一種磁性二氧化矽複合微球的製備方法及其應用的製作方法
2023-07-09 17:13:21
一種磁性二氧化矽複合微球的製備方法及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明涉及一種磁性二氧化矽複合微球及其製備方法和應用。本發明利用高溫熱解方法製備超順磁性四氧化三鐵納米粒子（4～30nm），在磁性納米粒子外表面，利用反相微乳液法包覆二氧化矽外殼（殼厚5～20nm），對二氧化矽表面進行氨基化修飾，用戊二醛作為交聯臂，再接入配基蛋白，利用配基蛋白與目標蛋白的特異性結合，進行蛋白分離。本發明所製備的磁性微球粒徑小，單分散性好，帶有氨基的複合微球比表面積大，利用親核加成反應，接入交聯臂戊二醛後，可以接入多種配基蛋白，從而可以分離多種目標蛋白，十分適合生物樣品中蛋白的快速分離及應用，在生物醫學等領域具有廣闊的應用前景和巨大的應用價值。
【專利說明】一種磁性二氧化矽複合微球的製備方法及其應用
【技術領域】
[0001]本發明屬於免疫化學試驗領域，涉及一種磁性二氧化矽複合微球及其製備方法和應用
【背景技術】
[0002]20世紀90年代以來，隨著納米科技的發展,磁性材料已步入磁性納米材料的新紀元。磁性納米材料與體相磁性材料相比磁學性質發生了很大變化，具有非常廣闊的應用前景，已經成為國際上的研究熱點。磁性粒子在蛋白分離、藥物靶向等方面的應用，也是當前生物領域中的熱門研究課題之一。在眾多的磁性納米材料中，超順磁性Fe304納米粒子在生物體中易代謝分解，因此Fe304納米粒子在生物醫藥方面具有潛在應用。一種合成單分散Fe304納米粒子的常用方法是含鐵的配體化合物(如乙醯丙酮化合物、乙酸鹽、油酸鹽等)的高溫熱分解，此反應是在非極性溶劑中發生的，獲得顆粒接近單分散，但是疏水性的且不適合生物應用。為解決這個問題需要將疏水的Fe304納米粒子進行表面修飾，使其變成親水性的。Si02包覆方法是一種很好的改性方法，因為Si02具有很好的生物相容性和穩定性，無毒且容易進一步和不同官能團結合。對於二氧化矽表面的矽羥基進行氨基化修飾，再接入交聯臂戊二醛。此磁性二氧化矽複合微球的交聯臂含有醛基，通過親核加成反應與配基蛋白結合，戊二醛與蛋白反應具有活性高、反應快、結合量高、交聯性好且交聯產物性質穩定，並可保持蛋白質的精細結構，對酶的活性影響小，固定的蛋白質染色性能好等特點。再通過配基蛋白與目標蛋白之間的特異性結合，進行目標蛋白的分離。相較於其他分離手段，磁分離純化蛋白質技術具有如下優勢:操作緩和，能確保蛋白質結果的完整性，可以從蛋白質含量較低的樣品中迅速富集濃縮，獲得較高濃度的提純樣品，純化步驟簡單，甚至可以集細胞裂解與蛋白質分離於一步完成。磁性二氧化矽複合微球具有抗酸鹼腐蝕、抗壓、無毒、穩定性好，可重複利用等優點。
[0003]對現有技術的文獻進行檢索發現，研究磁性分離蛋白的文獻專利很多。中國專利200410057258.1申請了一種生物多糖高分子磁性微球及其製備方法，中國專利200510116850.9申請了一種複合生物多糖磁性微球製備方法，上述方法製備的微球抗壓和抗腐蝕性能都較差；中國專利200610147250.3申請了表面固定有蛋白酶的帶氨基的納米磁性微球及其製備方法和應用，中國專利200710047399.9申請了帶有表面官能團的磁性微球的製備方法，上述方法直接在磁性微球表面氨基化後應用，磁芯四氧化三鐵極易被腐蝕。本發明克服了這些缺點，而且粒徑小，相同質量微球比表面積大大增加，增加分離效率，而且磁芯不易被腐蝕，可回收利用，利於工業化。
【發明內容】
[0004]本發明的目的在於克服現有技術的缺陷，製備出磁性微球粒徑小，單分散性好，帶有氨基的複合微球比表面積大的磁性二氧化矽複合微球。利用親核加成反應，接入交聯臂戊二醛後，可以接入多種配基蛋白，從而可以分離多種目標蛋白。[0005]本發明的技術方案如下:
[0006]一種磁性二氧化矽複合微球，包括超順磁性四氧化三鐵納米粒子，其特徵在於:超順磁性四氧化三鐵納米粒子直徑為4-30nm，超順磁性四氧化三鐵納米粒子外表面包覆有殼厚5-20nm的二氧化娃外殼,所述二氧化娃外殼表面進行氨基化修飾,用戍二醒作為交聯臂，再接入配基蛋白。
[0007]一種磁性二氧化矽複合微球的製備方法，該方法包含下面的步驟:
[0008]( I)四氧化三鐵前驅體的製備；
[0009](2)利用反相微乳液法製備二氧化矽包覆的四氧化三鐵磁性微球；
[0010](3)磁性微球表面降低非特異性吸附的處理；
[0011](4)接入配基蛋白。
[0012]所述步驟(I)具體分為兩步:
[0013]第一步，將氯化鐵和油酸鈉以摩爾比為1:1?1:5溶於水、乙醇和正己烷混合溶液中，其中水、乙醇和正己烷體積比為3?4:4:7，在常溫氮氣環境下磁力攪拌，並加熱至50?80°C，冷凝回流3?6h ;待溶液冷卻至室溫，利用分液漏鬥分離上層有機相，並用去離子水洗滌乾燥，得到棕褐色蠟狀固體，即得到油酸鐵前驅體；
[0014]第二步，將第一步製備的油酸鐵前驅體溶於十八烯中，加入油酸，其中油酸與十八烯的摩爾比為1:1?5:1，以加熱速率2?10°C /min加熱至300?380°C，冷凝回流一定時間30?60min至溶液中發生強烈反應，待溶液變渾濁，呈黑褐色，關閉反應器，直至溶液冷卻至室溫，加入過量乙醇沉澱Fe304納米粒子，離心分離；
[0015]沉澱一再分散操作:將上清液倒出，將納米粒子溶於正己烷中，再加入過量乙醇沉澱出Fe304納米粒子，離心分離；
[0016]重複上述沉澱一再分散操作，洗滌4?5次，得到疏水Fe304納米粒子。
[0017]所述步驟(2)具體分為三步:第一步，將6.8?20g的表面活性劑分散在200?600ml的環己烷中，超聲；
[0018]第二步，將40?120mg疏水Fe304納米粒子加入到上述溶液中，持續攪拌，加入
0.5?1.5ml濃度為25%-28%氨水到混合溶液中；
[0019]第三步，用衡壓滴液方式將0.5?1.5mlTE0S分次滴入上述混合溶液中，攪拌反應8?24h，離心洗滌後獲得Fe304@Si02複合微球，將Fe304@Si02複合微球再分散於乙醇中。
[0020]所述步驟(3)具體分為兩步:
[0021]第一步，將0.0lg的Fe304@Si02複合微球溶於50ml的乙醇溶液中，加入25ml體積分數為5%或lmol/L的APTES (3-氨丙基三乙氧基矽烷)，機械攪拌反應12?100h，反應後加熱至25?100°C，冷凝回流一定時間0.5?10h，用乙醇清洗，真空乾燥。
[0022]第二步，將上述微球溶於乙醇中，再將此溶液溶於PBS緩衝溶液中，其中乙醇與PBS緩衝溶液體積比1:1?10:1，加入戊二醛(25%，v/v)，乙醇與PBS體積比範圍(I:1?100:1 )，常溫機械攪拌一段時間4?20h，洗滌後將其分散於O?2000mlPBS緩衝溶液中，最後接入交聯臂戊二醛。
[0023]所述步驟(4)具體為:一定量的上述帶有醛基的複合微球溶於一定量的PBS緩衝溶液中，孵化一定濃度(O?lmg/mL)的牛血清蛋白(BSA)溶液，時間(O?10h)。
[0024]所述的表面活性劑為長烷烴鏈類溶劑。[0025]所述的磁性二氧化矽複合微球與目標蛋白特異性結合，進行蛋白分離的應用。
[0026]本發明的有益效果是:本發明利用高溫熱解方法製備超順磁性四氧化三鐵納米粒子(4?30nm)，在磁性納米粒子外表面，利用反相微乳液法包覆二氧化矽外殼(殼厚5?20nm),對二氧化矽表面進行氨基化修飾，用戊二醛作為交聯臂，再接入配基蛋白，利用配基蛋白與目標蛋白的特異性結合，進行蛋白分離。本發明所製備的磁性微球粒徑小，單分散性好，帶有氨基的複合微球比表面積大，利用親核加成反應，接入交聯臂戊二醛後，可以接入多種配基蛋白，從而可以分離多種目標蛋白，十分適合生物樣品中蛋白的快速分離及應用，在生物醫學等領域具有廣闊的應用前景和巨大的應用價值。
[0027]( I)本發明所製備的磁性微球粒徑小，單分散性好，帶有氨基的複合微球比表面積大；
[0028](2)此磁性二氧化矽複合微球的交聯臂含有醛基，通過親核加成反應與配基蛋白結合，戊二醛與蛋白反應具有活性高、反應快、結合量高、交聯性好且交聯產物性質穩定，並可保持蛋白質的精細結構，對酶的活性影響小，固定的蛋白質染色性能好等特點；
[0029](3)通過配基蛋白與目標蛋白之間的特異性結合，進行目標蛋白的分離，相較於其他分離手段，磁分離純化蛋白質技術具有如下優勢:操作緩和，能確保蛋白質結果的完整性，可以從蛋白質含量較低的樣品中迅速富集濃縮，獲得較高濃度的提純樣品，純化步驟簡單，甚至可以集細胞裂解與蛋白質分離於一步完成；
[0030](4)磁性二氧化矽複合微球具有抗酸鹼腐蝕、抗壓、無毒、穩定性好，可重複利用等優點。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0031]圖1為利用油酸鐵前驅體高溫熱解製備Fe304納米粒子透射電鏡圖
[0032]圖2為利用反相微乳液法製備Fe304@Si02微球透射電鏡圖
【具體實施方式】
[0033]以下通過【具體實施方式】對本發明的技術方案進行進一步的說明和描述。
[0034]實施例一
[0035]一、Fe3O4納米粒子的製備
[0036]1.油酸鐵前驅體的製備
[0037]2.7gFeCl3.6H20溶於水、乙醇和正己烷混合溶液中，體積為70mL，再加入8.875g油酸鈉，常溫氮氣環境下磁力攪拌，加熱至70°C，冷凝回流4h。反應完成後，關閉儀器，待溶液冷卻至室溫，利用分液漏鬥分離，上層有機相中包含油酸鐵的混合物，將上層有機相用去離子水洗滌，真空乾燥，除去溶劑正己烷，得到棕褐色蠟狀固體即油酸鐵前驅體。
[0038]2.利用油酸鐵前驅體高溫熱解製備Fe3O4納米粒子
[0039]將Ig油酸鐵前驅體溶於5.56mL十八烯中，加入0.16mL的油酸，磁力攪拌，以
3.30C /min的加熱速率加熱至320°C，冷凝回流30min。溶液中發生強烈反應，溶液逐漸變渾濁，至黑褐色，即合成了四氧化三鐵納米粒子。關閉反應器至溶液冷卻至室溫，加入過量乙醇沉澱Fe3O4納米粒子，離心分離。將上清液輕輕倒出，將納米粒子溶於正己烷中，再加入過量乙醇沉澱出Fe3O4納米粒子，再離心分離。重複上述沉澱一再分散操作，洗滌4?5次，即可得到疏水Fe3O4納米粒子。
[0040]二、利用反相微乳液法製備Fe3O4OSiO2微球
[0041]6.8g的表面活性劑分散在200mL的環己烷中，超聲lOmin。將40mgFe304納米粒子溶於IOmL環己烷中，加入到上述溶液中，持續攪拌，加入0.5mL氨水(25%_28%)，用衡壓滴液方式將0.5mLTE0S分8次滴入上述混合溶液中，攪拌反應16h。離心洗滌後獲得Fe3O4OSiO2核殼納米顆粒，將Fe3O4OSiO2核殼納米顆粒分散於乙醇中保存。
[0042]三、降低磁球表面非特異性吸附的處理，即進行表面氨基化，再接入交聯臂戊二醛
[0043]1.0.0lg的Fe3O4OSiO2複合微球溶於50mL乙醇溶劑中，加入25uL的APTES (3_氨丙基三乙氧基矽烷)，機械攪拌反應72h，加熱至70V，回流lh，用乙醇清洗，利用雷射粒度儀測表面電位+2.17mV。
[0044]2.將上述微球溶液溶於20mL的PBS (0.0lM, Ph=7.4)緩衝溶液中，加入35uL戊二醛(25%，v/v)，常溫機械攪拌8h，洗滌後將其分散4.3mLPBS (0.2M，pH=6)的緩衝溶液中。利用雷射粒度儀測表面電位-2.28mV。
[0045]四、接入配基蛋白
[0046]配置初始濃度為0.25mg/mL的牛血清蛋白(BSA)溶液，IOmg上述帶有醛基的複合微球溶於5mLPBS (0.0lM, pH=7.4)緩衝溶液，取25mLBSA溶液放入磁球溶液中孵化3h，溫度為30°C。測得剩餘溶液中蛋白的吸光度0.1129，通過標準蛋白吸光度曲線可以得知，剩餘BSA溶液濃度0.125109mg/mL，通過間接法計算:
[0047]0.25mg/mL*25mL-0.125109mg/mL*30mL=2.49673mg
[0048]得知磁性複合微球接入配基蛋白的量為2.49673mg/10mg磁性微球。
[0049]此帶有醛基的複合磁性微球可以接多種配基蛋白，再利用此帶有配基蛋白的磁性微球進行多種目標蛋白的分離。
[0050]實施例二
[0051]一、Fe3O4納米粒子的製備
[0052]1.油酸鐵前驅體的製備
[0053]2.7gFeCl3.6H20溶於水、乙醇和正己烷混合溶液中，體積為70mL，再加入8.875g油酸鈉，常溫氮氣環境下磁力攪拌，加熱至50°C，冷凝回流6h。反應完成後，關閉儀器，待溶液冷卻至室溫，利用分液漏鬥分離，上層有機相中包含油酸鐵的混合物，將上層有機相用去離子水洗滌，真空乾燥，除去溶劑正己烷，得到棕褐色蠟狀固體即油酸鐵前驅體。
[0054]2.利用油酸鐵前驅體高溫熱解製備Fe3O4納米粒子
[0055]將Ig油酸鐵前驅體溶於5mL十八烯中，加入0.15mL的油酸，磁力攪拌，以2V /min的加熱速率加熱至330°C，冷凝回流50min。溶液中發生強烈反應，溶液逐漸變渾濁，至黑褐色，即合成了四氧化三鐵納米粒子。關閉反應器至溶液冷卻至室溫，加入過量乙醇沉澱Fe3O4納米粒子，離心分離。將上清液輕輕倒出，將納米粒子溶於正己烷中，再加入過量乙醇沉澱出Fe3O4納米粒子，再離心分離。重複上述沉澱一再分散操作，洗滌4?5次，即可得到疏水Fe3O4納米粒子。
[0056]二、利用反相微乳液法製備Fe3O4OSiO2微球
[0057]13.6g的表面活性劑分散在400mL的環己烷中，超聲lOmin。將80mgFe304納米粒子溶於ImL環己烷中，加入到上述溶液中，持續攪拌，加入ImL氨水(25%_28%)，用衡壓滴液方式將0.5mLTE0S分8次滴入上述混合溶液中，攪拌反應16h。離心洗滌後獲得Fe3O4OSiO2核殼納米顆粒，將Fe3O4OSiO2核殼納米顆粒分散於乙醇中保存。如圖2。
[0058]三、降低磁球表面非特異性吸附的處理，即進行表面氨基化，再接入交聯臂戊二醛
[0059]1.0.0lg的Fe3O4OSiO2複合微球溶於50mL乙醇溶劑中，加入25uL的APTES (3_氨丙基三乙氧基矽烷)，機械攪拌反應72h，加熱至70°C，回流lh，用乙醇清洗，利用雷射粒度儀測表面電位+2.17mV。
[0060]2.將上述微球溶液溶於20mL的PBS (0.01M, Ph=7.4)緩衝溶液中，加入35uL戊二醛(25%，v/v)，常溫機械攪拌8h，洗滌後將其分散4.3mLPBS (0.2M，pH=6)的緩衝溶液中。利用雷射粒度儀測表面電位-2.28mV。
[0061]四、接入配基蛋白如實施例一。
[0062]實施例三
[0063]一、Fe3O4納米粒子的製備
[0064]1.油酸鐵前驅體的製備
[0065]2.7gFeCl3.6H20溶於水、乙醇和正己烷混合溶液中，體積為70mL，再加入8.875g油酸鈉，常溫氮氣環境下磁力攪拌，加熱至80°C，冷凝回流3h。反應完成後，關閉儀器，待溶液冷卻至室溫，利用分液漏鬥分離，上層有機相中包含油酸鐵的混合物，將上層有機相用去離子水洗滌，真空乾燥，除去溶劑正己烷，得到棕褐色蠟狀固體即油酸鐵前驅體。
[0066]2.利用油酸鐵前驅體高溫熱解製備Fe3O4納米粒子
[0067]將Ig油酸鐵前驅體溶於6mL十八烯中，加入0.18mL的油酸，磁力攪拌，以10°C /min的加熱速率加熱至340°C，冷凝回流60min。溶液中發生強烈反應，溶液逐漸變渾濁，至黑褐色，即合成了四氧化三鐵納米粒子。關閉反應器至溶液冷卻至室溫，加入過量乙醇沉澱Fe3O4納米粒子，離心分離。將上清液輕輕倒出，將納米粒子溶於正己烷中，再加入過量乙醇沉澱出Fe3O4納米粒子，再離心分離。重複上述沉澱一再分散操作，洗滌4?5次，即可得到疏水Fe3O4納米粒子。
[0068]二、利用反相微乳液法製備Fe3O4OSiO2微球
[0069]20g的表面活性劑分散在600mL的環己烷中，超聲lOmin。將120mgFe304納米粒子溶於1.5mL環己烷中，加入到上述溶液中，持續攪拌，加入1.5mL氨水(25%_28%)，用衡壓滴液方式將0.5mLTE0S分8次滴入上述混合溶液中，攪拌反應16h。離心洗滌後獲得Fe3O4OSiO2核殼納米顆粒，將Fe3O4OSiO2核殼納米顆粒分散於乙醇中保存。
[0070]三、降低磁球表面非特異性吸附的處理，即進行表面氨基化，再接入交聯臂戊二醛
[0071]1.0.0lg的Fe3O4OSiO2複合微球溶於50mL乙醇溶劑中，加入25uL的APTES (3_氨丙基三乙氧基矽烷)，機械攪拌反應72h，加熱至70V，回流lh，用乙醇清洗，利用雷射粒度儀測表面電位+2.17mV。
[0072]2.將上述微球溶液溶於20mL的PBS (0.0lM, Ph=7.4)緩衝溶液中，加入35uL戊二醛(25%，v/v)，常溫機械攪拌8h，洗滌後將其分散4.3mLPBS (0.2M，pH=6)的緩衝溶液中。利用雷射粒度儀測表面電位-2.28mV。
[0073]四、接入配基蛋白如實施例一。
[0074]雖然已經關於其優選的實施例具體示出和描述了本發明，但本領域的技術人員應當理解對形式和細節可以做出上述和其它的改變而不脫離本發明的精神和範圍。因此旨在本發明不局限於描述和示例的精確形式以及細節，而是落入所附權利要求的範圍內。
【權利要求】
1.一種磁性二氧化矽複合微球，包括超順磁性四氧化三鐵納米粒子，其特徵在於:超順磁性四氧化三鐵納米粒子直徑為4-30nm，超順磁性四氧化三鐵納米粒子外表面包覆有殼厚5-20nm的二氧化娃外殼,所述二氧化娃外殼表面進行氨基化修飾,用戍二醒作為交聯臂，再接入配基蛋白。
2.一種磁性二氧化 矽複合微球的製備方法，該方法包含下面的步驟: (1)四氧化三鐵前驅體的製備； (2)利用反相微乳液法製備二氧化矽包覆的四氧化三鐵磁性微球； (3)磁性微球表面降低非特異性吸附的處理； (4)接入配基蛋白。
3.權利要求2所述的製備方法，其特徵在於:所述步驟(1)具體分為兩步: 第一步，將氯化鐵和油酸鈉以摩爾比為1:1~1:5溶於水、乙醇和正己烷混合溶液中，其中水、乙醇和正己烷體積比為3~4:4:7，在常溫氮氣環境下磁力攪拌，並加熱至50~80°C，冷凝回流3~6h ;待溶液冷卻至室溫，利用分液漏鬥分離上層有機相，並用去離子水洗滌乾燥，得到棕褐色蠟狀固體，即得到油酸鐵前驅體； 第二步，將第一步製備的油酸鐵前驅體溶於十八烯中，加入油酸，其中油酸與十八烯的摩爾比為1:1~5:1，以加熱速率2~10°C /min加熱至300~380°C，冷凝回流一定時間30~60min至溶液中發生強烈反應，待溶液變渾濁，呈黑褐色，關閉反應器，直至溶液冷卻至室溫，加入過量乙醇沉澱Fe304納米粒子，離心分離； 沉澱一再分散操作:將上清液倒出，將納米粒子溶於正己烷中，再加入過量乙醇沉澱出Fe304納米粒子，離心分離； 重複上述沉澱一再分散操作，洗滌4~5次，得到疏水Fe304納米粒子。
4.權利要求3所述的製備方法，其特徵在於:所述步驟(2)具體分為三步: 第一步，將6.8~20g的表面活性劑分散在200~600ml的環己烷中，超聲； 第二步，將40~120mg疏水Fe304納米粒子加入到上述溶液中，持續攪拌，加入0.5~1.5ml濃度為25%-28%氨水到混合溶液中； 第三步，用衡壓滴液方式將0.5~1.5mlTEOS分次滴入上述混合溶液中，攪拌反應8~24h，離心洗滌後獲得Fe304@Si02複合微球，將Fe304@Si02複合微球再分散於乙醇中。
5.權利要求2所述的製備方法，其特徵在於:所述步驟(3)具體分為兩步: 第一步，將0.01g的Fe304@Si02複合微球溶於50ml的乙醇溶液中，加入25ml體積分數為5%或lmol/L的APTES (3-氨丙基三乙氧基矽烷)，機械攪拌反應12~100h，反應後加熱至25~100°C，冷凝回流一定時間0.5~10h，用乙醇清洗，真空乾燥。 第二步，將上述微球溶於乙醇中，再將此溶液溶於PBS緩衝溶液中，其中乙醇與PBS緩衝溶液體積比1:1~10: 1，加入戊二醛(25%，v/v)，乙醇與PBS體積比範圍(1:1~100:1)，常溫機械攪拌一段時間4~20h，洗滌後將其分散於O~2000mlPBS緩衝溶液中，最後接入交聯臂戊二醛。
6.權利要求2所述的製備方法，其特徵在於:所述步驟(4)具體為:一定量的上述帶有醛基的複合微球溶於一定量的PBS緩衝溶液中，孵化一定濃度(O~lmg/mL)的牛血清蛋白(BSA)溶液，時間(O~10h)。
7.權利要求4所述的製備方法，其特徵在於:所述的表面活性劑為長烷烴鏈類溶劑。
8.權利要求1所述的 磁性二氧化矽複合微球與目標蛋白特異性結合，進行蛋白分離的應用。
【文檔編號】H01F1/42GK103903827SQ201410105086
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2014年3月20日 優先權日:2014年3月20日
【發明者】趙九蓬, 趙長傑 申請人:哈爾濱益材新材料有限公司