特異性檢測西瓜上果斑病菌的pcr方法

2023-07-09 10:27:21 1

專利名稱：特異性檢測西瓜上果斑病菌的pcr方法
技術領域：
本發明涉及一種西瓜上果斑病菌(Acidovorax citrulli)的檢測方法，具體涉及一種特異性檢測西瓜上果斑病菌的PCR(聚合酶鏈式反應)技術。
背景技術：
在PCR檢測方面，PCR引物特異性很難令人滿意，一些文獻做PCR或實時螢光 PCR沒有用相近細菌作對照，只介紹了靈敏度而沒有介紹特異性，而瓜類作物上除了果斑病菌還有角斑病菌等其它細菌。有的PCR引物設計很不合理，如某學位論文的PCR引物 5』 -GACCAGCCACACTGGGAC-3』經BLAST居然出現排在前面的序列沒有果斑病菌序列。
另一碩士論文中設計的PCR引物也是如此，用其設計的引物做BLAST，結果前30條序列中沒有果斑病菌序列。第；34-37條才是此果斑病菌的序列，然而序列覆蓋率只有90 %， 其中相同鹼基只有95%。
還有一篇論文中也是在16S rDNA區設計的PCR引物，用正向引物做BLAST，前1萬個找到的序列都是100%覆蓋和100%鹼基相同，而果斑病菌的前5千個序列中沒有出現， 反向引物BLAST前250條序列都是100 %覆蓋和100 %鹼基相同。這些100 %覆蓋和100 % 鹼基相同的序列有不少是植物內生菌，檢測時必然有假陽性出現。
因此，採用以上PCR引物檢測果斑病菌時，並不能明顯區分出果斑病菌和其他病菌，更不能檢測出西瓜上果斑病菌，因此檢測技術特異性是一個亟待解決的難題。
本人亦試圖依據果斑菌16S序列來設計引物，結果未能成功找到特異性好的備選序列。發明內容
本發明所要解決技術問題是針對上述現有技術的不足，提供一種特異性檢測西瓜上果斑病菌(Acidovorax citrulli)的PCR方法，解決了西瓜上果斑病菌PCR檢測上引物特異性不好的問題，可以準確地檢測西瓜上帶果斑病菌的情況。
為了解決上述技術問題，本發明所採用的技術方案是一種特異性檢測西瓜上果斑病菌的PCR方法，該方法是以西瓜上果斑病菌特異性引物對待測樣品進行PCR擴增，最後電泳鑑定，該特異性引物為
正向引物5，-GTCCGAGCGTACGTTGAG-3，，
反向引物5，-ACGGCACCTGACCCGTTG-3，。
詳述如下
一、引物的設計
發明人利用細菌種間甚至亞種間菌毛蛋白基因核苷酸序列的特異性，從NCBI/ GenBank搜索並下載了果斑病菌AAC00-1菌系IV型菌毛蛋白基因(GenBank :CP000512. 1全基因組序列上從第30414 個鹼基到第3041923個鹼基共495個鹼基)的核苷酸序列，運用MEGA4. 0軟體對這些序列進行比對，經BLAST只找到其本身，見圖1。
依據此序列用primerBLAST工具設計PCR引物序列如下正向引物5，-GTCCGAGCGTACGTTGAG-3，(如SEQ ID No 1 所示)反向引物5，-ACGGCACCTGACCCGTTG-3，(如SEQ ID No 2 所示)；上述引物由寶生物工程(大連)有限公司合成。PCR產物預期大小為333個鹼基。將正向引物和反向引物分別經BLAST檢索，見圖2和圖3。結果表明該正向引物和反向引物的序列與果斑病菌AAC00-1菌系IV型蛋白基因序列100%相同，而與其它菌的序列最高覆蓋率只有88%。二、病菌的PCR過程西瓜上細菌基因組DNA的提取取西瓜上的果斑細菌在常用的肉汁腖細菌培養基上培養20-30h，得到單菌落，再用無菌牙籤挑取單菌落，洗入10 μ 1 ddH20中，99°C處理lOmin，離心後收集上清液，至於冰上備用。用上述設計的引物對對果斑細菌總DNA進行擴增，預計擴增片段約為33!3bp。PCR 擴增體系 05 μ 1) :DNA 擴增模板 IylUOXPCR Buffer 2·5μ1、 dNTPs (IOmm) O. 5 μ 1、Taq 酶(2· 5 μ / μ 1) O. 5 μ 1、Forward Primer (IOmm) 1 μ 1、Reverse Primer(IOmm) 1 μ dd H2O 18. 5 μ 1。序列擴增條件預變性94 "C 5min ；循環參數94 "C 30sec ；56 "C 30sec ； 720C 40sec ；共 30 個循環；72°C IOmin 延伸。三、PCR擴增產物的鑑定擴增產物經常規電泳並用凝膠成像系統檢查，結果出現的條帶與預期的大小相符。PCR產物經克隆在T載體上後測序，測序結果經BLAST，只找到Acidovorax citrulli AAC00-1全基因組序列(Rb|CP000512. 1|)，與其的第3041605至3041900號鹼基相同，見圖 4。(因測序結果要刪除引物序列，所以PCR產物的序列大小只有四6個鹼基)。本文中提及的PCR技術包含從PCR衍生的所有技術，如實時螢光PCR。與現有技術相比，本發明的優點是本方法使用的一對引物是根據西瓜上果斑病菌菌系AAC00-1全基因組序列上的IV型菌毛蛋白基因序列設計的，使用此對引物做PCR檢測時，不僅可將它種細菌排除，將西瓜上果斑病菌與其它細菌準確區分開來，且可區分西瓜上的果斑病菌和甜瓜上的果斑病菌，特異性高。


圖1是果斑病菌IV型菌毛蛋白基因序列的BLAST結果。圖2是本發明正向引物的BLAST結果。圖3是本發明反向引物的BLAST結果。圖4是用本發明引物作PCR的擴增產物的鹼基序列的BLAST結果。圖5是用本發明設計的引物對作PCR的初步檢驗結果。圖中從左至右的5道電泳帶依次為雜菌，西瓜菌株1，甜瓜菌株，西瓜菌株2， Marker0圖6是用本發明設計的引物對作PCR的檢驗結果。圖中從左至右的7道電泳帶依次為Marker，西瓜菌株1，西瓜菌株2，甜瓜菌株 1，甜瓜菌株2，甜瓜菌株3，雜菌。
圖7是甜瓜上果斑菌株16S核糖體RNA基因鹼基序列的BLAST結果。圖8是用本發明引物對對接種西瓜果斑病菌的西瓜葉片的PCR檢測結果。圖中從左至右的7道電泳帶依次為第1道為2000Marker，第2-7道為病葉樣本。
具體實施例方式實施例一從中國農業科學院植保所趙廷昌實驗室得到5個果斑菌株(全已做16S核糖體 RNA基因測序和BLAST比對經及接種試驗)。首先用本發明的引物對對2個西瓜上的菌株 (分別採自海南三亞(西瓜菌株1)和黑龍江哈爾濱(西瓜菌株幻)和1個甜瓜上的菌株 (採自內蒙古臨河市)這3個菌株以及1個雜菌做了初步PCR檢測。結果只有西瓜上的2 個菌株為陽性，擴增出的條帶大小與預期的333個鹼基相符。甜瓜上的菌株和雜菌均為陰性，見圖5。為保證試驗的準確性，又增加了另外2個甜瓜菌株(分別採自新疆(甜瓜菌株2) 和海南(甜瓜菌株3))做PCR，結果還是一樣，見圖6，第2-3道的2個西瓜菌株為陽性，第 4-6道的3個甜瓜菌株均為陰性，第7道的雜菌為陰性。為了確認甜瓜上的3個菌株確為果斑菌，將這3個菌株的16S核糖體RNA基因做了 PCR。16SrDNA序列的擴增用16SrDNA序列通用引物對甜瓜上的細菌總DNA進行擴增，引物序列如下正向引物16SF 為5，-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，(如 SEQ ID No 3 所示)，反向引物16SR 為5，-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3，(如 SEQ ID No 4 所示)，預計擴增片段約為1500bp。PCR 擴增體系(25 μ 1)DNA擴增模板 1 μ 1，10XPCR Buffer 2· 5 μ 1，dNTPs (IOmm) 0· 5 μ 1，Taq 酶(2· 5 μ / μ 1)0. 5 μ 1, Forward Primer (IOmm) 1 μ 1, Reverse Primer (IOmm)1 μ 1, dd H2O 18.5 μ 1。I6SrDNA 序列擴增條件預變性 94°C 5min ；循環參數:94 V 3Osec ；56°C 3Osec ； 72°C 90sec ；共 30 個循環；72°C IOmin 延伸。PCR產物測序後做BLAST，見圖7，結果表明這3個甜瓜菌株都是果斑菌。實施例二檢測染病西瓜葉片採用本發明的引物對檢測染果斑病的西瓜葉片，PCR檢測程序同前，但檢測對象不是菌種，而是接種西瓜果斑病菌後發病的西瓜葉片。結果從6個人工接種西瓜果斑病菌的西瓜葉片均得到陽性結果(圖8)，擴增出的條帶大小與預期的相符。由以上實施例可知，本發明的該對特異性引物對西瓜上果斑病菌是特異的，採用該引物對對西瓜上果斑病菌作PCR，能準確地將西瓜上果斑病菌與其它細菌準確區分開來， 且可區分西瓜上的果斑病菌和甜瓜上的果斑病菌。
權利要求
1.一種特異性檢測西瓜上果斑病菌的PCR方法，其特徵在於該方法是以西瓜上果斑病菌特異性引物對待測樣品進行PCR擴增，最後電泳鑑定，該特異性引物為正向引物5』 -GTCCGAGCGTACGTTGAG-3， 反向引物5』 -ACGGCACCTGACCCGTTG-3，。
2.如權利要求1所述的特異性檢測西瓜上果斑病菌的PCR方法，其特徵在於所述特異性引物是根據西瓜上果斑病菌AAC00-1菌系IV型菌毛蛋白基因的核苷酸序列設計的， PCR產物大小為333個鹼基。
全文摘要
一種特異性檢測西瓜上果斑病菌(Acidovorax citrulli)的PCR方法，是根據西瓜上果斑病菌菌系AAC00-1全基因組序列上假定的IV型菌毛蛋白基因(GenBankCP000512.1)序列設計一對引物，BLAST結果表明這對引物的特異性非常好。用這對引物做PCR檢測時不僅可將它種細菌排除，且可區分西瓜上的果斑病菌和甜瓜上的果斑病菌，使用此對引物對可將西瓜上果斑病菌菌株與其它細菌準確區分開來，特異性高。
文檔編號C12Q1/68GK102492779SQ20111045287
公開日2012年6月13日 申請日期2011年12月30日 優先權日2011年12月30日
發明者高必達 申請人:湖南農業大學