的可產β-葡萄糖苷酶的絲枝黴菌株，該絲枝黴菌株命名為絲枝黴（Aphanocladiumsp.）SK34.001，保藏號為CCTCCNO：M2014090。本發明對β-葡萄糖苷酶產生菌絲枝黴進行斜面、種子、發酵三級培養；從發酵液中分離純化得到β-葡萄糖苷酶酶粉。本發明提供的利用絲枝黴（Aphanocladiumsp.）SK34.001生產β-葡萄糖苷酶的方法，其發酵工藝簡單；酶易於提取；酶活高，酶性質穩定；可直接利用麩皮等廢棄資源作為該菌株的培養基碳源，節省能源消耗，降低生產成本，具有廣闊的市場應用前景。
【專利說明】一株絲枝黴菌株及其生產β-葡萄糖苷酶的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一株絲枝黴菌株及其生產β-葡萄糖苷酶的方法，屬於食品生物【技術領域】。
【背景技術】
[0002]β -葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.21)，也稱β -D-葡萄糖苷酶，它能夠水解結合於底物末端非還原性的β-D-葡萄糖苷鍵，同時釋放出葡萄糖和相應的配基。β-葡萄糖苷酶存在於自然界許多植物、昆蟲、酵母、黴菌及細菌體內，它參與生物體的糖代謝，對維持生物體正常生理功能起著重要作用。
[0003]β -葡萄糖苷酶在自然界廣泛分布，幾乎在所有的生物體中都有存在，但來源不同，其性質各異。該酶對糖苷非糖部分的專一性不強，能水解許多β型的糖苷鍵。
[0004]β_葡萄糖苷酶除主要用於降解纖維素以外，還可應用於乳品工業來分解乳糖；催化葡萄糖發生轉移反應和縮合反應合成功能性低聚糖，如低聚龍膽糖；作為風味酶應用於(果)酒、茶葉、果汁中起到增香或脫苦作用；另外，β_葡萄糖苷酶還可用來水解大豆異黃酮，製備高活性的大豆異黃酮苷元產品。
[0005]目前，國內外用於研究和製備葡萄糖苷酶的微生物主要有木黴屬{Trichoderma)和麴黴屬{Aspergillus)。研究表明,許多麴黴屬是生產高活力β _葡萄糖苷酶的優良菌株，且 被認為是不會產生毒素的纖維素酶產生菌，因而研究比較深入。迄今為止，還沒有絲枝黴iAphanocladium)作為β -葡萄糖苷酶產生菌的相關研究報導。
【發明內容】
[0006]本發明的目的是提供一種絲枝黴菌株及其生產葡萄糖苷酶的方法。
[0007]本發明的技術方案，一株絲枝黴菌株，是本發明人等先前從腐殖土壤樣品中分離篩選得到的一株可以高產β_葡萄糖苷酶的絲枝黴菌株，分類命名為絲枝黴Uphanocladium sp.)SK34.001，其保藏號為CCTCC NO:M 2014090，保藏單位為中國典型培養物保藏中心。
[0008]所述菌株的核糖體DNA ITS序列如SEQ ID NO:1所示。
[0009]所述絲枝黴菌株CCTCC NO:M 2014090生產β -葡萄糖苷酶的方法，步驟如下:
(1)斜面培養:取絲枝黴菌株CCTCCNO:Μ 2014090進行斜面培養，採用PDA培養基，各組分以g/L計:馬鈴薯200，葡萄糖20，瓊脂15~20 ;自然pH，115°C下滅菌30min ;培養溫度為25~35°C，培養時間3~8天；
(2)種子培養:採用牛肉膏蛋白腖培養基，各組分以g/L計:牛肉膏2~5，胰蛋白腖5~8，氯化鈉2~5，自然pH，121°C滅菌20min ;在250mL三角瓶裝液3(T50mL，將步驟(1)所得的斜面培養液進行種子培養，搖瓶轉速15(T200rpm，培養溫度25~35°C，培養時間18~24h ；
(3)發酵培養:發酵培養基組分以g/L計:麩皮20-40，硫酸銨4飛，磷酸二氫鉀2~3，硫酸鎂0.3^0.5，氯化鈣0.3^0.5，自然pH，121°C滅菌20min ;步驟(2)所得的種子培養液按體積百分數2%~5%接種量接種於發酵培養基中，搖瓶轉速15(T200rpm，培養溫度25~35°C，培養時間31天；
(4)β-葡萄糖苷酶酶粉製備:將步驟(3)製得的發酵液在5000- 10000rpm離心IOlOmin或過濾去除菌體即得發酵上清液，經超濾除去鹽和雜蛋白，再經硫酸銨沉澱、透析，最後將透析液進行冷凍乾燥即得β-葡萄糖苷酶酶粉。
[0010]本發明中的β-葡萄糖苷酶活性，是通過使酶作用於對硝基苯-β-D-葡萄糖苷(PNPG)，分解所生成的對硝基苯酚的量而測定。該酶的單位定義為每分鐘生成I μ mol對硝
基苯酚的酶量。
[0011]本發明的有益效果:本發明為首次採用絲枝黴(AphanocIadium)作為β -葡萄糖苷酶的產生菌，該菌株培養方便，發酵工藝簡單。其所產酶為胞外酶，易於提取，酶活高，酶性質穩定，可直接利用麩皮等廢棄資源作為絲枝黴(Aphanocladiuni)的培養基碳源,節省能源消耗，降低生產成本，具有廣闊的市場應用前景。
[0012]生物材料樣品保藏:一株絲枝黴菌株,分類命名為絲枝黴sp.)SK34.001，該菌株已於2014年3月14日保藏於中國典型培養物保藏中心，簡稱CCTCC，地址:中國武漢，武漢大學，保藏編號為CCTCC NO:M 2014090。
【具體實施方式】
[0013]實施例1
將絲枝黴菌株(Aphanocladium sp.) SK34.001在下述條件下進行發酵:
斜面培養:採用PDA培養基，各組分以g/L計:馬鈴薯200，葡萄糖20，瓊脂20，自然pH，115°C滅菌30min。培養條件為:培養溫度30°C，培養時間5天；
種子培養:採用牛肉膏蛋白腖培養基，各組分以g/L計:牛肉膏2.5，胰蛋白腖5.0，氯化鈉2.5，自然pH，121°C滅菌20min。培養條件為:250mL三角瓶裝液30mL，搖瓶轉速200rpm,培養溫度30°C，培養時間24h ；
發酵培養:發酵培養基組分以g/L計:麩皮35，硫酸銨4.0,磷酸二氫鉀2.0,硫酸鎂
0.3，氯化鈣0.3，自然pH，121°C滅菌20min。培養條件為:種子培養液按體積百分數2%接種量接種於發酵培養基中，搖瓶轉速150rpm，培養溫度30°C，培養時間7天，得到發酵液的酶活為5U/mL。
[0014]實施例2
β-葡萄糖苷酶酶粉製備:
將實施例1製得的發酵液在8000rpm的轉速下離心30min去除菌體即得發酵上清液，經超濾除去鹽和雜蛋白，再經硫酸銨沉澱、透析，最後將透析液進行冷凍乾燥即得葡萄糖苷酶酶粉。
【權利要求】
1.一株絲枝黴菌株,其分類命名為絲枝黴sp.)SK34.001,其保藏號為CCTCC NO:M 2014090，保藏單位為中國典型培養物保藏中心。
2.根據權利要求1所述絲枝黴菌株,其特徵在於:所述菌株的核糖體DNAITS序列如SEQ ID NO:1 所示。
3.權利要求1所述絲枝黴菌株CCTCCNO:M 2014090生產β -葡萄糖苷酶的方法，其特徵在於步驟如下: (1)斜面培養:取絲枝黴菌株CCTCCNO:Μ 2014090進行斜面培養，採用PDA培養基，各組分以g/L計:馬鈴薯200，葡萄糖20，瓊脂15~20 ；自然pH，115°C下滅菌30min ;培養溫度為25~35°C，培養時間3~8天； (2)種子培養:採用牛肉膏蛋白腖培養基，各組分以g/L計:牛肉膏2~5，胰蛋白腖5~8，氯化鈉2~5，自然pH，121°C滅菌20min ；250mL三角瓶裝液3(T50mL，將步驟(1)所得的斜面培養液進行種子培養，搖瓶轉速15(T200rpm，培養溫度25~35°C，培養時間18~24h ； (3)發酵培養:發酵培養基組分以g/L計:麩皮20-40，硫酸銨4飛，磷酸二氫鉀2~3，硫酸鎂0.3^0.5，氯化鈣0.3^0.5，自然pH，121°C滅菌20min ;步驟(2)所得的種子培養液按體積百分數2%~5%接種量接種於發酵培養基中，搖瓶轉速15(T200rpm，培養溫度25~35°C，培養時間31天； (4)β-葡萄糖苷酶酶粉製備:將步驟(3)製得的發酵液在5000- I OOOOrpm離心10~3Omin或過濾去除菌體即得發酵上清液，經超濾除去鹽和雜蛋白，再經硫酸銨沉澱、透析，最後將透析液進行冷凍乾燥即得β-葡萄糖苷酶酶粉。
【文檔編號】C12R1/645GK103937692SQ201410179291
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2014年4月30日 優先權日:2014年4月30日
【發明者】江波, 張濤, 周林芳, 沐萬孟, 繆銘 申請人:江南大學