一種甘蔗抗逆新種質材料的培育方法

2023-07-09 14:04:56 2

專利名稱：一種甘蔗抗逆新種質材料的培育方法
技術領域：
本發明涉及一種運用植物基因工程技術培育甘蔗抗逆種質的方法。
背景技術：
甘蔗(Saccharum officinarum L.)是全世界最為重要的糖料經濟作物，也是我國熱帶、亞熱帶地區重要的糖料經濟作物。目前我國是世界第3大產糖國，2003/2004榨季全國總產糖量達到1002萬噸，其中甘蔗糖佔總產糖量的94％。近年來甘蔗還發展成為一種重要的能源作物，是生產綠色燃料——酒精的重要原料。我國甘蔗主要種植於廣西、雲南、廣東、福建、海南等十三個省區，種植面積已超過120萬公頃，其中旱地甘蔗面積佔90％左右。乾旱和冷害是我國甘蔗生產面臨的主要問題，因而培育抗逆甘蔗新品種尤為重要。
由於現代甘蔗栽培種是甘蔗屬熱帶種，割手密和印度種等物種的種間雜交種，在長期的高貴化育種過程中，減數分裂的異常使得現代甘蔗栽培種形成了大量的非整倍體，其染色體數量多、基因組結構複雜、在同株中染色體倍數不同，同時由於甘蔗對光周期反應敏感，許多重要親本在亞熱帶和溫帶地區很難開花，即使開花花粉量也不足，而且經常與近緣植物的花期不遇，這給常規的抗逆育種帶來許多困難，影響了甘蔗抗逆育種的進程。
海藻糖具有極強的穩定蛋白質及細胞膜結構的功能，它能使生物體在許多異常情況下，如高溫脫水(乾燥、高滲透壓)、冷凍時仍保持細胞內溼潤，防止細胞因失水而造成細胞內養分的損失和細胞的損傷，從而使這些生物具有較強的抗旱、抗寒的能力。
海藻糖在不同的生物體中具有不同的代謝途徑，其相應的酶及作用的底物也不相同。如大腸桿菌(Escherichia coli)和釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)其海藻糖的合成均通過海藻糖-6-磷酸合酶和海藻糖-6-磷酸磷酸酯酶催化，合成途徑為 在大腸桿菌中此二酶構成一個操縱子OtsBA，其中OtsA編碼海藻糖-6-磷酸合酶，OtsB編碼海藻糖-6-磷酸磷酸酯酶(Kassen等，1992)；而在釀酒酵母中此二酶由三個肽鏈組成，其中TPS1基因編碼海藻糖-6-磷酸合酶、TPS2基因編碼海藻糖-6-磷酸磷酸酯酶、TPS3基因編碼的旦白有利於酶複合體的聚集(Vuorio等，1992)。
而在擔子菌(Basidiomycete)灰樹花(Grifola frandosa)中，海藻糖又是由海藻糖合酶(Tsase)催化合成，合成途徑為(Saito等，1998) 到目前為止，國內外已獲得幾種轉海藻糖合酶基因的抗逆轉基因植物(如菸草、馬鈴薯、水稻和高羊茅等)，它們所利用的基因都是來源於細菌的OtsBA或酵母的TPS1基因。從上述不同生物體中海藻糖合成的途徑可看出，灰樹花中海藻糖合成的途徑非常簡單，且海藻糖合酶由單基因編碼，用編碼該酶的基因進行植物的遺傳轉化，因其表達調控相對簡單，轉基因植株合成海藻糖的效率會更高一些。

發明內容
本發明的目的是提供一種培育甘蔗抗逆新種質材料的方法，它是利用植物基因工程技術把擔子菌灰樹花的海藻糖合酶基因通過農桿菌介導法轉入甘蔗的胚性細胞中，再通過胚狀體成苗途徑培育出完整的具有抵抗逆境能力的植株(轉基因植株)。
本發明所設計的培育甘蔗抗逆新種質的方法包括甘蔗胚性愈傷組織的誘導過程、灰樹花海藻糖合酶基因的克隆及其植物表達載體的構建和轉化農桿菌過程、農桿菌介導海藻糖合酶基因對甘蔗胚性愈傷組織的轉化及轉基因植株的培育過程、轉基因植株抗逆性鑑定和篩選過程。
甘蔗胚性愈傷組織的誘導過程以優良甘蔗栽培種幼嫩葉片基部為外植體，外植體先用乙醇進行表面消毒後再用氯化汞溶液進行消毒，之後用無菌水進行衝洗並用無菌濾紙吸乾其表面的水分，然後將其切成薄片接種於胚性愈傷組織誘導培養基上，於避光條件下進行培養，以誘導胚性愈傷組織的產生。所述誘導培養基是以MS為基礎培養基，並添加有2，4-D、蔗糖。
灰樹花海藻糖合酶基因的克隆及其植物表達載體的構建和轉化農桿菌的過程從擔子菌灰樹花(Grifola frondosa)的菌絲體中提取總RNA，並純化出mRNA，再以mRNA為模板經反轉錄PCR(RT-PCR)擴增灰樹花的海藻糖合酶基因的cDNA並進行測序，所得的片段即為灰樹花的海藻糖合酶基因。之後把灰樹花的海藻糖合酶基因(TSase gene)取代植物表達載體pBBB-ETR中的ETR基因，得到灰樹花海藻糖合酶基因的植物表達載體pBBBT，該基因分別由串聯的雙拷貝CaMV35S啟動子和逆境誘導表達啟動子Prd29A驅動。最後採用三親交配法將其導入農桿菌EHA105中。
農桿菌介導海藻糖合酶基因對甘蔗胚性愈傷組織的轉化及轉基因植株的培育過程取含有灰樹花海藻糖合酶基因的農桿菌EHA105單菌落接種到含相應抗生素的YEP液體培養基中，振蕩培養，通過離心回收菌體，再重懸於等體積含100-300μmol/L AS的MR液體培養基中繼續震蕩培養，以誘導細菌vir基因表達，此菌液即為轉化用工程菌液。之後把處理過的胚性愈傷組織轉入農桿菌菌液中，侵染後又用無菌吸水紙吸乾菌液，再把胚性愈傷組織接種於MR固體培養基上於黑暗條件下培養，其後將胚性愈傷組織用無菌水衝洗，並用無菌濾紙吸乾水份後接種於含抗性選擇的分化培養基上，於1500lux12-16h/d光照條件下培養以誘導產生轉化的胚狀體，其間每兩周在相同培養基中繼代一次，長出的胚狀體又轉入抗性分化培養基上於1500lux12-16h/d光照條件下培養以誘導產生抗性小植株。產生的抗性小植株再轉接到抗性生根培養基上於1500lux 12-16h/d光照條件下培養以誘導生根並形成轉化植株，獲得的抗性植株再經過分子檢測篩選出轉基因植株。所述分化培養基是以MS為基礎培養基，並添加有KT、蔗糖、PPT、羧苄青黴素；所述抗性分化培養基是以MS為基礎培養基，並添加有BA、KT、蔗糖、PPT、羧苄青黴素；所述MR培養基是以1/5MS大量元素和MS其他成分為基礎培養基，並添加有2，4-D、果糖、葡萄糖、蔗糖；所述抗性生根培養基是以MS為基礎培養基，並添加有IAA、蔗糖、PPT、頭孢黴素。
抗逆材料的鑑定和篩選的過程把獲得的轉基因植株及相應的對照盆栽成活後分別在植物生長人工氣候箱、大棚溫室和大田進行逐級乾旱或冷脅迫，觀測其生長情況，結合抗逆的生理生化指標(如海藻糖含量、離體葉片保水率、質膜透性、丙二醛含量、光和效率等)的測定，初步篩選出抗逆的轉基因植株；對初選的抗逆轉基因植株的無性繁殖後代繼續進行植物生長人工氣候箱、大棚溫室和大田逐級乾旱或冷脅迫，觀測其生長情況，測定抗逆的生理生化指標(同上)再結合其性狀的重組分離情況，採用Southern雜交、PCR擴增、Bialaphos或PPT抗性表現等鑑定轉基因後代的遺傳穩定性，進一步選出抗逆的轉基因株系；對優選轉基因株系進行乾旱或冷脅迫，觀測其生長情況，結合抗逆的生理生化指標的測定，並在田間進行工農藝性狀鑑定，最終評價轉基因植株及其後代的抗逆性，篩選出抗逆的轉基因甘蔗新種質。
本發明所提供的培育甘蔗抗逆新種質材料的方法是利用植物基因工程技術把擔子菌灰樹花的海藻糖合酶基因通過農桿菌介導法轉入甘蔗的胚性細胞中，再通過胚狀體成苗途徑培育出完整的植株(轉基因植株)，使轉基因植物具有抵抗逆境的能力，並最終提高甘蔗的產量和含糖量。它具有培育周期短、效率高、成本低、不受外界條件影響等優點。
具體實施例方式
下面結合實例對本發明進行詳細說明。
本發明所設計的一種甘蔗抗逆新種質材料的培育方法，包括甘蔗胚性愈傷組織的誘導過程、灰樹花海藻糖合酶基因植物表達載體的構建及轉化農桿菌過程、農桿菌介導海藻糖合酶基因對甘蔗胚性愈傷組織的轉化及轉基因植株的培育過程、抗逆材料的鑑定和篩選過程。
1.甘蔗胚性愈傷組織的誘導過程以優良甘蔗栽培種的幼嫩葉片基部為外植體，外植體先用75％乙醇進行表面消毒後再用氯化汞溶液進行消毒，之後用無菌水進行衝洗並用無菌濾紙吸乾其表面水分，然後將其切成薄片接種於胚性愈傷組織誘導培養基上，於22-28℃避光條件下進行培養，以誘導胚性愈傷組織的產生。所述誘導培養基是以MS為基礎培養基，並添加有2，4-D0.8-1.2mg/L、蔗糖25-35g/L，其PH在5.5-6.0之間。
2.灰樹花海藻糖合酶基因的克隆及其植物表達載體的構建和轉化農桿菌的過程從擔子菌灰樹花(Grifola frondosa)的菌絲體中提取總RNA，並純化出mRNA，再以mRNA為模板經反轉錄PCR(RT-PCR)擴增灰樹花的海藻糖合酶基因的cDNA並進行測序，所得的片段即為灰樹花的海藻糖合酶基因，之後把灰樹花的海藻糖合酶基因(TSase gene)取代植物表達載體pBBB-ETR中的ETR基因，得到灰樹花海藻糖合酶基因的植物表達載體pBBBT，該基因由串聯的雙拷貝CaMV35S啟動子和逆境誘導表達啟動子Prd29A驅動，最後採用三親交配法將其導入農桿菌EHA105中。
3.農桿菌介導海藻糖合酶基因對甘蔗胚性愈傷組織的轉化及轉基因植株的培育過程取含有灰樹花海藻糖合酶基因的農桿菌EHA105單菌落接種到YEP液體培養基中，於25-28℃，200rpm振蕩培養至OD600為0.6-1.0後，離心回收細菌體，再重懸於等體積含100-300μmol/L AS的MR液體培養基中繼續震蕩培養1.5-2.5h，以誘導細菌vir基因表達，此菌液即為轉化用工程菌液，之後把胚性愈傷組織轉入處理好的農桿菌菌液中，侵染25-35min後又用無菌吸水紙吸乾菌液，再把胚性愈傷組織接種於MR固體培養基上於18-22℃黑暗條件下共培養2-6天，其後將胚性愈傷組織用無菌水衝洗，並用無菌濾紙吸乾水份後接種於含抗性選擇的分化培養基上，於1500lux 12-16h/d光照條件下培養以誘導產生轉化的胚狀體，其間每10-15天在相同培養基中繼代一次，長出的胚狀體又轉入抗性分化培養基上於1500lux 12-16h/d光照條件下培養以誘導產生抗性小植株。產生的抗性小植株再轉接到抗性生根培養基上於1500lux 12-16h/d光照條件下培養以誘導生根並形成轉化植株。獲得的抗性植株再經過分子檢測篩選出轉基因植株。所述分化培養基是以MS為基礎培養基，並添加有KT1.0-3.0mg/L、蔗糖25-35g/L、PPT 0.5-1.0mg/L、羧苄青黴素300-600mg/L，其PH在5.5-6.0之間；所述抗性分化培養基是以MS為基礎培養基，並添加有BA0.5-2.0mg/L、KT 0.2-1.0mg/L、蔗糖25-35g/L、PPT 0.5-1.0mg/L、羧苄青黴素300-600mg/L，其PH在5.5-6.0之間；MR培養基是以1/5MS大量元素和MS其他成分為基礎培養基，並添加有2，4-D 0.8-1.2mg/L、果糖8-12mmol/L、葡萄糖8-12mmol/L、蔗糖25-35g/L，其PH在5.0-5.8之間；所述抗性生根培養基是以MS為基礎培養基，並添加有IAA0.5-2.0mg/L、PPT0.3-0.7mg/L、頭孢黴素200-500mg/L，蔗糖15-25g/L，其PH在5.5-6.0之間。
4.抗逆材料的鑑定和篩選把獲得的轉基因植株及相應的對照盆栽成活後分別在植物生長人工氣候箱、大棚溫室和大田進行逐級乾旱或冷脅迫，觀測其生長情況，結合抗逆的生理生化指標(如海藻糖含量、離體葉片保水率、質膜透性、丙二醛含量、光和效率等)的測定，初步篩選出抗逆的轉基因植株；對初選的抗逆轉基因植株的無性繁殖後代繼續進行植物生長人工氣候箱、大棚溫室和大田逐級乾旱或冷脅迫，觀測其生長情況，測定抗逆的生理生化指標(同上)再結合其性狀的重組分離情況，採用Southern雜交、PCR擴增、Bialaphos或PPT抗性表現等鑑定轉基因後代的遺傳穩定性，進一步選出抗逆的轉基因株系；對優選轉基因株系進行乾旱或冷脅迫，觀測其生長情況，結合抗逆生理生化指標的測定，並在田間進行工農藝性狀分析，最終評價轉基因植株及其後代的抗逆性，篩選出抗逆的轉基因甘蔗新種質。
權利要求
1.一種甘蔗抗逆新種質材料的培育方法，它包括甘蔗胚性愈傷組織的誘導過程、灰樹花海藻糖合酶基因植物表達載體的構建及轉化農桿菌過程、農桿菌介導海藻糖合酶基因對甘蔗胚性愈傷組織的轉化及轉基因植株的培育過程、抗逆材料的鑑定和篩選過程，其特徵在於(1)所述甘蔗胚性愈傷組織的誘導過程是以優良甘蔗栽培種的幼嫩葉片基部為外植體，外植體先用75％乙醇進行表面消毒後再用氯化汞溶液進行消毒，之後用無菌水進行衝洗並用無菌濾紙吸乾其表面水分，然後將其切成薄片接種於胚性愈傷組織誘導培養基上，於22-28℃避光條件下進行培養，以誘導胚性愈傷組織的產生；所述誘導培養基是以MS為基礎培養基，並添加有2，4-D0.8-1.2mg/L、蔗糖25-35g/L，其PH在5.5-6.0之間；(2)所述灰樹花海藻糖合酶基因的克隆及其植物表達載體的構建和轉化農桿菌的過程是從擔子菌灰樹花(Grifola frondosa)的菌絲體中提取總RNA，並純化出mRNA，再以mRNA為模板經反轉錄PCR(RT-PCR)擴增灰樹花的海藻糖合酶基因的cDNA並進行測序，所得的片段即為灰樹花的海藻糖合酶基因，之後把灰樹花的海藻糖合酶基因(TSase gene)取代植物表達載體pBBB-ETR中的ETR基因，得到灰樹花海藻糖合酶基因的植物表達載體pBBBT，該基因由串聯的雙拷貝CaMV35S啟動子和逆境誘導表達啟動子Prd29A驅動，最後採用三親交配法將其導入農桿菌EHA105中；(3)所述農桿菌介導海藻糖合酶基因對甘蔗胚性愈傷組織的轉化及轉基因植株的培育是取含有灰樹花海藻糖合酶基因的農桿菌EHA105單菌落接種到YEP液體培養基中，於25-28℃，200rpm振蕩培養至OD600為0.6-1.0後，離心回收細菌體，再重懸於等體積含100-300μmol/L AS的MR液體培養基中繼續震蕩培養1.5-2.5h，以誘導細菌vir基因表達，此菌液即為轉化用工程菌液，之後把胚性愈傷組織轉入處理好的農桿菌菌液中，侵染25-35min後又用無菌吸水紙吸乾菌液，再把胚性愈傷組織接種於MR固體培養基上於18-22℃黑暗條件下共培養4-6天，其後將胚性愈傷組織用無菌水衝洗，並用無菌濾紙吸乾水份後接種於含抗性選擇的分化培養基上，於1500lux 12-16h/d光照條件下培養以誘導產生轉化的胚狀體，其間每10-15天在相同培養基中繼代一次，長出的胚狀體又轉入抗性分化培養基上於1500lux 12-16h/d光照條件下培養以誘導產生抗性小植株，產生的抗性小植株再轉接到抗性生根培養基上於1500lux 12-16h/d光照條件下培養以誘導生根並形成轉化植株，獲得的抗性植株再經過分子檢測篩選出轉基因植株；所述分化培養基是以MS為基礎培養基，並添加有KT1.0-3.0mg/L、蔗糖25-35g/L，PPT 0.5-1.0mg/L、羧苄青黴素300-600mg/L，其PH在5.5-6.0之間；所述抗性分化培養基是以MS為基礎培養基，並添加有BA 0.5-2.0mg/L、KT 0.2-1.0mg/L、蔗糖25-35g/L，PPT 0.5-1.0mg/L、羧苄青黴素300-600mg/L，其PH在5.5-6.0之間；MR培養基是以1/5MS大量元素和MS其他成分為基礎培養基，並添加有2，4-D 0.8-1.2mg/L、果糖8-12mmol/L、葡萄糖8-12mmol/L、蔗糖25-35g/L，其PH在5.0-5.8之間；所述抗性生根培養基是以MS為基礎培養基，並添加有IAA0.5-2.0mg/L、PPT0.3-0.7mg/L、頭孢黴素200-500mg/L，蔗糖15-25g/L，其PH在5.5-6.0之間；(4)所述抗逆材料的鑑定和篩選過程是把獲得的轉基因植株及相應的對照盆栽成活後分別在植物生長人工氣候箱、大棚溫室和大田進行逐級乾旱或冷脅迫，觀測其生長情況，結合抗逆生理生化指標的測定，初步篩選出抗逆的轉基因植株；對初選的抗逆轉基因植株的無性繁殖後代繼續進行植物生長人工氣候箱、大棚溫室和大田逐級乾旱或冷脅迫，觀測其生長情況，測定抗逆生理生化指標再結合其性狀的重組分離情況，採用Southern雜交、PCR擴增、Bialaphos或PPT抗性表現等鑑定轉基因後代的遺傳穩定性，進一步選出抗逆的轉基因株系；對優選轉基因株系進行乾旱或冷脅迫，觀測其生長情況，結合抗逆生理生化指標的測定，並在田間進行工農藝性狀分析，最終評價轉基因植株及其後代的抗逆性，篩選出抗逆的轉基因甘蔗新種質。
全文摘要
本發明公開了一種利用植物基因工程技術培育甘蔗抗逆新種質的方法。該法把擔子菌灰樹花的海藻糖合酶基因通過農桿菌介導法轉入甘蔗的胚性細胞中，再通過胚狀體成苗途徑培育出完整的植株(轉基因植株)。所獲得的轉基因植株由於能夠合成和積累高水平的海藻糖，並表現出很強的抗逆性，在逆境條件下其比對照生長得好，而且產量和含糖量均得到了較大幅度的提高。利用該法培育甘蔗抗逆新種質具有培育周期短、效率高、成本低、不受外界條件影響等優點，其將加速我國甘蔗抗逆品種培育的進程，促進蔗糖業的發展，具有廣闊的應用前景。
文檔編號A01H1/00GK1644026SQ20051000710
公開日2005年7月27日 申請日期2005年1月19日 優先權日2005年1月19日
發明者張樹珍, 楊本鵬, 馮翠蓮, 曾豔波, 羅敬萍, 蔡文偉, 楊學 申請人:中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所, 中國熱帶農業科學院熱帶作物生物技術國家重點實驗室