一種姜花萜類花香基因Hctps1及其應用的製作方法

2023-07-09 11:09:06

專利名稱：一種姜花萜類花香基因Hctps1及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及基因工程技術領域，具體涉及一種姜花萜類花香基因及其應用。
背景技術：
花香在植物繁殖過程中發揮了重要的作用，不僅可以提高作物的產量和質量，還可以增加觀賞植物和切花的審美特性，而萜類化合物是組成花香的主要成分之一。萜類化合物是一類由數個異戊二烯(isoprene，C5)結構單位構成的化合物的統稱，根據其數目不同可分為單臨(monoterpene，C10)、倍半臨(sesquiterpene, C15)禾口二臨(diterpene， C20)等。萜類化合物種類繁多、結構多樣，迄今在植物中發現了 25 000多種，是植物次生代謝物中種類最多的一類。萜類不僅是組成花香的主要成分，還有其它眾多的生理生態作用。如，吸引授粉者；調節植物的生長和發育；調節植物耐熱性；抵禦光氧化脅迫；直接和間接的植物防禦。除此之外，萜類還廣泛應用於香料、化妝品、食物、藥物和殺蟲劑等行業，有非常大的商業價值。萜類合成酶(terpene synthase，TPQ是萜類合成的關鍵酶，按形成產物的不同， 可分為單萜合成酶、倍半萜合成酶和二萜合成酶等，它們分別以GPP或NPP、FPP和GGPP為直接前體底物合成相應的單萜、倍半萜、二萜。萜類合成酶蛋白一般是由550—850個胺基酸殘基組成，相對分子質量為50—100 kDa。單萜合成酶的胺基酸長度在600—650之間，比倍半萜合成酶(550 -580個胺基酸)要長，這是因為單萜合成酶多出了一段用於定位質體的N末端信號肽，信號肽可以引導單萜合成酶進入質體。這段信號肽含有大量的絲氨酸和蘇氨酸殘基和較少的酸性胺基酸殘基， 但沒有發現共同的結構元件。研究表明，萜類合成酶在三維結構上有很高的相似性，由α -螺旋、短的連接環和拐角等立體結構組成，並含有兩個明顯的結構區域，即C-末端結構區域和N-末端結構區域。酶的活性中心是C-末端的一個疏水區域，由6個α-螺旋組成，這個疏水區域利於底物疏水烴基部分進入和結合。N-末端沒有特殊的功能元件，突變分析顯示，這個區域起到方便C-末端催化活性區域正確摺疊的腳手架作用。幾乎所有的萜類合成酶都含有一個天冬氨酸富集基序(DDxxD)，這個基序被認為起到結合金屬離子的作用，它定位在活性位點的入口處，在引導底物催化時發揮重要的作用，若基序發生突變則會導致酶催化活性的下降或產生異常的產物。根據萜類合成酶胺基酸序列的相關性，將TPS家族分為七個亞家族，從 TPSa-TPSg,同一亞家族的不同成員之間有最小40%的同源性。萜類合成酶以異戊二烯焦磷酸(GPP，FPP和GGPP)為底物合成大量結構、功能多樣的萜類化合物，由於大多數萜類化合物為環狀，因此萜類合成酶也被稱為環化酶。萜類合成酶以金屬離子為輔因子，使異戊二烯焦磷酸發生親電反應，首先，底物通過焦磷酸基團斷裂或質子化的離子化過程，形成與酶結合的異戊二烯碳正離子中間體，由於酶活性位點的限制，碳正離子發生電子重排，然後經過一系列的異構化、環化或重排，最後經過去離子化或加水形成環狀或非環狀的萜類化合物。萜類合成酶是萜類化合物生物合成的關鍵酶，因此也成了萜類生物合成過程中研究最多和最深入的酶類，自1992年在菸草中克隆了兩個倍半萜合成酶基因以來，科學家已在40多種植物中克隆了 200多個單萜和倍半萜合成酶基因，涉及農作物、針葉類植物、藥用植物、香料植物和觀賞植物以及擬南芥等模式植物。Dudareva等在仙女扇中克隆了一個花器官特異表達並受植物發育調控的單萜合成酶基因一沉香醇合成酶基因，這是第一次克隆到特異表達的花香基因。在擬南芥基因組中也發現了三個在花中特異表達的萜類合成酶基因，並且這三個酶催化產生了擬南芥花中主要的揮發性物質。揮發性萜類物質經常在特定的時期或發育階段，從特定的植物組織中釋放出來， 用來吸引授粉昆蟲。在金魚草中，兩個主要的香氣成分(月桂烯和羅勒烯)在花的上唇瓣和下唇瓣部位釋放，並且受發育和晝夜節律的調控，這種晝夜節律可能與相應萜類合成酶基因在一天中的表達量不同有關。在菸草花瓣和柱頭中的許多萜類物質在夜間釋放，主要由於1，8-桉油醇合成酶基因在轉錄時受晝夜節律的調控。許多植物花的開放和花中萜類物質的釋放都遵循晝夜節律，萜類釋放的這種特異改變可能與授粉昆蟲的出現時間有關係。 例如，由夜間活動昆蟲授粉的花卉可能在傍晚時候香氣釋放量達到最大，使其與夜間活動昆蟲的最大傳粉時期相一致，這都是植物為適應外界環境而逐漸進化來的。近年來，植物萜類生物合成的基因操作已成為一個熱門的研究領域。Lucker等通過基因工程手段將三個不同的檸檬單萜合成酶轉入到萜類揮發量很少的菸草中，結果在轉基因菸草的葉和花中，單萜混合物((+)_檸檬烯、Y-萜品烯，菔烯)的含量得到了明顯的提高，組分得到了改變，並且人類的嗅覺可以感知到轉基因菸草釋放的單萜揮發性物質。

發明內容
目前，國內對萜類的研究主要集中在藥用、香料提取等方面，對萜類合成酶對花香形成的影響鮮見報導，直到本專利申請前沒有發現對姜花花香基因報導。克隆花香基因是對姜花花香形成機理研究的前提，揭示姜花花香和誘導防禦反應的分子機理可以增加花香和增強其抗性。這為採用基因工程的方法培育具濃鬱花香植物新品種提供了一條嶄新的途徑。本發明的目的是分離克隆白姜花中攜帶的一個控制萜類花香成分沉香醇的基因。本發明另一目的在於提供上述基因編碼的蛋白質。本發明另一目的在於提供含有上述基因的載體。本發明另一目的在於提供含有上述載體的轉基因植物。本發明還有一個目的在於提供上述基因在產生分子標記及其在選育對花香品種中的應用，以及上述基因編碼的蛋白質在製備香精和藥物中的應用。本發明上述目的通過以下技術方案予以實現
本發明涉及分離和應用一種包含論爾W基因的DNA片段(如SEQ ID Ν0:1所示)，該片段賦予姜花花朵沉香醇香味。本發明所示的DNA片段在有香味的姜花花組織表達，在無香味的姜花品種中不表達，並且其表達與花發育進程有關，同時在姜花葉片中受傷害誘導表達。該基因cDNA全長18^bp，基因編碼區共1737bp，推測其編碼578個胺基酸，蛋白分子量為64. 5 kDa。在這個基因序列中有DDX)(D和RRX8W兩個保守序列，並且基因的系統進化樹表明屬於植物萜類合成酶基因家族中的Tps-b亞族，DNA全長核苷酸序列長度為2^8bp， 包含6個內含子和7個外顯子，且剪切位置均符合「GT-AG法則」。其中，6個內含子分別位於第 222-305 位、第 578-667 位、第 1050-1136 位、第 1356-1425 位、第 1568-1637 位和第1884-2043位，大小分別為83bp、89bp、86bp、69bp、69bp和159b ；7個外顯子分別位於第 1-221 位、第 306-577 位、第 668-1049 位、第 1137-1355 位、第 1426-1567 位、第 1638-1883 位和第 2044-2298 位，大小分別為 221bp、272bp、382bp、219bp、142bp、246bp 和 255bp。通過原核表達並用反應底物GPP反應體外生成主產物為沉香醇(佔總揮發量的71. 3%)。本發明同樣包括將花香基因的主要結構部分有效地連接上合適的調節序列所形成的嵌合基因，以及在基因組中包含這種基因的植物和這種植物的種子。如這種基因可以是天然的或是嵌合的。例如，將包含該基因的片段和一個組成型表達的啟動子連接，該啟動子可以在任何條件下和細胞發育的任何時期表達。這種組成型表達的啟動子包括花椰菜花葉病毒35S的啟動子等。另一方面，也可以將該基因和一個組織特異性表達的啟動子或發育時期特異性表達的啟動子或精確環境誘導的啟動子連接，這些啟動子稱之為誘導型啟動子。這樣，環境的改變，發育時期的不同都可以改變該基因的表達，同樣，也可以將該基因的表達限定在某一個組織內，使由該基因誘導的抗性反應得到人為的控制。 其中環境條件包含病蟲害的攻擊、高低溫和光等，組織和發育時期包括葉、果實、種子和花等。根據本發明提供的基因序列信息，本領域技術人員可以通過以下方法容易地獲得與等同的基因(1)通過資料庫檢索獲得；(2)以基因片段為探針篩選姜花或其它植物的基因組文庫或cDNA文庫獲得；(3)根據基因序列信息設計寡核苷酸引物，用PCR擴增的方法從姜花或其它植物的基因組、mRNA和cDNA中獲取；(4)在 Hctpsl基因序列的基礎上用基因工程方法改造獲得；(5)用化學合成的方法獲得該基因。本發明提供的姜花花香基因具有重要的應用價值。應用之一是將所述的 Hctpsl基因序列連接到任何一種植物轉化載體，用任何一種轉化方法將花香基因導入姜花或其他植物細胞，可獲得表達所述基因的轉基因花香或抗性品種，從而應用於生產。本發明所述的基因構建到植物轉化載體中，可以對所述基因或其調控序列適當修飾，也可以在其轉錄起始密碼子前用其它啟動子取代所述基因原有的啟動子，從而拓寬和增強植物產生花香和增強抗性的能力。本發明提供的花香和抗性基因的另一個應用是根據所述基因序列信息產生特異性的分子標記，包括但不限於SNP (單核苷酸多態)、SSR (簡單序列重複多態)、RFLP (限制性內切酶長度多態)、CAP (切割擴增片段多態)。用這些標記可鑑定姜花或其它植物的花香基因型，用於分子標記輔助選擇育種，從而提高育種的選擇效率。與現有技術相比，本發明具有如下有益效果
本發明將克隆的花香基因轉入無花香的植物，有助於產生新的花香植物。特別是可以用轉化技術在植物中累加多個花香基因，而不會產生傳統育種技術中伴隨出現的基因組中不良基因的連鎖問題，並且可以縮短育種時間。花香基因的克隆是克服傳統育種中不能在植物種間轉移花香基因的問題的前提。另外，本發明能夠進一步提供或應用利用上述DNA 片段獲得的花香的轉基因植株和相應的種子，以及用本發明的基因或基於該基因的重組體轉化的植株或由這類植株獲得的種子。可以用有性雜交的方式將本發明的基因轉入其他的
5植株。


圖1為論組織表達特異性；
戰2為Hctpsl在花器官不同發育時期的表達； 圖？·為Hctpsl重組蛋白體外酶催化反應； 圖A^Hctpsl轉基因菸草植株的PCR檢測圖。
具體實施例方式以下結合實施例來進一步解釋本發明，但實施例並不對本發明做任何形式的限定。實施例1 Hctpsl基因cNDA和DNA全長的獲得
姜花材料姜花選用白姜花盛花期花瓣。稱取IOg左右樣品於研缽中，用液氮速凍研磨成粉末狀後轉入無菌的50 mL離心管中；立即添加20mL80°C預熱的硼酸緩衝液於42°C 下保溫並輕微振蕩提取池；加入1/3體積的2. 4 mol/L KCl溶液於4°C下冰浴Ih以上；以 20000rpm、4°C離心30 min ；取上清液，加入8mol/L LiCl溶液，使LiCl的終濃度變成2 mol/ L，在4°C下冰浴過夜沉澱RNA ； IOOOOrpm離心30 min後去除上清液；用2mol/L LiCl溶液洗滌沉澱1-3次；加入lOmmol/L Tris-HCl (pH7. 5)緩衝液溶解沉澱；加入2mol/L KOAc溶液混合後冰浴30min，以去除RNA中的多糖等雜質；10000 rpm離心15min後，將上清液轉移至乾淨離心管中；加入已有液體體積2. 5倍的無水乙醇，在一 80°C下沉澱池；10000 rpm離心30min，沉澱RNA ；棄上清液，用70%乙醇洗滌沉澱；離心並去除上層乙醇，真空乾燥；用滅菌超純水溶解RNA，於一 80°C冰箱中保存備用。以姜花盛開期的花瓣總RNA作為模板，用生工M-MuLV First cDNA Synthesis Kit 合成第一鏈cDNA。據GenBank核酸資料庫中報導的相關基因序列設計引物，上遊引物為如 SEQ ID N0:4所示，下遊引物為如SEQ ID NO: 5所示，並交由上海生物工程公司合成。以上述合成的cDNA為模板採用TaKaRa PCR Amplification Kit進行PCR擴增反應，具體方法按照說明書進行。PCR程序為94°C預變性^iin ；94°C變性45s、復性4 (溫度具體而定)、 72°C延伸lmin，30個循環；然後72°C延伸lOmin。在一 20°C下保存備用。PCR反應結束後， 用1. 0%瓊脂糖凝膠電泳初步檢測PCR產物中是否含有目的片段條帶。PCR擴增產物經1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測後，用手術刀在紫外燈下切出含有目的片段的膠塊，用DNA凝膠回收試劑盒(Agarose Gel DNA Purification Kit, TaKaRa)進行回收，回收方法基本參照試劑盒說明書。之後要對回收產物進行1%瓊脂糖電泳檢測，看其回收效果及大致濃度，以便保證後續試驗的進行。根據回收的目的片段大小及其有效濃度，取適量回收純化的產物與克隆載體連接，載體選用TaKaRa pMD18_T載體，目的DNA與克隆載體的摩爾比控制在3 :1左右，具體操作按說明書進行。在16°C下恆溫連接!3h-6h，連接時間的長短視目的片段的長度而定。提前將感受態細胞DH5 α (TaKaRa)從一 80°C冰箱取出，並置於冰盒中待其自然融化，將IOPL連接液全量加入感受態細胞的離心管中，冰浴30min後，42°C水浴熱激50s，迅速冰上放置2-5min，然後加入37°C預溫的SOC液體培養基890μ 補足到lmL，混勻後37°C下 ISOrpm振蕩培養lh。在含100 μ g/mL氨苄青黴素的LB固體培養基平板表面上塗30μ 的X-gal (20mg/mL)和3(^LIPTG (20mg/mL)，然後塗布適量轉化液，待轉化液完全被吸收後倒置於37°C恆溫箱中過夜培養，約IMi後觀察結果，通過X-gal/IPTG藍白斑篩選白色菌落， 並初步鑑定重組質粒，平板置於4°C保存。通過藍白斑初步篩選後，通常選6個菌斑搖菌後提取質粒，用於進一步鑑定。用滅菌的牙籤從LB平板培養基上挑取白色單菌落接種於含有 100 μ g/mL氨苄青黴素的LB液體培養基中，於控溫震蕩水浴搖床上37°C、240rpm振蕩過夜培養，用質粒DNA小抽試劑盒(上海博亞生物有限公司)提取質粒，步驟按說明書上方法進行。對所提質粒進行1. 0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，比較質粒大小並將明顯滯後的質粒進行雙酶切I /歷^i/III,TaKaRa)分析。在37 °C下酶切Ih後，對酶切產物進行1. 0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。隨意選送酶切鑑定後含目的片段的重組質粒進行DNA序列測定。測序工作交由上海英駿生物技術有限公司完成，採用美國ABI377序列分析儀。所得的序列在NCBI 進行比對和同源性分析。根據已得到的cDNA片段序列，利用生物軟體I^rimer Premier 5. 0在靠近片段序列的3'端設計兩個特異引物，3' -RACE 1st Primer如SEQ ID N0:6所示；3' -RACE 2nd I^rimer如SEQ ID NO: 7所示，經生物軟體Oligo 6. 0分析後交由上海生物工程公司合成。 以01igo(dT)-3'末端錨定引物為引物，反轉錄合成cDNA第一鏈。將合成的cDNA第一鏈作為模板，用3' —回引物與3'末端錨定引物進行3'末端PCR擴增。PCR程序為94°C預變性3min ；94°C變性30s、復性30s (溫度視具體而定)、72°C延伸Imin, 30個循環；然後72°C 總延伸lOmin。第一次PCR反應液稀釋10-100倍後作為模板，用3' 二回巢式引物進行第二次PCR反應。PCR反應結束後，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳初步檢測PCR產物中是否含有目的片段條帶。經過回收、檢測，隨機選送酶切鑑定後含目的片段的重組質粒進行DNA序列測定。測序工作交由上海英駿生物技術有限公司完成，採用美國ABI377序列分析儀。把測序結果與cDNA片段的序列進行拼接分析，判斷其是否是cDNA片段序列3'的延伸。同樣利用已知的cDNA片段序列，在靠近其5'末端的位置設計五個引物，包括一個特異的反轉錄引物如SEQ ID N0:8所示(需進行5'端磷酸化標記)和四個特異引物 5' -RACE 1st UP Primer 如 SEQ ID NO:9所示，5' -RACE 1st Dff Primer 如 SEQ ID NO: 10 所示，5' -RACE 2nd UP Primer 如 SEQ ID NO: 11 所示，5' -RACE 2nd Dff Primer 如 SEQ ID NO: 12 所示。5' -RACE所用試劑盒為大連寶生物工程有限公司出品的5' Full RACE Core Set Kit，以5'末端磷酸標記引物為引物，反轉錄合成cDNA第一鏈後進行環化反應，然後將環化的單鏈cDNA連接產物稀釋10倍後作為模板，以一回5'引物對，進行第一次PCR擴增。 PCR程序為:94°C預變性3 min ；94°C變性30s、復性30s、72°C延伸lmin，30個循環；然後 72°C總延伸IOmin0電泳檢測。經回收、檢測，隨機選送酶切鑑定後含目的片段的重組質粒進行DNA序列測定。測序工作交由上海英駿生物技術有限公司完成。把測序結果與cDNA片段的序列進行拼接分析，判斷其是否是cDNA片段序列5'的延伸。對所得到的片段序列、3 『和5 『序列進行Blast分析後，利用DNAstar軟體包的 SeqMan程序將三個片段進行比對拼接，拼接所得序列即為萜類合成酶基因cDNA全長序列。拼接所得的cDNA全長序列再在NCBI上對核苷酸序列及推導的蛋白質序列進行同源性比較和分析。
基因cDNA全長序列的獲得
根據已經得到的基因cDNA全長，設計併合成上下遊引物，Pl如SEQ ID N0:13所示，P2 如 SEQ ID NO: 14 所示，
以姜花cDNA為模板，採用TaKaRa PCR Amplification Kit進行PCR擴增反應。反應條件為94°C預變性^iin ；94°C變性30s、復性30s(溫度視具體而定)、72°C延伸3min，35個循環；然後72°C總延伸lOmin。取5PLPCR產物在含溴化乙錠0. 8%的瓊脂糖凝膠中進行電泳鑑定，紫外光下觀察實驗結果。應用Agarose Gel DNA Purification Kit Ver. 2. O(TaKaRa)，按照操作說明，將 PCR產物純化回收，回收產物溶解於25PLElution Buffer中。取純化回收產物4gL、pMD20_T Vector μ 、連接液Solution I 5μ ，組成10μ 的連接體系，16°C下連接過夜。轉化大腸桿菌菌株DH5ci感受態細胞，塗布於含有X-gal、IPTG、氨苄青黴素的LB固體培養基上，37°C 培養過夜；然後挑選白色克隆斑20個於含有氨苄青黴素的LB液體培養基中，37°C、240rpm 擴大培養16-24h ；用質粒DNA小抽試劑盒(上海博亞生物有限公司)提取質粒，瓊脂糖凝膠電泳比較質粒大小並將明顯滯後的質粒進行酶切鑑定。從鑑定出的陽性重組質粒中隨機挑選，送上海英駿生物技術有限公司進行序列測定。獲得Hctpsl基因的全長cDNA序列和全長DNA序列，根據cDNA序列推測出其蛋白序列。實施例2論爾W基因的表達分析
取總RNA液WL稀釋100倍後，在Eppendorf Biophotometer核酸蛋白測定儀上測定其濃度，計算取IOPgRNA所用的RNA溶液體積，用滅菌超純水補足到ΙΟμ ，加入ΙΟμ 含EB 的RNA電泳上樣緩衝液，於70°C變性lOmin，迅速於冰中冷卻，用含甲醛的1.洲瓊脂糖凝膠進行變性凝膠電泳(50V，60min)。電泳結束後，在凝膠成像系統下觀察條帶深淺情況是否一致，不一致的要在總RNA上樣量上做調整。調到總RNA條帶基本一致後，將膠塊放於2 X SSC 的溶液中，室溫脫色搖床上震蕩浸洗兩次，每次20min左右。採用上行毛細管轉移方法以 20 X SSC作為轉移緩衝液，將變性RNA從凝膠轉移到尼龍膜上(Biodyne B 0. 45 μ m, PALL)。 具體操作參照《分子克隆實驗指南(第三版)》(黃培堂等，2002)，過夜轉移16-20h後，取下尼龍膜置於乾淨的培養皿中，80°C烘烤池，紫外交聯後用保鮮膜包住，於4°C下保存備用。轉膜後的瓊脂糖凝膠要在紫外凝膠成像儀下觀察條帶是否轉完全，凝膠上幾乎看不到有RNA 的痕跡。在靠近姜花萜類合成酶基因cDNA 3'端設計合成探針引物，用經鹼處理的目的質粒DNA作為模板，先跑一個普通PCR反應以確認所設計的探針引物論-ipW-DIG-Up引物如 SEQ ID N0:15所示，i - /Λs7-DIG-Dw如SEQ ID N0:16所示，是否可行。經電泳檢測確認後，再用 PCR DIG Probe Synthesis Kit (Roche Applied Science, Mannheim, Germany) 製備帶有DIG標記的探針，取5PLPCR產物用1. 0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，判斷是否擴出預期帶DIG標記的探針DNA (探針DNA的位置應在目標片段位置的後面)。若探針製備成功，則可用於製備雜交液。將上述合成的探針全量轉入1. 5mL離心管中，沸水浴IOmin後，迅速冰浴冷卻，短暫離心收集到管底，全量吸入已裝有20mL預雜交液的50mL離心管中，混合均勻，於65°C保溫幾分鐘，-20°C下保存備用。探針與預雜交液的濃度基本是1/1000，預雜交液包含以下成分50 %去離子甲醯胺、5XSSC、7%SDSJ%阻斷劑、50mmol/L磷酸鈉緩衝液(pH 7. 0)和0. 1% N-Iauroylsarcosine sodium salt (w/v)。將紫外交聯後的結合有總RNA的尼龍膜放入雜交袋中，注AMripping Solution [5%SDS、50 mmol/L Tris-HCl (pH7. 5)和50%去離子甲醯胺]，趕盡氣泡後封口，於80°C的雜交箱中以最大轉速潤洗尼龍膜lh，重複此步驟1次。用適量的2 X SSC溶液漂洗去掉甲醯胺後，將尼龍膜放入新的雜交袋，加入65°C預熱的預雜交液，於45°C的雜交箱中進行預雜交3-3.證。預雜交完成後，將預雜交液換成雜交液於45°C的雜交箱中過夜雜交。次日，將尼龍膜置於37°C預熱的2 X SSC (含0. 1%SDS)溶液中，在脫色搖床上室溫漂洗2次，每次lOmin，洗去表面未結合的探針。隨後於62°C預熱的0. IXSSC(含0. 1%SDS) 溶液中，在63°C下洗膜兩次，每次30min，洗掉背景。經過抗原抗體結合後的膜用Tween-20 洗去未結合的抗體，然後用CDPItarTM通過化學發光原理檢測雜交信號的強弱。基因表達分析結果見圖1和圖2。實施例3 Hctpsl基因原核表達
根據所得到cDNA全長，去除信號肽片段，用包含5kl I和AbtI酶切位點的特異引物進行PCR擴增。PCR產物用Takara回收試劑盒回收，回收產物直接用^alI和AbtI限制性內切酶進行雙酶切，瓊脂糖凝膠回收目的片段。pET-28a原核表達載體用5kl I和AbtI限制酶進行雙酶切瓊脂糖凝膠回收大片段。於16°C連接過夜，將連接產物轉化大腸桿菌 (.E. coli)])ma感受態細胞；提取質粒經酶切和測序鑑定後，獲得重組原核表達載體。用經鑑定的重組質粒DNA轉化大腸桿菌(BL21)感受態細胞，挑取單菌落接種於 5ml LB (含25 mg /L Kan, 34 mg /L Chl)培養基中，37°C震蕩培養過夜。轉接100 μ 種子液於新鮮的100ml (含25 mg /L Kan, 34 mg /L Chl)的LB培養基中，37°C 180rpm培養 4h-6h，測 OD 值至 0. 4-0. 6 後用一定量的 IPTG (0. ImM-O. 2mM)在 UV _18°C誘導 14 16h。同時取另一對照組其中未加IPTG誘導。離心收集菌體，用5ml裂解buffer (50mM磷酸buffer pH 8.0)懸浮細胞，將菌體冷卻，置於冰上超聲波破碎細胞。12000rpm，4°C離心 lOmin，將上清移至新的離心管中，用雙蒸水清洗沉澱一次，再用5ml裂解buffer懸浮沉澱。 分別取上清和沉澱各50 μ ，保存與_20°C，進行SDS-PAGE電泳分析。配製12. 5%SDS聚丙烯醯胺凝膠，按照順序上樣。分別用60V和120V的電壓對濃縮膠和分離膠的進行電泳。電泳完畢，考馬斯亮藍染色30min，再用脫色液脫色廣8h，觀察並記錄試驗結果。蛋白的純化
挑取單菌落接種於5ml的液體LB培養基中，37°C，180rpm，培養過夜，後全部轉接至 500ml的新鮮液體LB培養集中，37°C，180rpm，培養4h，用IPTG(0. ImM-O. 2 mM)，18°C條件下誘導1 後，收集菌體。取200μ1菌體於離心管中，4°C保存，進行SDS-PAGE電泳分析。用 5ml的裂解buffer懸浮細胞並轉移至離心管內，置於冰上使菌體始終保持冷卻，超聲波破碎細胞。10，000 χ g，4°C離心20 - 30 min，收集上清液。取20 μ 的上清於_20°C保存，進行SDS-PAGE分析。向5ml細胞裂解液中加入廣2ml的Ni-NTA resin(鎳一次氮基三乙酸樹脂填料)混勻，並低速在4°C搖床上結合60min。將結合完全的細胞裂解液和樹脂混合物裝入層析柱中，移走底部蓋帽收集流出液部分(flow-through fraction, F)，取20μ1的流出液，於-20°C保存，進行SDS-PAGE分析。用細1的洗滌buffer洗脫層析柱兩次，收集每部分的洗脫液(wash fraction, W)，各取20 μ 保存於_20°C冰箱中作SDS-PAGE分析。用0.5ml的洗脫buffer洗柱四次，分別用不同的收集管依次收集每部分的洗脫液(elution fraction，E)，分別標記為 El, E2, E3, E4，各取 20ul 進行 SDS-PAGE 分析。根據 SDS-PAGE 的檢測結果，集中含有目標蛋白洗脫部分於一個離心管中，用移液器轉移至透析袋中，4°C透析過夜。收集透析後的溶液，加入甘油使蛋白溶液中甘油總含量為20%，並且以200 μ /管的量進行分裝，取微量進行SDS-PAGE蛋白濃度檢測，其餘的放於_70°C超低溫冰箱進行保存備用。萜類合成酶酶活性鑑定
轉接100 μ 種子液於新鮮的200ml (含25 mg /L Kan, 34 mg /L Chl)的LB培養基中，37°C 180rpm 培養 4h-6h，測 OD 值至 0. 4-0. 6 後用一定量的 IPTG (0. ImM-O. 2mM)在 14°C-18°C誘導 14 16h。5000rpm，4°C離心5min離心收集菌體，用 5ml buffer (IOmM MOPS buffer pH 7.0 10%甘油ImM DTT)懸浮細胞，置於冰上超聲波破碎細胞。12000rpm，4°C離心20min，將上清移至新的離心管中。酶促反應及GC-MS分析
將ΙΟΟμΙ lOXbuffer，酶提取液880μ1，2. 5 mM 6ΡΡ20μ1溶液加入樣品瓶中密封，將 75Mm聚二甲基氧烷(PMDQ萃取纖維頭插入玻璃瓶中，水浴30°C lh,45°C 15min，頂空固相微萃取，反應結束後將萃取纖維頭放至氣相色譜-質譜連用儀中進行分析，氣相色譜條件為色譜柱為HP-1NN0WAX柱(30mX0. 25mm)；載氣為高純氦氣，分流比20 1，柱前壓50 Pa， 流量1 mL /min ；取樣時間^iiin ；程序升溫柱起始溫度45 °C，保持2min，以5 V /min的速度升至80 °C保持lmin，然後以10°C /min的速度升至250°C保持5 min。質譜條件為 GC-MS的接口溫度220 °C，電子轟擊源EI、350V;離子源溫度170 °C;電子能量70 eV ；掃描質量範圍35-335aum，採集到的質譜圖用WILLEY/MAINLIB庫進行分析。原核表達結果見圖3。實施例4 Hctpsl對菸草的遺傳轉化
載體構建及農桿菌轉化將論爾W用Zhl I和I酶切，回收目的片段；載體 pMOGMON用損al I和feoR I酶切，純化回收相應大小的片段，連接，轉化DH5 α，提質粒，酶切鑑定，挑出所需克隆，測序，並將其轉化到農桿菌LBA4404中。菸草轉化將菸草「中煙-90」葉片(0.5 cmX0.5 cm的方塊)和矮牽牛葉片(1 cmXl cm的方塊)培養基中預培養2 3 d，農桿菌菌液濃度OD6tltl 0. 5 0. 8，浸染5 lOmin，然後共培養3 d，菸草在潮黴素Hyg 20 mg/L、頭孢黴素Cef 400 mg/L，矮牽牛在潮黴素Hyg 5 mg/L、頭孢黴素Cef 400 mg/L的培養基上，在光照2000 lOOOOLx，25 °C條件下進行選擇培養。選擇培養2 3周後，外植體的轉化細胞將產生抗性愈傷組織，將材料轉入相應的選擇分化培養基中進行分化出芽培養，待不定芽長至1 cm以上時，切下並插入含有選擇壓的生根培養基上進行生根培養，每瓶插入2 3棵小苗，進行生根誘導。將根長至約4 5 cm健壯小苗，煉苗5 6d，煉苗結束後，清水洗淨根部培養基，進行移栽。轉基因矮牽牛和菸草基因組DNA的提取
1)取0.2 g材料，加入液氮研磨成粉末，將磨好的材料轉入2 ml的離心管中，加入1 ml 預熱2 % CTAB提取液(含0. 的巰基乙醇)，充分混勻，置於65°C水浴45 min, 6 8min 混勻一次。10000 rpm，離心 5 min。2)冷至室溫，取上清液，加入等體積的氯仿/異戊醇(24 1 )，輕輕混勻至溶液成乳化狀，10000 rpm，離心 5 min。3)取上清，加入2/3體積預冷的異丙醇，-20°C放置30min。10000 rpm離心5 min, 棄上清液，用70%乙醇洗滌沉澱2 3次。加入200 μ 1 TE溶液溶解。4)加入1 /10體積NaAC (3 mo 1 /L)和2倍體積的無水乙醇，_20°C放置2h以上。 12000 rpm離心5min，棄上清液，沉澱用70%乙醇洗滌2 3次，室溫乾燥沉澱。用20 50 μ 1 IXTE 溶解，-20°C保存。轉基因矮牽牛和菸草PCR檢測
以轉化菌液為陽性對照，未轉化DNA作陰性對照，進行PCR擴增體系。上遊引物如SEQ ID NO: 17所示， 下遊引物如SEQ ID NO: 18所示。反應體系(20μ L)轉基因植株 DNA IyL (20ng 50ng) ； 10 Xbuffer 2 μ L ； MgCl2 (2. 5mM) 2 μ L ;Taq 酶 0. 2 μ L ； dNTP (2. 5mM) 2μ L ；引物各加 10 μ M ；加無菌水至 25 μ L0反應條件-MV，4分鐘；940C，30秒；54°C，30秒；72°C，1分鐘；30個循環；72°C延伸10分鐘。篩選出PCR陽性植株(圖4)。轉基因菸草與矮牽牛植株揮發性物質SPME-GC/MS分析
採用固相微萃取一氣相色譜質譜方法分析。將菸草與矮牽牛小苗從基質中取出，洗淨， 置於2. 5 L密封箱中，加入31. 6 ng/μ 1 (100 μ M SNP處理為316 ng/μ 1)的癸酸乙酯10 μ 1作為內標物，用聚四氟乙烯襯裡的矽橡膠墊密封，插入100 μ m聚二甲基矽氧烷(PMDS) 萃取纖維頭，於25°C溫下頂空取樣30 min。採用FINNIGAN TRACE MS氣質聯用儀(美國) 進行分析。色譜條件為DB-5石英毛細管柱長30 m，內徑0.25 mm,液膜厚0. 25 ym，載氣 He，柱頭壓力68. 974 kPa，程序分流/不分流(LSQ進樣口溫度250°C。程序升溫50°C，保持2 min ；以3°C /min的升溫速度升至250°C，保持30 min。在SPME分析中，PSS進樣口設定為不分流進樣方式，不分流時間為2 min，襯管採用1. 5 mm內徑的玻璃管，脫附時間為3 min ；在DHS進樣口分流比為20 :1，進樣量為2.0 μ L· GC/MS傳輸線溫度為250°C，質量掃描範圍是30 350 a μ m，掃描時間0.3 s，掃描間隔0.2 s，EI離子源溫度170°C，EI電子能量70 eV，光電倍增管(PMT)電壓230 V，對採集到的質譜圖用WILEY、MAINLIB、REPLIB及 NISTDEM0 4個庫進行分析，並根據各組分峰面積與內標癸酸乙酯峰面積之比定量，確定菸草和矮牽牛揮發性物質的化學成分。結果表明與揮發性香氣有關的物質檸檬烯，3，5-二氧甲基甲苯，長葉烯等含量相在測定的兩株轉基因植株都比野生型明顯的提高，檸檬烯轉基因菸草提高了 7. 19倍以上，3，5- 二氧甲基甲苯提高了 9倍以上，長葉烯提高了 4. 83倍以上(表1)。表1菸草論轉基因植株揮發性氣體成分的變化
權利要求
1.一種姜花萜類花香基因/fci/zs7，其特徵在於該基因CDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示；其DNA全長的核苷酸序列如SEQ ID NO: 2所示。
2.權利要求1所述姜花萜類花香基因編碼的蛋白質，其特徵在於其胺基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
3.一種載體，其特徵在於含有權利要求1所述姜花萜類花香基因Hctpsl。
4.一種轉基因植物，其特徵在於包括權利要求3所述載體。
5.權利要求1所述姜花萜類花香基因的應用，其特徵在於將姜花萜類花香基 ^Hctpsl連接到植物轉化載體中，然後導入姜花或其它植物細胞中，獲得表達所述姜花萜類花香基因的轉基因花香品種或抗性品種。
6.權利要求1所述姜花萜類花香基因的應用，其特徵在於根據該基因產生特異性的分子標記，用於鑑定姜花或其它植物的花香基因型。
全文摘要
本發明公開了一種姜花萜類花香基因Hctps1及其應用。本發明所述姜花萜類花香基因Hctps1的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示；該基因編碼的蛋白質的胺基酸序列如SEQIDNO:2所示。本發明所述姜花萜類花香基因Hctps1在有香味的姜花花組織表達，也在姜花葉片中受傷害誘導表達，在無香味的姜花品種中不表達，並且其表達與花發育進程有關。本發明所述姜花萜類花香基因Hctps1可以連接到任意一種植物轉化載體，然後導入姜花或其它植物細胞中，可獲得表達所述基因的轉基因花香或抗性品種，從而用於生產；也可以根據本發明所述基因序列信息產生特異性的分子標記，用於鑑定姜花或其它植物的花香基因型，用於分子標記輔助選擇育種，從而提高育種的選擇效率。
文檔編號C12N15/63GK102277362SQ201110223418
公開日2011年12月14日 申請日期2011年8月5日 優先權日2011年8月5日
發明者餘讓才, 蘭建彬, 盧保蘭, 徐婧, 範燕萍 申請人:華南農業大學