一種豬瘟活疫苗的生產方法
2023-08-08 22:20:46 2
專利名稱：一種豬瘟活疫苗的生產方法
技術領域：
本發明涉及豬瘟活疫苗的生產方法，屬於獸用生物製品技術領域。
背景技術：
豬瘟(ClassicalSwine Fever，CSF)是由豬癌病毒(Classical Swine Fever Virus,CSFV)引起的一種高度接觸性、致死性的豬傳染病，在世界上很多國家和地區均有發 生，給畜牧業生產帶來了嚴重的經濟損失。世界動物衛生組織(OIE)將豬瘟列為法定通報 性疫病，我國將其劃為一類動物傳染病。目前世界上主要有3種效果較好的豬瘟活疫苗，即日本的GPE株、法國的 Thiverval株和中國的兔化弱毒株(C株)，其中兔化弱毒株應用最為廣範並為世界上許多 國家豬瘟的控制和消滅做出了重要貢獻。目前，我國也實行強制免疫豬瘟弱毒活疫苗作為 控制豬瘟的主要手段。雖然三種疫苗均能有效用於豬瘟防制，但也都存在著一定不足。其中GPE株、 Thiverval株是用豬源傳代細胞系生產的，其存在已知或未知外源病毒汙染的風險較大，一 旦控制不好，很容易導致某種已有的或新發現的傳染病大面積流行。其中兔化弱毒活疫苗 目前有兩種生產工藝，第一種工藝是用兔體生產，取接種家兔的組織或淋巴結或脾臟制苗， 該工藝可以有效避免外源病毒汙染，同時保證了病毒的遺傳穩定性，病毒毒力不返強，但需 要使用大量家兔，質量控制難度較高且生產成本較高；第二種工藝是應用牛、羊原代細胞或 豬傳代細胞生產，該工藝避免大量使用實驗動物，但存在外源病毒汙染的風險(因為牛、羊 原代細胞或豬傳代細胞對很多已知或未知的外源病毒易感)並且病毒遺傳穩定性稍差，病 毒有獨立返強的風險。另外，豬瘟兔化弱毒是經過兔體連續傳代馴化而成的，種毒並未經過 克隆純化，因次不同批次的種毒對同一批家兔或同一批次的種毒對不同批次的家兔感染性 和免疫原性往往存在一定差異。由此可見，亟需一種新的豬瘟活疫苗生產工藝來克服已有 的幾種疫苗存在的不足。
發明內容
本發明的目的是克服豬瘟活疫苗現有生產工藝的不足之處，提供一種用克隆化豬 瘟兔化弱毒種毒接種兔源細胞或常用細胞進行細胞培養，收穫病毒液生產豬瘟活疫苗的方 法。該方法具有生產工藝簡單、易於質量控制、外源病毒汙染風險小、生產成本低等特點。 利用本發明生產的豬瘟活疫苗遺傳穩定性好、純淨性高、病毒效價高、免疫原性強。本發 明是用豬瘟兔化弱毒株病毒經過病毒基因拯救技術獲得的一株豬瘟兔化弱毒克隆株CSFV CC-2，該病毒株已於2010年7月26日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物 中心，保藏號為CGMCC No. 4059，將CSFV CC-2通過兔源細胞和/或常用細胞進行細胞培養， 收穫病毒液；將收穫的病毒液加入常用的凍幹保護劑，充分混合後分裝後經冷凍真空乾燥 而製成凍幹活疫苗，每頭份含毒量不低於6000TCID5(i或400RID。包括以下技術步驟1豬瘟兔化弱毒的克隆與鑑定
CGMCC No. 4059豬瘟兔化弱毒克隆株病毒是通過應用病毒基因拯救法將豬瘟兔化 弱毒進行克隆，獲得高度適應兔源細胞或常用細胞、基因型單一併且能穩定遺傳的純系豬 瘟兔化弱毒株病毒。1. 1豬瘟兔化弱毒的克隆用病毒基因拯救法進行。(1)病毒RNA提取RNA提取試劑盒提取豬瘟兔化弱毒細胞培養液的總RNA ；(2)全基因組cDNA克隆①設計幾對引物分別進行RT-PCR擴增，分別進行純化、回收，電泳檢測擴增產物；②將PCR產物分別克隆到載體上，轉化感受態細胞；③挑取轉化成功的菌落，大量培養，提取重組質粒，雙向測序鑑定；④將重組質粒，酶切，純化；⑤將純化產物連接，得到全基因組cDNA ；⑥將全基因組cDNA克隆到載體上，轉化感受態細胞；⑦篩選重組載體，擴大培養，提取重組質粒，酶切，純化，得到大量全基因組cDNA ；(3)體外 RNA 轉錄；(4)體外RNA脂質體轉染細胞；(5)培養傳代，螢光抗體檢測呈陽性，則克隆成功，命名為CSFV CC_2(該病毒株 已於2010年7月28日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為 CGMCCNo. 4059)；1. 2克隆株的鑑定經鑑定，克隆株CSFV CC-2具有以下特性(1)對細胞的適應性將CSFV CC-2接種兔源細胞進行細胞培養並取樣測 定毒價，經轉瓶培養最高毒價彡106 0TCID50/0. 1ml，經微載體或懸浮培養最高毒價 ^ IO6 8TCID5tlA). Irnl ；將CSFV CC-I接種常用細胞進行細胞培養並取樣測定毒價，經轉瓶培 養最高毒價彡105 0TCID50/0. 1ml，經微載體或懸浮培養最高毒價彡106 °TCID50/0. Iml ；(2)遺傳穩定性將CSFV CC-2經兔源細胞連續傳代並進行基因序列測定，第30代 與第1代克隆化種毒核苷酸同源性為99. 9%，胺基酸同源性為100%;將CSFV CC-2經常用 細胞連續傳代並進行基因序列測定，第30代與第1代克隆化種毒核苷酸同源性為99. 5%, 胺基酸同源性為99.9% ；(3)生物學特性將CSFV CC-2進行豬瘟抗體抑制試驗，豬瘟抗體能特異性抑制該 種毒的螢光產生；將CSFV CC-2以15TCID5(I (或1RID) /只的劑量靜脈接種健康家兔，結果 95%產生定型熱或輕型熱；(4)免疫原性將CSFV CC-2以150RID/只的免疫劑量肌肉接種非免疫健康豬， 抗體平均最高滴度達到1 128，平均持續時間為400d;免疫後2周攻Iml豬瘟石門血毒 (IO5MLD/Iml)，100%保護，最高體溫彡41%且持續不超過3d ；(5)安全性將 CSFV CC-2(彡 105 °TCID50/0. lml) IOml 注射家兔、IOOml 注射豬、 5ml注射豚鼠、Iml注射小鼠均不引起死亡；2疫苗的製備2. 1種毒的繁殖
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將CSFV CC-2種子批種毒接種生長良好的兔源細胞或常用細胞的種子批細胞，培 養3 4天後收毒，作為生產用種毒；種毒檢驗按《中華人民共和國獸藥典》(中國獸藥典委員會.中華人民共和國獸 藥典二〇〇五年版三部.中國農業出版社，2006，本發明文件中簡稱為《中國獸藥典》)進行 檢驗，應符合無菌檢驗和外源病毒檢驗標準規定；2. 2生產用細胞的傳代與培養種子批細胞經消化、分散後，進行細胞培養，形成單層或生長至合適密度時，用於 繼續傳代或接種病毒；細胞檢驗按《中國獸藥典》規定進行檢驗，應符合生產、檢驗用細胞標準規定；2. 3生產用病毒液的繁殖將生產種毒接種生長良好的生產用細胞，進行細胞培養，3 4天後收穫病毒 液，-15°C以下保存；生產用病毒液檢驗按《中國獸藥典》規定進行檢驗，應符合無菌檢驗和外源病毒 檢驗標準規定；並且每ml含毒量不少於60000 (或4000RID)；2. 4配苗、分裝和凍幹將檢驗合格的病毒液，加入適當穩定劑和抗菌素，混勻，定量分裝，每頭份含毒量 不低於6000TCID5(1 (或400RID)，冷凍真空乾燥即成；成品檢驗按《中國獸藥典》規定進行檢驗，應符合無菌檢驗和外源病毒檢驗標準 規定；用10頭份注射敏感子豬，應不引起明顯症狀；每頭份含毒量不少於6000TCID5(I(或 400RID)。本發明涉及的一些專用詞的界定1.兔源細胞是指兔原代細胞或傳代細胞；2.常用細胞是指牛睪丸原代細胞、羊睪丸原代細胞、羊腎原代細胞、牛BT細胞 系、豬SK-6細胞系、豬ST細胞系、豬PK-15細胞系、豬IBRS-2細胞系；3.細胞培養是指細胞在適宜的溫度和密度下，經轉瓶培養或細胞微載體培養或 細胞懸浮培養。本發明的積極意義本發明通過將豬瘟兔化弱毒克隆，獲得高度適應細胞並且能穩定遺傳的純系種 毒，再接種細胞進行細胞培養，生產病毒液，最後配苗、分裝、凍於。與現有技術相比，本發明 具有以下優點(1)相對於已有技術，本發明克隆、純化了種毒，保證了種毒的遺傳和生物表現型 的單一性，提高了疫苗的遺傳穩定性和生物安全性；(2)相對於已有技術，本發明克隆、純化了種毒，生產的病毒液毒價更高，單位體積 內的疫苗有效成分含量更高；(3)相對於已有技術，本發明克隆、純化了種毒，疫苗免疫原性更穩定、可靠；(4)相對於已有的兔體制苗技術，本發明避免了飼養動物、觀測動物等長時間、高 強度勞動，降低了生產成本，同時降低了細菌、黴菌和支原體汙染的風險。
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圖1豬瘟病毒兔化弱毒株(細胞源)7個cDNA片段。圖2圖中箭頭所示豬瘟病毒兔化弱毒株(細胞源)克降後在RK-13細胞上的螢光 染色斑。
具體實施例本發明的實施例為進一步描述本發明的技術方案，但不構成對本發明的限制。實施例1豬瘟兔化弱毒的克隆與鑑定1.豬瘟兔化弱毒的克隆用病毒基因拯救法進行。(1)病毒RNA提取用TRIzol Reagent試劑盒(購自Invitrogen公司)提取豬 瘟兔化弱毒細胞培養液的總RNA ；(2)全基因組cDNA克隆1)設計7對引物(序列1 14，表1)分別進行RT-PCR擴增，其擴增產物分別進 行純化、回收，瓊脂糖電泳檢測擴增產物(圖1)，結果出現目標條帶，表明擴增成功；表1用於擴增豬瘟病毒兔化弱毒株(細胞源)全基因組的引物序列 2)將純化回收的目的基因片段分別克隆至pGEM-T Easy載體(購自Promega公 司)，轉化感受態大腸桿菌JM109 (購自Promega公司)；3)轉化後的大腸桿菌塗布於含有X-Gal和IPTG的AMP+ LB瓊脂平板，37°C培養 12 16h ；隨機挑取3-4個自色單菌落，接種於AMP+ LB液體培養基，37 °C振蕩培養12 16h ；用 Wizard Plus Minipreps DNA Purification System 試劑盒(購自 Promega 公司) 提取重組質粒，送至北京華大中生科技發展有限公司雙向測序鑑定，結果與設計的目的基 因片段序列一致。4)大量培養轉化的大腸桿菌，用試劑盒大量提取重組質粒，分別用核酸內切酶
6(購自NEB公司)酶切，純化；5)將純化產物依次用T4DNA連接酶(購自NEB公司)連接，得到全基因組cDNA ；6)將全基因組cDNA克隆到pGEM_T Easy載體上，轉化感受態大腸桿菌JM109 ；7)轉化後的大腸桿菌塗布於含有X-Gal和IPTG的AMP+ LB瓊脂平板，37°C培養 12 16h ；隨機挑取3-4個白色單菌落，接種於AMP+ LB液體培養基，37°C振蕩培養12 16h;用試劑盒提取重組質粒，送公司雙向測序鑑定，結果與目標序列一致。8)將轉化後的大腸桿菌擴大培養，大量提取重組質粒，用核酸內切酶酶切，純化， 得到大量全基因組cDNA;(3)體外 RNA 轉錄ATP 溶液 2 μ 1、CTP 溶液 2 μ 1、GTP 溶液 2 μ 1、UTP 溶液 2 μ 1、 IOXReaction Buffer 2 μ 1、線性化模板DNA 3 μ g、酶混合液2 μ 1，加無Rnase水補充至 20 μ 1 ；在 PCR 儀中，39°C反應 2h ；(4)體外RNA脂質體轉染細胞將6孔細胞板長滿80%左右的RK-13細胞；用 Opti-MEM培養基(購自GIBCO公司)小心稀釋轉錄RNA ；將10 μ 1 LipofectamineTM 2000 (購自GIBCO公司)加入到240 μ 1 Opti-MEM培養基中，輕柔混合，室溫下孵育5min ；再 與稀釋的RNA輕柔混均，室溫下孵育20min ；將轉染混合液加入到漂洗過的6孔細胞板中， 輕柔搖動培養板，使混合液完全覆蓋細胞表面，放入37°C的5% CO2培養箱中作用6h ；細胞 單層用MEM(無雙抗、無血清)培養液漂洗三遍，加入MEM培養液(無雙抗)，置於37°C 的5% CO2培養箱中培養72h ；(5)培養傳代按常規方法將轉染後的病毒液盲傳2 3代，用豬瘟螢光抗體檢 測，結果呈陽性(圖2)，則表明克隆成功，命名為CSFV CC-2；2.克隆株的鑑定經鑑定，克隆株CSFV CC-2具有以下特性(1)對細胞的適應性將CSFV CC-2接種RK-13細胞進行細胞培養並取樣測定毒 價，經懸浮培養最高毒價彡106-8TCID50/0. Iml ；(2)遺傳穩定性將CSFV CC-2經RK-13細胞連續傳代並進行基因序列測定，第30 代與第1代克隆化種毒核苷酸同源性為99. 9%，胺基酸同源性為100% ；(3)生物學特性將CSFV CC-2進行豬瘟抗體抑制試驗，豬瘟抗體能特異性抑制該 種毒的螢光產生；將CSFV CC-2以15TCID5(I (或1RID) /只的劑量靜脈接種健康家兔，結果 95%產生定型熱或輕型熱；(4)免疫原性將CSFV CC-2以150RID/只的免疫劑量肌肉接種非免疫健康豬， 抗體平均最高滴度達到1 128，平均持續時間為400d;免疫後2周攻Iml豬瘟石門血毒 (IO5MLD/Iml)，100%保護，最高體溫彡41%且持續不超過3d ；(5)安全性將 CSFV CC-2(彡 105 °TCID50/0. lml) IOml 注射家兔、IOOml 注射豬、 5ml注射豚鼠、Iml注射小鼠均不引起死亡；實施例2疫苗的製備1.種毒的繁殖將CSFV CC-2種子批種毒接種生長良好的RK-13種子批細胞，培養3 4天後收 毒，作為生產用種毒；種毒檢驗按《中國獸藥典》規定進行檢驗，結果符合無菌檢驗和外源病毒檢驗標準規定；2.生產用細胞的傳代與培養種子批細胞RK-13經消化、分散後，進行細胞懸浮培養，生長至合適密度時，用於 繼續傳代或接種病毒；細胞檢驗按《中國獸藥典》規定進行檢驗，結果符合生產、檢驗用細胞標準規定；3.生產用病毒液的繁殖將生產種毒接種生長良好的生產用細胞，進行細胞懸浮培養，3 4天後收穫病毒 液，-15°C以下保存；生產用病毒液檢驗按《中國獸藥典》規定進行檢驗，結果符合無菌檢驗和外源病 毒檢驗標準規定；並且每ml含毒量> 60000TCID5(1 (或4000RID)；4.配苗、分裝和凍幹將檢驗合格的病毒液，加入適當穩定劑和抗菌素，混勻，定量分裝，每頭份含毒量 不低於6000TCID5(1 (或400RID)，冷凍真空乾燥即成；成品檢驗按《中國獸藥典》規定進行檢驗，結果符合無菌檢驗和外源病毒檢驗標 準規定；用10頭份注射敏感子豬，結果不引起明顯症狀；每頭份含毒量> 6000TCID5(I(或 400RID)。實施例3疫苗的製備1.種毒的繁殖將CSFV CC-2種子批種毒接種生長良好的SK-6種子批細胞，培養3 4天後收毒， 作為生產用種毒；種毒檢驗按《中國獸藥典》規定進行檢驗，結果符合無菌檢驗和外源病毒檢驗標 準規定；2.生產用細胞的傳代與培養種子批細胞SK-6經消化、分散後，進行細胞懸浮培養，生長至合適密度時，用於繼 續傳代或接種病毒；細胞檢驗按《中國獸藥典》規定進行檢驗，結果符合生產、檢驗用細胞標準規定；3.生產用病毒液的繁殖將生產種毒接種生長良好的生產用細胞，進行細胞懸浮培養，3 4天後收穫病毒 液，-15°C以下保存；生產用病毒液檢驗按《中國獸藥典》規定進行檢驗，結果符合無菌檢驗和外源病 毒檢驗標準規定；並且每ml含毒量> 60000TCID5(1 (或4000RID)；4.配苗、分裝和凍幹將檢驗合格的病毒液，加入適當穩定劑和抗菌素，混勻，定量分裝，每頭份含毒量 不低於6000TCID5(1 (或400RID)，冷凍真空乾燥即成；成品檢驗按《中國獸藥典》規定進行檢驗，結果符合無菌檢驗和外源病毒檢驗標 準規定；用10頭份注射敏感子豬，結果不引起明顯症狀；每頭份含毒量> 6000TCID5(I(或 400RID)。
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權利要求
一種豬瘟活疫苗的生產方法，其特徵是用豬瘟兔化弱毒株病毒經過病毒基因拯救技術獲得的一株豬瘟兔化弱毒克隆株CSFV CC 2，該病毒株已於2010年7月26日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No.4059，將CSFV CC 2通過兔源細胞和/或常用細胞進行細胞培養，收穫病毒液；將收穫的病毒液加入常用的凍幹保護劑，充分混合後分裝後經冷凍真空乾燥而製成凍幹活疫苗，每頭份含毒量不低於6000TCID50或400RID。
2.按照權利要求1所述的一種豬瘟活疫苗的生產方法，其特徵是製備豬瘟活疫苗所用 一株CGMCC No. 4059豬瘟兔化弱毒克隆株病毒是通過應用病毒基因拯救法將豬瘟兔化弱毒 進行克隆，獲得高度適應兔源細胞或常用細胞、基因型單一併且能穩定遺傳的純系豬瘟兔 化弱毒株病毒。全文摘要
本發明涉及一種豬瘟活疫苗的生產方法。本發明包括以下技術步驟(1)豬瘟兔化弱毒株的克隆與鑑定；(2)克隆株種毒的繁殖；(3)生產用細胞的繁殖；(4)生產用病毒液的繁殖；(5)配苗、分裝和凍幹。本發明具有生產工藝簡單、穩定，病毒免疫原性和遺傳穩定性好，外源病毒汙染風險小，檢驗方便，生產成本低等特點，利用本發明生產的豬瘟活疫苗遺傳穩定性好、純淨性高、免疫原性強。
文檔編號C12N7/04GK101905020SQ20101024511
公開日2010年12月8日 申請日期2010年8月5日 優先權日2010年8月5日
發明者關孚時, 戴志紅, 李翠, 王在時, 秦玉明, 蔣卉, 趙耘 申請人:中國獸醫藥品監察所