Hcv疫苗的製作方法

2023-07-09 23:39:21 4

專利名稱：Hcv疫苗的製作方法
HCV疫苗
本發明涉及用於預防HCV感染和用於治療HCV感染的患者(特別 是慢性肝炎患者)的疫苗和疫苗接種策略。
大約3。/。的世界人口(約170百萬人)存在慢性C型肝炎病毒(HCV) 感染的情況。C型肝炎病毒(HCV)是一種黃病毒科的一員，目前有至 少6種HCV基因型，並且已經對50多種亞型進行了描述。在美國、歐 洲和日本，基因型1、 2和3是最普通的。HCV基因型的地理分布變化 極大，其中基因型la主要分布於美國和西歐的部分地區，而基因型 lb主要分布在歐洲南部和中歐地區。HCV通過腸胃外途徑或經皮途徑 傳播，並在肝細胞中複製。大約15%的患者經歷過與病毒清除和康復 有關的急性自限型肝炎。大約85%的感染者成為慢性攜帶者。感染過 程通常在無症狀表現的情況下以緩慢的進程持續若干年，然而最終， HCV主要導致肝硬變、晚期肝病和肝癌。CD4+輔助性T細胞(HTL) 和CD8+細胞毒T細胞(CTL)這二者的應答的強度和質量決定了患者 是康復(自發的或是經過治療後的結果)還是發展成慢性感染。在丙 型肝炎的自然發展過程中，在20-30年內，大約25%的患者發展成肝 硬變，而大約5%的患者發展成肝細胞癌。對這些慢性C型肝炎的後遺 症(包括肝移植)進行治療導致大量的費用產生。
目前，基於a幹擾素和利巴韋林的結合治療是針對慢性C型肝炎 患者的標準治療方法。然而，在大約50%的患者中，以及在僅僅43% 至46。/。的感染了在歐洲、美國和加拿大最普遍的、基因型為1型的丙 型肝炎病毒的患者中，都對所述治療產生了持續應答(SR)，其中所 述持續應答可定義為在停止治療後的6個月內，不存在可檢測的病毒 血症。這種治療方法的低的可耐受能力以及相當大的副作用無疑使新 的治療幹預(包括治療疫苗)成為必要。因此，對新的治療方式進行 評價是有根據的。基於a幹擾素的治療具有相當大的副作用，例如類流感綜合症、 發燒、頭痛、關節痛、肌痛、抑鬱、體重減輕、脫髮、白血球減少以 及血小板減少。這些副作用通常非常明顯，並且可以對生命的品質或 工作能力造成限制。幹擾素治療方法特別受到血液副作用(血小板減 少症)的限制，並且在許多已經患有血小板減少症(由於肝硬變造成， 並伴有脾腫大)的患者中是不當的。
利巴韋林也具有多種副作用，並且這些副作用在臨床上是重大的。 利巴韋林會誘導溶血作用和顯著的貧血，這可以導致向組織傳遞氧的 過程降低，並且利巴韋林與冠心病患者的心肌梗塞有關。此外，施用 利巴韋林會潛在地引起畸形、導致突變和致癌。因此，在對育兒期的 男性和女性患者進行利巴韋林的治療期間，必需進行避孕措施。
諸如HCV特異性蛋白酶、聚合酶或解旋酶抑制劑之類的其他可能 的治療策略還處於臨床前階段或早期臨床研發階段。目前，還不能預 見這些方法的臨床實用性。
由於所述標準的治療方法一方面存在這種有限的效力而另一方面 又存在著嚴重的副作用，所以迫切地需要用於C型肝炎的新的治療方 式。
一直以來所從事的研究策略在於研發出基於肽的疫苗。已經顯示 出這種途徑可能會成功的方法在(例如)專利文獻W0 01/24822、 W0 2004/024182、 W0 2005/04910或PCT/EP2005/054773中有所描述。
因此，本發明涉及用於預防或治療C型肝炎病毒(HCV)感染的方 法，其中每兩周對人類個體進行HCV疫苗給藥至少3次，所述HCV疫
苗包含
-有效量的至少一種HCV T細胞抗原，以及 -含有肽鍵的聚陽離子化合物。
根據本發明，令人驚奇地發現含有HCV T細胞抗原的HCV疫苗的 效力高度取決於給藥頻率。諸如給藥途徑、疫苗劑量的總數或每劑量 中使用的抗原的量之類的其他給藥參數也是重要的，但是對於最佳效 力而言，這些參數不如給藥頻率重要。對於待接種疫苗的人類個體而言，高效的給藥頻率會反應出疫苗應答與該個體的耐受能力之間的平 衡。根據本發明發現，與(例如)每天、每周或每月(四周)的給藥
頻率相比，所述的每兩周施用HCV T細胞疫苗的方式所產生的總效力 是優異的。這可以通過比較臨床試驗(在健康志願者以及患者(特別是 慢性HCV患者)中)得到證實。
根據本發明，優選的是儘可能嚴格地將每兩周的給藥頻率保持為 14天的時間間隔。然而，疫苗的給藥頻率還可以為IO天至20天的時 間間隔，優選為11天至18天的時間間隔，特別為12天至16天的時 間間隔(這種給藥頻率由於諸如可行性和患者的健康狀況之類的實際 環境而成為必要)，鑑於此類疫苗接種策略的標準實施方法，所以上 述給藥頻率也被認為是滿足所述的"每2周"進行給藥的要求的。
雖然進行2次或3次的每兩周給藥沒有消除疫苗的效力，但是優 選的是，根據本發明的HCV疫苗每2周給藥至少進行4次，優選為至 少6次，特別為至少8次。已經證實，這種為期12至16周的疫苗接 種策略對於慢性HCV患者而言是特別有效的。還可以採用間斷的疫苗 接種策略，例如在最初接種疫苗後，在中斷一段較長的時間後再進行 強化注射。例如，在初期疫苗接種階段(採用進行3、 4、 5、 6、 7或 8次的每2周疫苗接種方式)之後，接著進行後期的強化接種，例如 在所述的每2周疫苗接種之後進行1至12個月的強化接種，優選為2 至6個月的強化接種。
優選的是，將根據本發明的HCV疫苗中的HCV T細胞表位與合適 的佐劑、免疫刺激物質等結合，以便能夠針對應施用所述疫苗的個體 的免疫系統，增進或確保HCVT細胞抗原適當地呈遞。因此，除了 HCV 抗原以外，根據本發明的疫苗還包含含有肽鍵的聚陽離子化合物。優 選地，根據本發明的含有肽鍵的聚陽離子化合物選自鹼性多肽、有機 聚陽離子化合物、鹼性聚胺基酸及其混合物。優選的含有肽鍵的聚陽 離子化合物包含鏈長為至少4個胺基酸殘基的肽鏈。
因此，優選的是選自以下物質中的聚陽離子化合物，所迷物質包 括在多於8個、特別是多於20個的胺基酸殘基中含有多於20%、特
8別是多於50%的鹼性胺基酸的多肽；特別是聚精氨酸或聚賴氨酸；聚 陽離子型抗微生物肽；含有至少2個KLK基序(其由具有3至7個疏 水性胺基酸的連接體隔開)的肽；或其混合物。優選地，根據本發明 的含有肽鍵的聚陽離子化合物含有20至500個胺基酸殘基，特別是含 有30至200個胺基酸殘基。
這些聚陽離子化合物可以以化學方式或重組方式製備，或者可以 得自天然來源。
陽離子(多)肽還可是抗微生物肽。這些(多)肽可以來源於原 核生物，或者來源於動物或植物，或者可以以化學方式或重組方式制 備。所述肽還可以屬於防衛素的種類。這些肽的序列可以在(例如) 合適的綜述文獻(例如Curr Pharm Des. 2002; 8 (9) : 743-61 )中或 在以下網址所示的抗微生物序列資料庫中找到，所述網址為 http: //www, bbcm. univ. trieste. it/~ tossi/pag2. html。
這種宿主防衛肽或防禦物質也是根據本發明的聚陽離子聚合物的 優選形式。總體而言，可以作為終產物活化(或下調)合適的免疫系 統(優選通過APC (包括樹突細胞)介導)的化合物用作聚陽離子聚 合物。
特別優選的用作本發明的聚陽離子化合物的是由抗菌肽 (cathelicidin)衍生的抗微生物肽或其衍生物(參見國際專利申請 W0 02/13857,該專利文獻以引用方式併入本文)，特別是由哺乳動物 的抗菌肽衍生的抗微生物肽，所述抗菌肽優選得自人、牛或小鼠。
由天然來源衍生的聚陽離子化合物包括HIV-REV或HIV-TAT (衍 生所得的陽離子肽、觸角肽(antennapedia peptide)、脫乙醯殼多糖、 或殼多糖的其他衍生物)，或者釆用生物化學製備方法或重組製備方 法由所述這些肽或蛋白質衍生的其他的肽。其他優選的聚陽離子化合 物為抗微生物肽前體(cathelin)或與抗微生物肽前體相關的或由抗 微生物肽前體衍生的物質。例如，小鼠的抗微生物肽前體是胺基酸序 列為NH2-RLAGLLRKGGBKIGEKLKKIG0KIOFFQKLVPQPE-C00H的肽。相關
的或衍生的抗微生物肽前體物質具有全部或部分(具有至少15-20個胺基酸殘基)的抗微生物肽前體的序列。所述衍生物可以包括由非20 個標準胺基酸中的胺基酸對天然胺基酸進行取代或修飾而得的產物。 此外，其他的陽離子殘基可以被引入到這種抗微生物肽前體分子中。 這些抗微生物肽前體分子優選地與抗原相結合。令人驚奇地發現，在 未加入其他佐劑的條件下，這些抗微生物肽前體分子還可以有效地作 為用於抗原的佐劑。因此，在含有或不含有其他免疫活化物質的條件 下，都可以使用根據本發明的含有肽鍵的聚陽離子化合物(例如所述 的抗微生物肽前體分子)作為疫苗配製物中的有效的佐劑。
根據本發明使用的另一種優選的聚陽離子化合物是這樣的合成 肽，該合成肽含有至少2個KLK基序，並且該至少2個KLK基序被具 有3至7個疏水性胺基酸的連接體所隔開(參見國際專利申請W0 02/32451，該專利文獻以引用方式併入本文)。因此，優選的HCV疫 苗進一步含包含序列為RrXZXzNXZX-R2的肽，其中N為3至7的整數， 優選為5;X為帶正電荷的天然和/或非天然的胺基酸殘基；Z為選自L、 V、 I、 F和/或W中的胺基酸殘基；Rt和R2互相獨立地選自-H、-冊2、 -COCH;、 -COH、具有至多20個胺基酸殘基的肽、或者含有或不含有肽 的肽反應性基團或肽連接體；X-R2可以是所述多肽的C末端胺基酸殘 基的醯胺、酯或硫代酯。
根據本發明的聚陽離子化合物還可以與其他免疫物質 (inmmniser)相結合。對於所述的這種其他免疫物質的優選實例在專 利文獻WO 01/93905和WO 02/095027中有所公開(含I或含U的寡脫 氧核苷酸(1-或U-ODN);其中根據本發明，I-ODN還可以特別用作TLR 的配體或拮抗劑(參見下文))。優選地，I-或U-ODN可以與根據專利 文獻WO 02/32451中所述的分子(特別是KLKLLLLLKLK)或聚精氛酸 結合。
根據本發明使用的HCV T細胞抗原應為得自HCV蛋白的保守區域 的T細胞抗原。因此，優選地使用衍生自HCV蛋白質的保守多肽的表 位，已知該表位是患者中產生免疫應答的靶位。為了減少病毒逃脫的 情況，應該優選採用在最普遍的林系中保守的肽的庫。這保護了對HCV特異性的T細胞免疫的誘導過程。所述肽與MHC分子結合，從而被T 細胞受體識別。由於HU-A2是白種人中最普通的MHC分子(在MHC 為I類的情況下)，因此僅選出了與這種HLA等位基因產物相互作用 的多肽。因此，對於在這種人群中應該具有最佳效力的HCV疫苗而言， 根據本發明應該將帶有對HLA型特異的T細胞表位的這種HCV疫苗接 種到對某種HLA型(例如HLA-A2 )呈陽性的個體中。本發明使用的HCV T細胞抗原的長度是不重要的。應該考慮的是所需多肽的最佳的合成 方法、最佳的溶解性、每個多肽中T細胞表位的最佳的數目等。優選 地，HCV T細胞表位以由7至50個胺基酸殘基、優選為由8至45個 胺基酸殘基、特別是由8至20個胺基酸殘基構成的多肽形式提供，其 中每個多肽都包含至少1個T細胞表位。
根據本發明使用的優選的HCV T細胞抗原可以選自作為有效的表 位而在專利文獻WO 01/24822、 WO 2004/024182、 WO 2005/004910和 /或PCT/EP2005/054773中公開的那些。優選地，T細胞抗原選自
KFPGGG(2工VGGVYUuPRRGPRIjGVRATRK,
GYKVLVLNPSVAAT,
AYAAQG YKVLVIiN P SVAAT,
DLMGYIP(A/L)VGAPL,
GEVQWSTATQSFLATCINGVCWTV,
HMWNFISGIQYIAGIiSTIjPGNPA,
VDYPYR薩YPCT (V/I)N (F/Y) TIFK (V/I)證VGG麗RL,
AAWYEIiTPAETTVRLR,
GQGWRUjAPITAYSQQTRGKLGCIV,
I GLGKVIiVD工IAG YGAGVAGAIiVAFK,
FTDNSSPPAVPQT FQV,
LEDRDRSEI)SPLLLSTTEW,
YLVAYQATVCARAQAPPPSWD,
MSTNPKPQRKTKR訓R,
L工訓GSW畫RTALNCNDSIi,TTILGIGTVLDQAET,
FDS(S/V〉VLCECYDAG(A/C)AWYE,
ARL工VFP DLGVRVCEKMALY,
AFCSAMYVGDLCGSV,
GVIiFG3LAYFSMVGNW,
WCCSMS YTWTGAL工TPC,
TRVPYFVRAQGURA和
TTIiIjFNIILGGWVAAQ,.或者它們的片段，其中所述片段都包含至少7個、優選為至少8 個、特別是至少9個胺基酸殘基，並且所述胺基酸殘基含有至少1個 T細胞表位。優選地，根據本發明的HCV疫苗具有至少3個T細胞表 位，並且每個T細胞表位都得自不同的熱點表位，其中所述熱點表位 被定義為含有選自以下肽的表位AYAAQGYKVLVLNPSVAAT 、 GEVQVVSTATQSFLATCINGVCWTV和HMWNFISGIQYLAGLSTLPGNPA。此外， 優選地，根據本發明的HCV疫苗進一步包含熱點表位 KFPGGGQIVGGVYLLPRRGPRLGVRATRK和DLMGYIP (A/L) VGAPL中的至少1 種的表位。優選地，所述至少3個表位中的每個表位都選自以下三組
GYKVLVLNPSVAAT 、AYAAQGYKVL或AYAAQGYKVLVLNPSVAAT ， C工NGVCWTV 、 GEVQWSTATQSFLAT 或 GEVQWSTATQSFLATCINGVCWTV ; 和
HMWNFISGIQYIiAGLSTIiPGNPA,、 MWNFISGIQYIAGIjSTLPGN 、 NFISGIQYLAGIjST:LPGNPA、 QYLAGLSTL或HMWNF工SGI。此外，優選的是進一步包含選自以下的至 少1種表位KFPGGGQIVGGVYIjLPRRGPRIjGVRATRK、 KFPGGGQIVGGVY:L:LPRRGPRIi、 YLLPRRGPRL 、 LPRRGPRL, GPRLGVRAT 或 RLGVRATRK ; 或 者 DLMGY工PAV, GYIPLVGAPL或DLMGYIPLVGAPL 。
根據本發明的優選HCV疫苗包含以下表位中的至少2個表位
KFPGGGQIVGGVY:LLPRRGPR:LGVRATRK, DLMGY工PAV, LEDRDRSEIjSPIiliSTTEW, DYPYRLWHYPCTVNFTIFKV, GYKVIiVLNPSVAAT, C工NGVCWTV, AAWYELT-PAETWRIiR, YLVAYQATVCARAQAPPPSWD, TAYSQQTRGLLG, HMWNFISGIQY-LAGLSTLPGNPA, IGLGKVLVDILAGYGAGVAGAIiVAFK和 SMSYTWTGALITP,
優選地，HCV疫苗包含至少4個、優選為至少5個、至少6個、 至少8個上述表位，或者包含所有上述12個表位。
根據本發明的另一種優選的HCV疫苗包含以下表位中的至少2個 表位
KFPGGGQ工VGGVY;LIjPRRGPRIjGVRATRK, dypy薩hypctvnftifkv
AAWYELTPAETTVRLR, TAYSQQTRGLLG, ,NF工SG工QYIAG:LST:LPGNPA, IGLGKVLVDILAGYGAGVAGALVAFK和SMSY窗GALITP。優選地,這種HGV疫
苗包含至少4個、至少5個、特別是包含所有上述7個表位。
本發明的HCV疫苗優選包含至少1個A2表位和至少1個DR1表位。 本發明的HCV疫苗優選包含至少1個DR7表位。以下表位的組合被認為是特別有效的(至少l組上文所述的表位
是得自(1)至(5)組中的至少3組中的表位)
(1) KFPGGGQIVGGVYIiiLPRRGPRLGVRATRK或 KFPGGGQIVGGVYI/LPRRGPRIi或 YLLPRRGPRLGVRATRK或YLLPRRGPRL或LPRRGPRL或,LPRRGPRLGVRATRK
成GPRLGVRATRK成RLGVRATRK ,成KFPGGYLLPRRGPRLGVRATRK,
(2) AYAAQGYKVIiVLNPSVAAT 或'AYAAQGYKV!L 或AAQGYKVIiVLNPSVAAT 或 KVLVLNPSVAAT 或 GYKVLVLNPSVAAT 或' AYAAQGYKVLVLNPSV 或' AYAAQGYKVLVLNPSVAA或AAQGYKVLVLNPSVA或 AYAAQGYKVLPSVAAT 或 AYAAQGYKVLAAT,
(3) DLMGYIP(A/L)VGAPL 或DLMGYIPALVGAPL 或'DLMGY工P(A/L)VG或 DLMGYIP(A/L)VGAP或DLMGYIP(A/L)V 或DLMGY工PLVGAPL或 DLMGY-IPLVGA或DLMGYIPLV,
(4) GEVQWSTATQSFLATCINGVCWTV 或 GEVQWSTATQSFLAT 或 C工NGVCWTV 或 VSTATQSFLMCINGVCWTV 或TQSETJVTCINGVCWTV 或GEVQWSTATQSFIAT-CING或GEVQWSTATQSFLAT,(5) HMWNFISGIQYIAGIiSTLPGNPA 或 MWNFISG工QYLAGLST!LPGNPA 或 HMWNF工SGI或MWNFISGIQYLAGLSTLPGN 或 NFISG工QYLAGIiST!LPGN或 QY-LAGLSTL或 HMW諮SGIQYLAGIiSTIi 或HMWNFISGISTLPGNPA或 H,Y-LAGLSTLPG鵬或MWNFISGIQYLAGLSTLPGN特別是，已經證明含有表位
GYKVLVLNPSVAAT、DLMGYIPAV、CINGVCWTV和HMWNFISGIQYLAGLSTLPGNPA 的HCV疫苗是特別有效的。
如上所述，根據本發明的每2周給藥的疫苗包含由多於單——種 抗原形成的混合物("庫")。優選地，所述疫苗包含至少3種、優 選至少4種、特別是至少5種不同的HCV T細胞抗原。在其他實施方 案中或者如果(例如)對較大範圍內的人群進行疫苗接種，則所述混 合物可以包含5至20個、優選8至15個不同(即，具有不同的氨基 酸序列)的表位。
已經證明，被提議用於注射的肽抗原的量在之前公開的劑量範圍 內仍是有效的。因此，根據本發明的HCV疫苗的優選劑量(即，合併 在一起的肽的總量)為每份給藥劑量中包含1至20mg、優選3至10mg、 特別是4至6mg的HCV T細胞抗原。
如上所述，已經發現給藥途徑對於達到最佳的效力也是重要的。 已報導的T細胞疫苗的有效給藥途徑也適用於本發明。優選地，每2 周對根據本發明的HCV疫苗進行皮下給藥或皮內給藥，特別是進行皮內給藥(在本說明書中，術語真皮內(i.d.)和皮內(i.C.)可互換使用)。
根據本發明的HCV疫苗可以進一步包含免疫刺激化合物，以用於 進一步刺激對HCV抗原的免疫應答。優選地，在根據本發明的藥物制 劑中進一步包含的免疫刺激化合物選自免疫刺激脫氧核苷酸、a 1 umn、 弗羅因德完全佐劑、弗羅因德不完全佐劑、免疫應答調節劑、神經活 性物質、特別是人類生長激素、或它們的組合。免疫刺激脫氧核苷酸 為(例如)天然或人工合成的含有CpG的DNA，由無脊推動物衍生的 一小段伸長的DM，或是在某一鹼基位置處含有非曱基化的胞嘧啶-鳥 噪呤二核苷酸(CpG)的短的寡核苷酸(ODN)形式及含有肌苷和/或尿 苷的0DN ( I-0DN、 U-0DN)形式，如專利文獻W0 01/93905和W0 02/095027所述。神經活性物質，例如與聚陽離子化合物結合的神經 活性物質在專利文獻WO 01/24822中有所描述。
在本發明的研究過程中，發現如果將根據本發明的HCV疫苗與免 疫應答調節劑(優選與toll樣受體(TLR)7拮抗劑或配體、特別是與 toll樣受體(TLR)7拮抗劑)結合給藥，就可以獲得優異的效果。免疫 應答調節劑(IRM)是一種選擇性地活化toll樣受體(TLR)的獨特的 合成分子，其中所述toll樣受體對於刺激先天的和細胞介導的免疫過 程是重要的。免疫應答調節劑具有範圍廣泛的、潛在且重要的應用範 圍，包括增強對疫苗抗原的免疫應答以及疾病特異性的單一療法。IRM 的獨特的TLR活化特徵鐠(例如TLR3、 TLR7、 TLR8或TLR7和8、 TLR9 ) 使得可以選擇性地激活多種細胞因子，例如幹擾素a(IFN)、白細胞 介素-12、 IFN-Y和腫瘤壞死因子a。由IRM誘導的一系列細胞因子增 強了細胞介導的免疫過程，並使免疫過程發展成強化了它們作為疫苗 佐劑的能力的Thl應答。IRM在(例如)專利文獻US 4， 689， 338、 US 5,238,944、 US 6,083,505、 US 2004/0076633、 WO 03/080114和W0 2005/025583中有所公開。
優選地，HCV疫苗與1-(2-甲基丙基)-lH-咪唑並[4，5-c]喹啉-4-胺 (咪喹莫特)結合給藥，優選地，作為局部施用的製劑，特別是作 為骨狀物。這種含有咪喹莫特的骨狀物的實例為購自Aldara，的商品。
14AldaraTM是含有咪喹莫特的貪狀物的商品名。每克5%的骨狀物在 水包油狀雪花骨底料中含有50mg的咪喹莫特，其中所述底料由異硬脂 酸、十六醇、十八醇、白凡士林、聚山梨醇酯60、脫水山梨糖醇單硬 脂酸酯、甘油、黃原膠、純淨水、苯甲醇、羥苯甲酯和鞋苯丙酯構成。
根據本發明的優選實施方案，將本發明的HCV疫苗以皮下或皮內 (特別是皮內)的方式進行給藥，並且將咪喹莫特以骨狀物(優選為 含量為5 (重量)％的骨狀物)的形式直接施用在注射位點上。咪者莫 特(AldaraTM)作為第一種市售的IRM分子被批准用於治療病毒引起的 狀況、外部生殖器和肛周尖銳溼疣。其他適應徵包括光化性角化病和 基底細胞癌。IRM，特別是咪喹莫特，表現出活化朗格漢斯細胞並增強 它們向淋巴結遷移的能力。最近，咪喹莫特還被研製作為人類試驗中 用於黑素瘤多肽疫苗的佐劑。
優選地，為了增強根據本發明的HCV疫苗的免疫原性，可以在每 次接種疫苗之後都將所述的骨狀物直接施用在注射位點(大約3x3 cm 二9cm"上，並且在至少8小時後，可以對注射位點進行溫和的清洗。 所述的骨狀物還可以在注射之後的某一時間施用，例如在最初注射後 的4至24小時之後，優選為6至18小時，特別是10至16小時。可 選擇地，所述骨狀物可以在接種疫苗之前施用，例如在接種疫苗之前 的24小時施用。
根據另一個方面，本發明涉及至少1種HCV T細胞抗原和含有肽 鍵的聚陽離子化合物在製備HCV疫苗中的用途，其中所述HCV疫苗通 過每2周給藥、至少進行3次來治療和預防HCV感染。
本發明的另一個方面涉及用於治療和預防HCV感染的試劑盒，該 試劑盒含有如本文所定義的至少4個劑量的HCV疫苗以及用於每2周 給藥的給藥工具。
優選地，根據本發明的試劑盒進一步包含如本文所定義的免疫應 答調節劑。
對根據本發明的試劑盒進行特別設計，以用於每2周給藥。因此， 優選地本發明的試劑盒還包含用於幫助患者或負責進行每2周給藥的醫務人員的裝置(工具)，例如用於進行每2周給藥處理的給藥手冊、 用於進行每2周給藥處理的日曆、具有每2周的鬧鐘功能的電子提醒 日曆、或它們的組合。
在以下的實施例和附圖
中對本發明進行進一步的描述，但是這些 描述不限定本發明。
圖l顯示，與皮下注射相比，在HLA-A的201轉基因小鼠中真皮內 施用HCV疫苗誘導出更強的HCV肽特異性的T細胞應答，該應答可以 通過共同施用AldaraTM而進一步增強(免疫刺激劑咪壹莫特)。
圖2和3顯示，在HLA-A*0201轉基因小鼠中增加的注射次數增強 了 HCV肽的特異性免疫應答，並且施用額外的免疫刺激劑產生更快且 更顯著的針對某種HCV特異性的MHC I類限制性表位的應答(CD8+T 細胞應答)。
圖4示出對HLA-A*0201轉基因小鼠進行間隔注射方法會對短期應 答產生影響，並且共同施用其他的免疫刺激劑會誘導持續的針對某種 HCV特異性的MHC I類限制性表位的應答。
圖5示出了根據實施例5至7的臨床研究方案。
圖6示出了對釆用最佳時間表的IC41疫苗產生的千擾素Y酶聯免 疫斑點應答的時間過程圖。圖中示出了在5個處理組中應答者的總酶 聯免疫斑點應答(CD4和CD8 T細胞)(A)和CD8 T細胞應答(B ) 的中位數(用於計算疫苗的總量以及I類斑點的總數，參見實施例5 至7) 。 (C)採用最佳的和老式的時間表的重要的CD8+ I類T細胞 應答。圖中示出了在所有的酶聯免疫斑點I類應答者中I類斑點的總 數的中位數。
實施例
實施例1:
施用位點對HLA-A*0201轉基因小鼠中的HCV肽特異性T細胞應答 的影響
小鼠HLA-A*0201轉基因小鼠(HHD. 2) 疫苗臨床批號PD03127 (批號K)對每隻小鼠使用的10(Vl體積的注射物包含
抗原Ipep 83 (KFPGGGQIVGGVYLLPRRGPRL) 200pg， Ipep 84 (GYKVLVLNPSVAAT) 20(Vg， Ipep 87 (DLMGYIPAV) 200ng, Ipep 89 (CINGVCWTV) 200ng， Ipep 1426 (HMWNFISGIQYLAGLSTLPGNPA) 200ng;
佐劑平均聚合度(使用多角度雷射散射儀進行測定(MALLS))為 40至50個精氨酸殘基的聚-L-精氨酸，批號113K7277, Sigma Aldrich 公司，楊pg;
其他佐劑含有5%咪喹莫特的Aldara , —種通過TLR7起作用 的免疫刺激劑，3M Health Care有限公司，劑量為大約20mg/只小
鼠；
配製緩衝劑5mM磷酸鹽/ 270mM山梨醇。 實驗設定每組IO只小鼠
1. 皮下注射入側腹，
2. 真皮內注射入背部，
3. 真皮內注射入背部，然後在注射區域立即施用Aldara "*骨狀物。
在第0、 14和28天時，在如上所述的不同位置處，向小鼠注射總 量為lOOpl /只小鼠的疫苗，其中所述疫苗含有上文列出的物質。在 第35天時，取得各實驗組中的小鼠的脾，並採用磁選分離技術(MACS) 富集CD4+T細胞。除去了 CD4+T細胞的脾細胞用於測定CD8+T細胞 的應答。採用IFN-y酶聯免疫斑點檢測法測定MHC II類限制性T細 胞(CD4+ T細胞)和MHC I類限制性T細胞(CD8+ T細胞)對各種單 一的HCV衍生肽的應答情況。總體而言，用非相關肽進行的再刺激不 能產生IFN-y 。
結果
如圖l所示，在進行皮下注射之後，可以檢測到MHC I類限制性 CD8+ T細胞對Ipeps 84、 87和89做出的應答，以及MHC II類限制 性CD4+ T細胞對Ipeps 84和1426 ^t出的應答。這些應答可以通過真 皮內施用疫苗而進一步增強。此外，在進行真皮內注射之後直接共同施用AldaraTM會進一步增強所檢測到的應答，特別是匪C I類限制性 CD8+ T細胞對Ipep 87做出的應答。
總之，與皮下注射相比，真皮內施用HCV疫苗會誘導出更強的HCV 肽特異性T細胞的應答，這種應答可通過共同施用AldaraTM而進一步 增強。
實施例2:
在經過1次、2次或3次注射之後，在HLA-A的201轉基因小鼠中
產生的HCV肽特異性MHC 1類限制性008+ T細胞的應答情況 小鼠HLA-A"201轉基因小鼠(HHD. 2) 疫苗對每隻小鼠使用的10(^1體積的注射物包含 抗原Ipep 83 200pg, Ipep 84 200|iig， Ipep 87 200pg, Ipep 89
200|ag， Ipep 1426 200pg;
佐劑平均聚合度(使用MALLS進行測定)為40至50個精氨酸
殘基的聚-L-精氨酸，批號113K7277， Sigma Aldrich公司，400jug; 其他佐劑含有5%咪喻莫特的Aldara TM， 一種通過TLR7起作用
的免疫刺激劑，3M Health Care有限公司，劑量為大約20mg/只小
鼠；
配製緩沖劑5mM磷酸鹽/ 270mM山梨醇。 實驗設定每組30隻小鼠(10隻/分析的時間點)
1. 真皮內注射入背部，
2. 真皮內注射入背部，然後在注射區域立即施用Aldara 骨狀物。
在第0、 14和28天時，以真皮內注射的方式向小鼠注射總量為 100^1 /只小鼠的疫苗，其中所述疫苗含有上文列出的物質。在第7、 21和35天時，取得各實驗組中的小鼠的脾，並採用磁選分離技術 (MACS)除去CD4+T細胞。釆用酶聯免疫斑點檢測法測定在使用單一 的HCV衍生肽進行再刺激後由MHC I類限制性CD8+ T細胞產生的IFN-
y。總體而言，用非相關肽進行的再刺激不能產生IFN-y。
此外，進行體內CTL檢測，以測定在進行單--次注射之後或在進行強化注射之後MHC I類限制性CD8+ T細胞的效應物功能。簡言之， 由首次用於實驗的小鼠製備的抗原呈遞細胞(APC)或者載有Ipep 87 並用CFSE^示記，或者(為了進行對照)栽有Ipepl247 (非相關肽) 並用CFSE申標記，或者未載有肽，其用CFSE"標記。將這些APC混合 在一起(1: 1: 1)，並在第6、 20或34天時通過靜脈注射將其適當地 轉移到接種了疫苗的小鼠體內。 一天後(即，第7、 21或35天)，進 行FACS分析，以測定經轉移的載有相關肽的APC是否存在(如果所述 APC不存在，則表示發生了由疫苗誘導的殺死行為)。在任何實驗中 都不能觀察到未負載的APC的殺死行為。 結果
如圖2中上部的圖所示，在經過單--次真皮內注射或強化的真
皮內注射之後，可以檢測到由MHC I類限制性CD8+ T細胞產生的HCV 肽特異性IFN-y ，其差別在於對於某些肽的應答強度不同。
詳細而言，在經過單--次真皮內注射之後，只檢測到對Ipep89
的應答，而在經過2次注射後，以相當的強度誘導出對Ipep84、 87 和89的應答。這種應答可通過第3次注射而進一步增強，其中清楚地 示出對Ipep87的應答要優於對Ipep89和84的應答。
與此形成對比的是，通過共同施用AldaraTM在單--次注射後已
經誘導出對所有3種肽的應答。在第2次施用之後，已經可以看出佔 有優勢的對Ipep87的應答。第3次施用進一步增強了 Ipep87特異性 應答的強度。
如圖2中下部的圖所示，需要進行2次注射來誘導MHC I類限制 性CD8+ T細胞的Ipep87特異性效應物的功能。此外，在共同施用 AldaraTM之後，效應物的功能顯著且強烈地增強。
總之，結果顯示，注射次數的增加會增強HCV特異性的免疫應答。 此外，其他免疫刺激劑(AldaraTM)的施用會產生更快且更明顯的針對 某些MHC 1類限制性008+ T細胞表位的應答。
實施例3:
在經過3次或6次注射之後，在HLA-A*0201轉基因小鼠中產生的HCV肽特異性MHC I類限制性CD8+ T細胞的應答情況
小鼠HLA-A"201轉基因小鼠(HHD. 2)
疫苗臨床批號PD03127 (批號K)
對每隻小鼠使用的100]Lil體積的注射物包含
抗原Ipep 83 200pg, Ipep 84 200pg， Ipep 87 200pg， Ipep 89 200jug， Ipep 1426 200jng;
佐劑平均聚合度(使用MALLS進行測定)為40至50個精氨酸 殘基的聚-L-精氨酸，批號113K7277， Sigma Aldrich公司，400^ig;
其他佐劑含有5°/。咪喹莫特的Aldara TM， 一種通過TLR7起作用 的免疫刺激劑，3M Health Care有限公司，劑量為大約20mg/只小 鼠；
配製緩衝劑5mM磷酸鹽/ 270mM山梨醇。 實驗設定每組20隻小鼠(10隻/分析的時間點)
1. 皮下注射入側腹，
2. 真皮內注射入背部，
3. 真皮內注射入背部，然後在注射區域立即施用Aldara頂骨狀物。
在第0、 14、 28、 43、 58和71天時，在如上所述的不同位置處， 向小鼠注射總量為100nl /只小鼠的疫苗，其中所述疫苗含有上文列 出的物質。在第35或78天時，取得各實驗組中的小鼠的脾，並採用 磁選分離技術(MACS )除去CD4+ T細胞。採用酶聯免疫斑點檢測法測 定在使用單一的HCV衍生肽進行再刺激後由MHC I類限制性CD8+ T 細胞產生的IFN-y。總體而言，用非相關肽進行的再刺激不能產生 IFN-y 。
結果
圖3示出了在經過6次及3次注射之後由所得的MHC I類限制性 CD8+ T細胞產生的IFN-y 。特別針對Ipep87產生的應答可通過進行 額外的疫苗接種而得到增強，並且與施用位點無關。最強烈的應答總 是在共同施用疫苗和Aldara 之後觀察到。
20總之，數據表明，注射次數的增加會增強HCV特異性的免疫應答。 此外，其他免疫刺激劑(Aldara )的施用會產生更明顯的針對某些 MHC I類限制性CD8+ T細胞表位的應答。
實施例4:
基於不同的注射時間間隔，在經過3次注射之後，在HLA-A的201
轉基因小鼠中產生的短期及長期的HCV肽特異性MHC I類限制性008+
T細胞的應答情況
小鼠HLA-A*0201轉基因小鼠(HHD. 2 )
疫苗對每隻小鼠使用的lOOnl體積的注射物包含
抗原Ipep 83 200jig， Ipep 84 20(Vg, Ipep 87 200jig， Ipep 89
20(Vg, Ipep 1426 2(%g;
佐劑平均聚合度(使用MALLS進行測定)為40至50個精氨酸
殘基的聚-L-精氨酸，批號114K7276， Sigma Aldrich公司，400pg; 其他佐劑含有5V米喹莫特的Aldara ， 一種通過TLR7起作用
的免疫刺激劑，3M Health Care有限公司，劑量為大約20mg/只小
鼠；
配製緩沖劑5mM磷酸鹽/ 270mM山梨醇。 實驗設定每組20隻小鼠(10隻/分析的時間點)
1. 皮下注射入側腹，
2. 真皮內注射入背部，
3. 真皮內注射入背部，然後在注射區域立即施用Aldara 7"骨狀物。
基於1周、2周或4周的時間間隔，在如上所述的不同位置處， 向小鼠注射總量為10(^1 /只小鼠的疫苗3次，其中所述疫苗含有上 文列出的物質。在第3次注射後的第7天和第IIO天時，取得各實驗 組中的小鼠的脾，並採用磁選分離技術(MACS)除去CD4+T細胞，採 用酶聯免疫斑點檢測法測定在使用單一的HCV衍生肽進行再刺激後由 MHC I類限制性CD8+T細胞產生的IFN-y 。總體而言，用非相關肽進
行的再刺激不能產生IFN-y。結果
如圖4中上部的圖所示，可以觀察到，在各個施用位置處，與注 射時間間隔為l周或4周的情況相比，在注射時間間隔為2周的情況 下，在經過皮下注射或真皮內注射之後所產生的匪C 1類限制性008+ T細胞的應答要稍微強一些。在共同施用疫苗和AldaraTM之後，沒有 觀察到由於注射時間間隔的影響所導致的顯著差別。
圖4中下部的圖示出了不同的注射時間間隔沒有對HCV肽特異性 腦c i類限制性008+T細胞的應答的持續性產生影響。但是，圖中數 據清楚地表明，與真皮內或皮下單獨注射疫苗的情況相比，在共同施 用AldaraTM之後，能夠更優異地誘導出對Ipep 87和Ipep 89特異性 的MHC I類限制性CD8+ T細胞的應答。
總之，數據表明，注射的時間間隔會對短期應答產生影響，並且 共同施用其他的免疫刺激劑(AldaraTM)會誘導出極為穩定的針對某些 HCV特異性MHC I類限制性表位的應答。
實施例5至7:
臨床試驗
臨床試驗是用HCV T細胞抗原庫進行的(其中所述疫苗被命名為 "IC41",並且是由代表了 HCV的保守T細胞表位的合成肽與作為合 成的T細胞佐劑的聚-L-精氨酸形成的混合物構成的；IC41包含得自 HCV多肽的不同區域的5個肽，i.a.以下3個表位 HMWNFISGIQYLAGLSTLPGNPA、 CINGVCWTV和DLMGYIPAV)。因此，IC41 含有5個主要衍生自非結構區域NS3和NS4的合成肽，已知，NS3和 NS4是患者中產生免疫應答的靶物。它們含有至少4個HLA-A的201限 制性CTL表位和3個高度混雜的CD4+輔助性T細胞表位，並且已經顯 示，在對標準治療產生應答或由HCV發生自發康復的患者中，所述的 所有這些表位都是被靶向的。在基因型1中，有l個例外的多肽的序 列是高度保守的。IC41含有聚-L-精氨酸作為合成佐劑，在動物研究 中，聚-L-精氨酸已經顯示能夠增強Thl/Tcl (IFN-y )的應答。I(Ml 的臨床數據表明，施用所述疫苗是安全的並且耐受性良好，並且在健康志願者以及慢性HCV患者中，IC41能夠誘導HCV特異性的Thl/Tcl 應答。
採用如上所述的有效的T細胞檢測法來讀取疫苗的免疫原性(y 幹擾素酶聯免疫斑點檢測法、T細胞增殖檢測法、HLA四聚體/FACS檢 測法)。這些檢測法允許對由治療性HCV疫苗IC41所誘導的表位特異 性T細胞應答進行可靠的測定。所述疫苗誘導的T細胞免疫應答起到 了效力的替代參數的作用。酶聯免疫斑點檢測法可以對諸如人類血液 之類的生物樣品中的肽特異性功能性(即，分泌細胞因子的)T細胞 進行定量。所述檢測的基礎在於T細胞在受到由T細胞受體特異性 識別的肽的刺激之後，會分泌諸如IFN-Y之類的細胞因子。該反應可 以在96孔板上進行。在此類板的過濾器孔中塗敷對IFN-Y特異性的 Mab。結果，每個分泌IFN-y的細胞都會留下IFN-y斑點，該斑點可 以通過隨後進行的顯色反應而顯現出來。這些斑點可以使用自動化的 多孔板讀取器計數。所得的數目為樣品中肽特異性的、分泌IFN-y的 T細胞的個數的量度。分別對IC41中的5個肽的每一個肽進行酶聯免 疫斑點檢測，此外，分別對較長的肽中所包含的3個HLA-A2表位進行 測定。
在臨床實驗IC41-102 (健康志願者)、IC"-201 (慢性非應答患 者，PCT/EP2005/054773 )和IC41-103 (疫苗應用達到最佳的健康志 願者)中，對每個酶聯免疫斑點檢測板都採用外標物，這樣可以對由 這些臨床實驗所得的數據進行直接的比較(對IC41-102、 IC41-201 和IC41-103進行的臨床研究的設計如圖6所示)。
實施例5:
得到改善的應答者的應答速率
如果在接種疫苗過程中或在接種疫苗之後的任何時間點，所測定 的任何肽都比基線值高至少3倍，或者如果基線值為0，而所測定的 任何肽至少明顯呈陽性，則對該應答評分。
與採用每4周進行接種、進行4次的時間表的IC41-102中的情況
相比，IC41-103中所有組都顯示改善的應答速率。在採用最頻繁(每周1次)的時間表的第3組中，得到了 CD8+T細胞應答的最高的應答 速率。 一種可能的解釋為至少部分CD4+ T輔助性細胞不依賴於通過強 烈且頻繁的疫苗刺激而活化的CD8+ T細胞。
表1:與IC41-102的第K組相比，在IC41-103研究的第1-5組 中的酶聯免疫斑點的應答者速率
(NRE:在酶聯免疫斑點檢測中的非應答者；REIV: CD8+ T細胞 酶聯免疫斑點應答者；REV: CD4+T細胞應答者)
組別 所分析的N值
NRE
1
3
4
102-K
8
7
8
9 9
12
CD8+ (REIV)
7
5
8 7
6 5
CD4+ (REV) 8
5
7
8
6
。細
88% 71% 簡 78% 67% 42%
%CD4
100%
71%
63%
78%
89%
50%
實施例6:
疫苗的總量與增多的I類酶聯免疫斑點的總數
為了定量地評估由IC41疫苗接種引起的IFN-Y T細胞應答情況， 對每個肽測定酶聯免疫斑點的應答的時程通過增加酶聯免疫斑點來 計算疫苗的總量，其中所述酶聯免疫斑點是在背景被減掉(即，減去 非相關的HIV肽)之後針對IC41的5個肽中的每個肽分別測定的酶聯 免疫斑點。通過增加斑點來計算I類酶聯免疫斑點的總數，其中所述 酶聯免疫斑點是在背景被減掉(即，減去非相關的HIV肽)之後針對 IC41的5個HLA-A2表位中的每個表位分別測定的酶聯免疫斑點。測 定出疫苗的最大總量以及I類斑點的最大總數(通常，在最後接種疫 苗後記錄這2個值)，並測定出每組中所有應答者的中位數(參見表 2)。
24表2:通過IC41得到的酶聯免疫斑點的總數。為了測定疫苗的總 量和I類斑點的總數，參見下表，n表示為酶聯免疫斑點應答者的數
IC41治療在所有酶聯免疫斑點應答者 中，疫苗總量的中位數(每l 百萬個PBMC中的斑點數)在所有I類酶聯免疫斑點應 答者中，I類(CD8+ T細胞) 斑點的總數的中位數(每1 百萬個PBMC中的斑點數)
所有的IC41-102和35-40 (n=37 )20 (n=23)
201的ve醒組
第1組(n=8 )100 (n-8)45 (n=7)
第2組(n=7 )60 (n=5)50 (n=5)
笫3組(n=8 )45 (n=8)35 ( n=8)
第4組(n=9 )90 (n=8 )60 (n=7)
第5組(n-9 )95 (n=8)105 (n=6)
在IC41-201中，在多個患者中觀察到I型(分泌IFN-y ) CD8+T 細胞應答與HCV的RNA減少相關可利用的數據表明，為了使HCV的 RNA快速減少1個loglO以上，需要每l百萬個PBMC至少50個的CD8+ T細胞酶聯免疫斑點的閾值水平。因此，最佳研究結果的一個目標是
在至少一部分疫苗中取得所述水平的免疫原性。
如表2所示，在IC41-103的第1、 2和4組中，在酶聯免疫斑點
的I類應答者中，I類斑點的總數的中位數達到了所述的閾值，而第3 組和採用老式的每4周進行接種，進行4次(IC41-102)或6次 (IC41-201)時間表的所有應答者沒有達到所述的閾值。清楚地是， IC41-103的第5組是最佳的，其取得了為所需閾值的2倍以上的免疫 斑點數。
第1至5組中所述疫苗總量的中位數和I類斑點總量的中位數的 時程如圖6A和B所示。重要的CD8+ I類T細胞應答急劇增加的情況 與老式的每4周進行接種，進行4次(IC41-102 )或6次(IC41-201 ) 的時間表中所產生的情況的比較如圖6C所示。
實施例7:
經改善的重要的I類(CD8+) T細胞的應答範圍為了防止諸如表位發生突變而逃脫的逃脫機制，另一個目標是取
得廣泛的應答，即，在相同的時間且在同一個體中，T細胞同時對1 種以上的I類表位產生應答。在之前結束的、採用了老式的每4周進 行接種進行4次(IC41-102)或6次(IC41-201)的時間表的2個研 究中，最多由l種主要的CD8+ T細胞表位誘導應答。
為了對比I類應答的範圍，在每組中的所有酶聯免疫斑點I類應 答者中，測定增強了某一受試對象中的應答的CD8+T細胞表位的數目 的中位數(參見表3)。
如表3所示，在IC41-103的第1、 3和4組中，增強了某一受試 對象中的應答的CD8+ T細胞表位的數目的中位數可以為2倍。此外， IC41-103的第5組是最佳的，其取得了在某一受試對象中同時靶向3 (中位數)個(得自5個可行的CD8+ T細胞表位)CD8+ T細胞表位。
表3:重要的I類(CD8+)T細胞的應答範圍。總數N表示接受治 療的受試對象/患者的數量，n表示為酶聯免疫斑點I類應答者的數量。
IC41治療總數N在某一受試對象中的CD8+細胞毒T細胞表 位的數量的中位數
所 有 的1201 (n=23)
IC41-102 和
201的ve頭組
第1組82 (n=7 )
第2組71 U=5 )
第3組82 (n=8 )
第4組92 (n=7 )
笫5組93 ( n-6 )
這些臨床和臨床前的結果表明，在幹擾素Y酶聯免疫斑點應答的 強度和範圍方面(參見表2和3)，確定IC41的最佳應用為第5組， 其注射時間間隔為最優選的2個星期。注射時間間隔為l個星期的情 況要比注射時間間隔為2個星期的情況差一些，注射時間間隔為4個 星期的情況明顯更差。皮內(真皮內)治療比皮下治療(在第1組(s.c.) 和第4組(i.d.)之間沒有差別)稍微優異一些，但是最好的效果為第 5組。局部施用AldaraTV咪喹莫特( 一種toll樣受體7拮抗劑)使得 臨床效果得以改善。第3組(時間間隔為1個星期，s. c.)顯示出，產生100%的CD8+ T細胞應答，但是僅為63%的CD4+ T細胞應答(參見表1所示的應答 者速率)。這可解釋為CD4+T細胞不依賴於通過頻繁(每星期1次) 施用而產生的CD8+T細胞活化。通過第l組(s.c.)和第4組(i.d.)的 對比表明，關於施用途徑沒有明顯的差別。此外，還顯示出，絕對的 注射次數似乎不能增強強度(表2:第2組和第3組進行了 16次疫苗 接種而其他各組進行了 8次疫苗接種；圖5的上部在第8周(相當於 在進行4次疫苗接種後或第2組和第3組中的8次疫苗接種後)時情況 已經穩定)。最後，CD8+應答的範圍-在第5組中達到最佳的、在單個 受試對象/患者中對多種I類表位(需要對在較長序列內含有最少的I 類表位的"熱點，，肽(W0 2004/024182)進行處理)同時產生應答的情況。
權利要求
1. 用於預防或治療C型肝炎病毒(HCV)感染的方法，其中每2周對人類個體進行HCV疫苗給藥，至少3次，所述HCV疫苗包含-有效量的至少一種HCV T細胞抗原，以及-含有肽鍵的聚陽離子化合物。
2. 根據權利要求1所述的方法，其中每2周進行HCV疫苗給藥， 至少4次，優選至少6次。
3. 根據權利要求1所述的方法，其中每2周進行HCV疫苗給藥， 至少8次。
4. 根據權利要求1至3的任意一項中所述的方法，其中所述的含 有肽鍵的聚陽離子化合物選自鹼性多肽、有機聚陽離子化合物、鹼性 聚胺基酸和它們的混合物。
5. 根據權利要求1至4的任意一項中所述的方法，其中所迷的含 有肽鍵的聚陽離子化合物包含鏈長為至少4個胺基酸殘基的肽鏈。
6. 根據權利要求1至4的任意一項中所述的方法，其中所述的含 有肽鍵的聚陽離子化合物選自在多於8個、特別是多於20個的氨基 酸殘基中含有多於20%、特別是多於50%的鹼性胺基酸的多肽，特別是 聚精氨酸或聚賴氨酸，聚陽離子型抗微生物肽，含有至少2個由具有 3至7個疏水性胺基酸的連接體隔開的KLK基序的肽，或它們的混合物。
7. 根據權利要求1至6的任意一項中所述的方法，其中所述的含 有肽鍵的聚陽離子化合物含有20至500個胺基酸殘基，特別是含有30至2Q0個胺基酸殘基。
8. 根據權利要求1至7的任意一項中所述的方法，其中所述的 HCV T細胞抗原為由7至50個胺基酸殘基、優選為8至45個胺基酸 殘基、特別是8至20個胺基酸殘基構成的多肽，其中每個所述肽都包 含至少1個T細胞表位。
9. 根據權利要求1至8的任意一項中所述的方法，其中所述的 HCV T細胞抗原選自以下的一個或多個KFPGGGGIVGGVYLIiPRRGPRIiGVRATRK, GY跳VIiNPSVAAT,ayaaqgykviivlnpsvaat,dlmgyip(a/l)vgapl,gevqwstatqsflatc工ngvcwtv,hmwnfisg工qy:laglstijPgnpa,vdypyrlwhypct (v/i) n (f/y) tifk (v/工)麗vggvehrl,aawyelt paettvrlr,gqgwrklapitaysqqtrgklgciv,iglgkvlvdi lagygagvagaiivafk,ft dn s s p pavpqt fqv,ledrdrselsplllsttew,ylvayqatvcaraqap p p swd,mstnpkpgrktkrntnr,lintngswh工nrtalncnds:l,TT工LGIGTVIjDQAET,fds(s/v)vlcecydag(a/c)awye,arlivfpdlgvrvcekmaly,AFCSAMYVGDIiCGSV,GVLFGIiAYFSMVGNW,wccsmsytwtgalitpc,TRVPYFVRAQGLIRA和TTIiliFNILGGWVAAQ'.或者它們的片段，其中所述片段包含至少7個、優選為至少8個、 特別是至少9個胺基酸殘基，並且所述胺基酸殘基含有至少1個T細 胞表位。
10. 根據權利要求1至9的任意一項中所述的方法，其中所述的 HCV疫苗包含由至少3種、優選為至少4種、特別是至少5種不同的 HCV T細胞抗原構成的混合物。
11. 根據權利要求1至10的任意一項中所述的方法，其中所述的 HCV疫苗在每份給藥劑量中包含1至20mg、優選為3至10mg、特別是 4至6mg的HCV T細胞抗原。
12. 根據權利要求1至11的任意一項中所述的方法，其中所述的 HCV疫苗通過皮下或皮內進行給藥，特別是通過皮內進行給藥。
13. 根據權利要求1至12的任意一項中所述的方法，其中所述的 riU疫苗與免疫應答調節劑、優選與toll樣受體(TLR)拮抗劑、特別 是與toll樣受體(TLR)7拮抗劑、特別與TLR7和8拮抗劑或與TLR9 拮抗劑相結合進行給藥。
14. 根據權利要求1至13的任意一項中所述的方法，其中所述的 HCV疫苗與1- (2-曱基丙基)-lH-咪唑並[4， 5-c]喹啉-4-胺(咪喹莫特) 相結合進行給藥，優選地，作為局部施用的製劑，特別為骨狀物。
15. 根據權利要求14所述的方法，其中所述的HCV疫苗通過皮下 或皮內進行給藥，優選地通過皮內進行給藥，並且將咪喹莫特以骨狀 物的形式、優選為以含量為5重量％的骨狀物的形式直接施用在注射位 點上，優選地在進行了 HCV疫苗給藥之後的4至24小時之後、特別是 10至16小時之後。
16. 至少1種HCV T細胞抗原和含有肽鍵的聚陽離子化合物在制 備HCV疫苗中的用途，其中所述HCV疫苗通過至少4次的每2周給藥 來治療和預防HCV感染。
17. 用於治療和預防HCV感染的試劑盒，所述試劑盒含有如權利 要求1至15的任意一項中所定義的至少4個劑量的HCV疫苗以及用於 每2周給藥的給藥工具。
18. 根據權利要求17所述的試劑盒，其進一步包含如權利要求 13至15的任意一項中所定義的免疫應答調節劑。
19. 根據權利要求17或18所述的試劑盒，其中所述的用於每2 周給藥的給藥工具選自用於每2周給藥的給藥手冊、用於每2周給 藥的日曆、具有每2周的鬧鐘功能的電子提醒日曆、或它們的組合。
全文摘要
本發明涉及用於預防或治療C型肝炎病毒(HCV)感染的方法，其中每2周對人類個體進行HCV疫苗給藥，至少3次，所述HCV疫苗包含有效量的至少一種HCV T細胞抗原，以及含有肽鍵的聚陽離子化合物。
文檔編號A61P31/14GK101426514SQ200680054377
公開日2009年5月6日 申請日期2006年4月25日 優先權日2006年4月25日
發明者A·佛米卡, A·范格貝恩, C·克雷德, E·陶貝爾, K·靈瑙, K·科恩, M·津孜勒爾, W·扎內爾 申請人:英特塞爾股份公司