一種高效的農桿菌介導的鐵皮石斛遺傳轉化方法與流程
2023-07-09 10:04:31
本發明屬於植物轉基因技術領域，具體涉及一種高效的農桿菌介導的鐵皮石斛遺傳轉化方法。
背景技術：
鐵皮石斛作為一種集觀賞和藥用價值於一身的重要中藥材，主要分布於我國雲南、貴州、浙江、四川等地。其含有石斛多糖、石斛鹼、胺基酸等多種生物活性成分，味甘，性微寒，屬補益藥中的補陰藥；具有滋陰潤肺、生津益胃、清熱止咳等功效。但由於其對生長環境要求特殊，多生長於高溫多溼的熱帶、亞熱帶高山絕嶺、懸崖峭壁之間，生長緩慢、自身繁殖能力極低。在人們長期掠奪式採挖與生存條件的破壞下，野生資源瀕臨滅絕，藥材價格不斷攀升。而現階段有的雜交育種、選擇育種、誘變育種以及組織育苗、溫室或大棚進行後期培育的人工栽培方式由於其生產周期長、育種效率低、產量低、多糖含量不高等原因無法滿足市場的需求。並且鐵皮石斛資源品質不一、市場缺乏具優良性狀的植株，存在如病蟲害嚴重、難於控制開花以及花色花形不豐富等問題。利用轉基因技術不僅能上調植物有益成分表達水平，還能增強其抗逆性和抗病蟲能力，同時還能控制其生長發育進程，以利市場所需。
農桿菌介導法是利用農桿菌作為媒介進行基因轉化的一種方法，與其他轉基因方法相比，農桿菌轉化方法有著明顯的優勢：轉基因多是單拷貝或低拷貝數插入，並且優先插入轉錄活性區域；轉化效率高，簡單有效。並且隨著人們對農桿菌介導轉化法機理認識的深入，轉化方法也不斷得到改進。但是目前針對鐵皮石斛這一重要中藥材，一套農桿菌介導的系統完善且高效的轉基因方法還尚未建立。
技術實現要素：
針對現有技術中存在的上述問題，本發明提供一種高效的農桿菌介導的鐵皮石斛遺傳轉化方法，可有效解決現有技術中農桿菌介導的鐵皮石斛遺傳轉化系統不完善，轉化效率不高的問題。
為實現上述目的，本發明解決其技術問題所採用的技術方案是：
一種高效的農桿菌介導的鐵皮石斛遺傳轉化方法，包括以下步驟：
(1)農桿菌的活化培養
挑取農桿菌轉化子於液體培養基中，置於26-28℃，180-200r/min條件下活化，然後吸取培養液置於新的液體培養基中，置於26-28℃，180-200r/min條件下擴大培養，培養至od600＝0.7-0.9，離心，收集菌體；其中，液體培養基包括：1％酵母提取物、1％胰蛋白腖、0.5％氯化鈉、20mg/l利福平、50mg/l卡那黴素和50mg/l慶大黴素；
(2)浸染液的製備
將步驟(1)所得菌體加入ms液體培養基中，置於冰上使菌體完全溶於培養基中，再用ms液體培養基調節菌液至od600＝0.4-0.8，然後加入100μmol/l乙醯丁香酮(as)和0.001％-0.01％triton-100，搖勻；
(3)超聲處理與浸染
將鐵皮石斛種子誘導分化出原球莖，對原球莖進行擴大培養，然後挑選生長狀態良好，顏色呈嫩綠色，質地均勻且較為鬆散的原球莖置於280-320w，36-45khz條件下超聲處理1-3min，然後浸入浸染液中，於28℃，50r/min條件下浸染30min；其中，擴大培養基為ms+6-ba1.0mg/l+naa0.5mg/l+蔗糖30g/l+瓊脂4.8g/l+馬鈴薯20g/l+活性炭0.2g/l；原球莖大小為3-5mm方塊，可根據情況對原球莖進行切割使其滿足所需大小要求；
(4)共培養
浸染結束後，倒掉浸染液，用濾紙吸乾原球莖上多餘浸染液，然後迅速將原球莖轉移至共培養基上，進行暗培養；其中，共培養基為ms+蔗糖30g/l+瓊脂4.8g/l+馬鈴薯20g/l，滅菌後再加入100μmol/l乙醯丁香酮(as)；
(5)篩選
將共培養後的原球莖用無菌水衝洗4-5次，每次衝洗至無菌水為清澈透明狀態，再用濃度為480-520mg/l的頭孢溶液清洗1-2min，倒掉溶液，將原球莖用濾紙吸乾水分，迅速置於篩選培養基中培養，培養溫度為22-25℃，光照強度為1800-2000lx，光照時間為14h/天，將存活的原球莖接種至新配製的篩選培養基中培養至長出新的原球莖；其中，篩選培養基為ms+6-ba1.0mg/l+naa0.2mg/l+蔗糖30g/l+瓊脂4.8g/l+馬鈴薯20g/l，滅菌後添加頭孢500mg/l+潮黴素20mg/l；
(6)植株再生
將篩選得到的新原球莖接種於不含潮黴素的篩選培養基中培養，待分化出芽後轉入生根培養基中培養至獲得完整植株，然後進行pcr和染色檢測鑑定；其中，生根培養基為ms+iba1.0mg/l+蔗糖30g/l+瓊脂4.8g/l+馬鈴薯20g/l。
進一步地，農桿菌為gv3101。
進一步地，步驟(2)中用ms液體培養基調節菌液至od600＝0.6。
進一步地，步驟(2)中調節菌液濃度後加入100μmol/l乙醯丁香酮(as)和0.001％triton-100。
進一步地，步驟(3)中300w，40khz條件下超聲處理1min。
進一步地，步驟(4)中置於20℃暗培養4天。
本發明提供的一種高效的農桿菌介導的鐵皮石斛遺傳轉化方法，具有以下有益效果：
不同的農桿菌毒性不同，對於不同的植物而言，不同的農桿菌及其濃度對其感染力也不同，因此遺傳轉化中選擇適合的農桿菌十分重要。而且由於植物與農桿菌的最適生長溫度不同，共培養時就要選擇既不影響植物和菌體生長，又能提高農桿菌轉化效率的溫度及時間。對植物來說，表面活性劑是一類化合物，它們可以作為一種滲透劑，增強植物細胞質膜的敏感性，因而更有利於外源物質進入細胞內，因此植物遺傳轉化等研究中應用廣泛。對於超聲波，轉化材料經適當的超聲波處理，會因其空化效應、機械作用、熱效應等而產生許多微小的傷口，使得外源基因更容易進入受體細胞，從而使農桿菌遺傳轉化效率提高，並且使轉入的基因在受體內高效表達。
因此本發明對介導的農桿菌種類、浸染液濃度、表面活性劑種類和濃度、共培養時間、超聲時間進行了優化，再結合各階段的培養基來進行鐵皮石斛的遺傳轉化，該轉化系統完善，鐵皮石斛原球莖的存活率高，經過各步驟及參數的優化，轉化得到優良的抗性植株且轉化率高，陽性轉化率高達69.7％。
附圖說明
圖1為表面活性劑對原球莖存活率的影響結果圖。
圖2為不同的農桿菌對原球莖存活率的影響結果圖。
圖3為超聲處理時間和表面活性劑的結合對原球莖存活率的影響結果圖。
圖4為培養溫度和培養時間對原球莖存活率的影響結果圖。
圖5為採用本發明轉化方法得到的抗性原球莖和轉基因植株。
圖6為pcr檢測結果圖。
圖7為對抗性植株和野生植株的染色結果圖。
具體實施方式
實施例1
一種高效的農桿菌介導的鐵皮石斛遺傳轉化方法，包括以下步驟：
(1)農桿菌的活化培養
挑取-80℃農桿菌轉化子於5ml液體培養基中，置於28℃，200r/min，條件下活化，暗培養至適宜濃度時，吸取適量培養液置於新配製的液體培養基(三角瓶)中，置於28℃，200r/min條件下擴大培養，培養至od600＝0.8左右，倒入50ml離心管中，於4000r/min下離心10min，棄上清，收集菌體；其中，液體培養基包括：1％酵母提取物、1％胰蛋白腖、0.5％氯化鈉、20mg/l利福平、50mg/l卡那黴素和50mg/l慶大黴素；
(2)浸染液的製備
將步驟(1)所得菌體加入ms液體培養基中，置於冰上使菌體完全溶於培養基中，再用ms液體培養基調節菌液至od600＝0.4、0.6、0.8和1.0，然後加入100μmol/l乙醯丁香酮(as)和表面活性劑，搖勻。
實驗過程中選用silwet-77、tween20和triton-100作為表面活性劑，濃度為0.01％和0.001％，以不添加表面活性劑作為對照，表面活性劑對原球莖存活率的影響結果見圖1。
由圖1可知，當以silwet-77、tween20作為表面活性劑時，對原球莖存活率有一定的影響，當silwet-77、tween20濃度均為0.001％時，對原球莖存活率影響不大，當濃度為0.01％時，對原球莖有抑制作用，而當以triton-100作為表面活性劑時，會提高原球莖的存活率，進而提高轉化成功率，當濃度為0.001％時，促進作用最明顯(圖1中星號所示)。
當其他條件不變，僅更改農桿菌種類，所使用的農桿菌為gv3101、lba4404和eha105，觀察原球莖的存活率，其結果見圖2。
由圖2可知，採用不用的農桿菌介導，其原球莖的存活率不同，差異較大，用ms液體培養基調節菌液濃度時，對原球莖的存活率影響也很大，當od600＝0.6和od600＝0.8時，對lba4404和eha105介導的原球莖存活率影響不是很大，但對gv3101介導的原球莖存活率影響還是很大的，當採用gv3101介導，用ms液體培養基調節菌液od600＝0.6，原球莖存活率最高(圖2中星號所示)。
(3)超聲處理與浸染
將鐵皮石斛種子誘導分化出原球莖，對原球莖進行擴大培養，然後挑選生長狀態良好，顏色呈嫩綠色，質地均勻且較為鬆散的原球莖分別置於300w，40khz條件下超聲處理1min、3min，然後浸入浸染液中，於28℃，50r/min條件下浸染30min；其中擴大培養時所用擴大培養基為ms+6-ba1.0mg/l+naa0.5mg/l+蔗糖30g/l+瓊脂4.8g/l+馬鈴薯20g/l+活性炭0.2g/l。
本方案對超聲處理時間和表面活性劑的結合進行了優化實驗，其結果見圖3。
由圖3可知，當超聲處理1min對原球莖的生長有促進作用，而處理3min對原球莖的生長沒有明顯影響，將超聲處理後的原球莖浸入浸染液中，浸染液中的表面活性劑為0.001％triton-100時，原球莖存活率最高(圖中星號所示)。
(4)共培養
浸染結束後，倒掉浸染液，用濾紙吸乾原球莖上多餘浸染液，然後迅速將原球莖轉移至共培養基上，置於暗環境中培養；其中，共培養基為ms+蔗糖30g/l+瓊脂4.8g/l+馬鈴薯20g/l，滅菌後再加入100μmol/l乙醯丁香酮(as)。
本方案對共培養的溫度和時間進行了優化，培養條件分為3種：a、20℃培養3天、4天和5天；b、28℃培養36h、48h和60h；c、先在28℃培養，再轉入20℃培養，具體為：先在28℃培養36h，再轉入20℃培養3天；先在28℃培養48h，再轉入20℃培養2天；先在28℃培養60h，再轉入20℃培養1天。培養溫度和培養時間對原球莖存活率的影響結果見圖4。
由圖4可知，培養溫度和培養時間對原球莖的存活率均有影響，在20℃培養時，培養4天，原球莖的存活率達到最高；在28℃培養時，培養48h，原球莖的存活率達到最高；28℃轉20℃時培養時，先在28℃培養48h，再轉入20℃培養2天，原球莖的存活率達到最高。雖在28℃培養48h，再轉入20℃培養2天以及28℃培養2天均能獲得較高的存活率，但在後期培養過程中發現會出現農桿菌自身汙染的情況，輕度汙染會造成後期進行反覆清洗，增加工作量，汙染嚴重的會直接導致石斛死亡。因此，共培養條件選擇在20℃培養4天。
(5)篩選
將共培養後的原球莖用無菌水衝洗4-5次，每次衝洗至無菌水為清澈透明狀態，再用濃度為500mg/l的頭孢溶液清洗1-2min，倒掉溶液，將原球莖用濾紙吸乾水分，迅速置於篩選培養基中培養，培養溫度為22-25℃，光照強度為1800-2000lx，光照時間為14h/天，將存活的原球莖接種至新配製的篩選培養基中培養至長出新的原球莖；其中，篩選培養基為ms+6-ba1.0mg/l+naa0.2mg/l+蔗糖30g/l+瓊脂4.8g/l+馬鈴薯20g/l，滅菌後添加頭孢500mg/l+潮黴素20mg/l；其中，頭孢為普通頭孢，固體粉末，將其配製成一定濃度的儲存液，使用時再按比例進行稀釋，其作用為抑制農桿菌過度生長及其他雜菌的汙染。
(6)植株再生
將篩選得到的新原球莖接種於不含潮黴素的篩選培養基中培養，待分化出芽後轉入生根培養基中培養至獲得完整植株，然後進行pcr和染色檢測鑑定；其中，生根培養基為ms+iba1.0mg/l+蔗糖30g/l+瓊脂4.8g/l+馬鈴薯20g/l。
經過上述轉化方法得到的抗性原球莖和轉基因植株見圖5，其中左圖為抗性原球莖，右圖為轉基因植株。
pcr檢測結果見圖6，染色結果見圖7(上面為轉基因植株，下面為野生型植株)。從pcr結果看，陽性植株均出現588bp的條帶，證明外源基因成功插入鐵皮石斛基因組中。從染色結果來看，轉入gus基因的轉基因植株經染液染色後根和葉均有明顯的藍色，而未轉基因的野生型植株在同樣染液中染色後，並未出現藍色。由此證明本方案的轉化方法是成功有效的。
本發明對介導的農桿菌種類、浸染液濃度、表面活性劑種類和濃度、共培養時間、超聲時間進行了優化，再結合各階段的培養基來進行鐵皮石斛的遺傳轉化，該轉化系統完善，鐵皮石斛原球莖的存活率高，經過各步驟及參數的優化，轉化得到優良的抗性植株且轉化率高，陽性轉化率高達69.7％。
現有技術中所用培養基均是以1/2ms為基本培養基，而本方案採用的為ms為基本培養基。他們所用的激素為單獨使用6-ba、naa、或kt，本方案採用的為6-ba與naa配合使用，這樣更利於石斛原球莖的生長與分化。此外，一些的研究中在培養基中添加椰乳，雖然可以為石斛生長提供豐富的有機物，但是椰乳成本較高，要獲得椰乳操作也較為麻煩。而本方案添加的土豆不僅可為石斛生長提供豐富的有機物，促進其生長，而且土豆取材方便，成本更低，適用性也更加廣泛。
本方案選的89株裡有62株達到陽性，不僅獲得的轉基因植株多，選出來做檢測的數量也多，仍然得到更高的轉化率，說明本方案簡單高效且成本低。