一種層析活化偶聯介質及其製備方法與流程

2023-08-09 16:26:58

1.本發明涉及生物醫藥領域，特別是指一種層析活化偶聯介質及其製備方法。


背景技術：

2.目前生物醫藥的應用擴大了疑難病症的研究領域，使原先威脅人類生命健康的重大疾病得以有效控制。在生物製藥過程中，如何提高藥物的純度和生物安全性，是重組蛋白、抗體等生物藥研發和生產過程中的關鍵性步驟。
3.目前市面上使用的親和層析活化偶聯介質主要是瓊脂糖產品，這類層析介質的機械強度較低，在工業生產中裝填層析柱時因為耐受壓力的低下而限制了其分離效果的提升，同時也限制了該類層析介質的使用壽命。


技術實現要素：

4.本發明要解決的技術問題是提供一種層析活化偶聯介質及其製備方法，以解決現有技術中的層析活化偶聯介質機械強度低的問題。
5.為解決上述技術問題，本發明的技術方案如下：
6.一種層析活化偶聯介質，以聚丙烯酸酯微球為基球，且具有如式(ⅰ)所示的結構：
[0007][0008]
優選地，所述聚丙烯酸酯微球的粒徑為50-90微米。
[0009]
本發明還提供一種層析活化偶聯介質的製備方法，包括如下步驟：
[0010]
(1)取聚丙烯酸酯微球，加入烯丙基縮水甘油醚，反應得到烯丙基化微球；
[0011]
(2)向步驟(1)中得到的所述烯丙基化微球中，加入溴，反應得到溴化微球；
[0012]
(3)向步驟(2)中得到的所述溴化微球中，加入6-氨基己酸，反應得到羧基化微球；
[0013]
(4)向步驟(3)中得到的所述羧基化微球中，加入n-羥基琥珀醯亞胺，反應得到層析活化偶聯介質。
[0014]
優選地，步驟(1)具體包括：取聚丙烯酸酯微球、硫酸鈉、氫氧化鈉、硼氫化鈉，在溫度40-50℃、攪拌速度110-150rpm下，反應1-2h，得到第一反應物；再向其中加入烯丙基縮水甘油醚，在溫度40-50℃、攪拌速度110-150rpm下，反應16-20h，得到烯丙基化微球。
[0015]
優選地，步驟(1)中，所述聚丙烯酸酯微球、硫酸鈉、氫氧化鈉、硼氫化鈉、烯丙基縮水甘油醚的重量比為1000:165:50:7:(100-300)；
[0016]
任選地，步驟(1)中的反應以水作為反應溶劑。
[0017]
優選地，步驟(2)具體包括：向步驟(1)中得到的所述烯丙基化微球中，加入乙酸鈉，混合均勻；再向其中加入溴，在溫度20-35℃、攪拌速度110-150rpm下，反應1-2h；然後，向其中加入甲酸鈉，反應得到溴化微球。
[0018]
優選地，步驟(2)中，所述烯丙基化微球、乙酸鈉的重量比為1000:(2-8)；
[0019]
任選地，所述烯丙基化微球與所述溴的重量比為1000：(5-10)；所述烯丙基化微球與所述甲酸鈉的重量比為1000：(10-20)；
[0020]
任選地，步驟(2)中的反應以水作為反應溶劑。
[0021]
優選地，步驟(3)具體包括：向步驟(2)中得到的所述溴化微球中，加入6-氨基己酸的水溶液，在溫度40-50℃、攪拌速度110-150rpm下，反應16-20h，得到羧基化微球；
[0022]
任選地，所述6-氨基己酸的水溶液採用naoh調節ph值至12；
[0023]
任選地，所述溴化微球與6-氨基己酸的重量比為1000:(80-110)。
[0024]
優選地，步驟(4)具體包括：向步驟(3)中得到的所述羧基化微球中，加入n-羥基琥珀醯亞胺、二環己基碳二亞胺，在溫度20-35℃、攪拌速度110-150rpm下，反應16-20h，得到層析活化偶聯介質。
[0025]
優選地，步驟(4)中，所述羧基化微球、n-羥基琥珀醯亞胺、二環己基碳二亞胺的重量比為1000:(20-35):(45-60)；
[0026]
任選地，步驟(4)中的反應以二氯甲烷作為反應溶劑。
[0027]
本發明的上述方案至少包括以下有益效果：
[0028]
本發明的層析活化偶聯介質，以聚丙烯酸酯微球為基球，且在所述基球上鍵合有如式(ⅰ)所示的化合物。所述的層析活化偶聯介質，以聚丙烯酸酯微球為基球，由於聚丙烯酸酯微球具有較高的機械強度，因此，在裝填層析柱時能承受更高的壓力，可以耐受1mpa的壓力，經高壓後仍能保持良好的分離效果，具有更長的使用壽命。
[0029]
更為重要的是，由於所述基球上鍵合的化合物具有n-羥基琥珀醯亞胺，因此可以共價結合含伯胺基團的生物配基，進而可應用於免疫親和層析介質。
[0030]
另外，由於特定短肽等小分子配基上也帶有伯胺基團，因此，所述層析活化偶聯介質還可以偶聯特定短肽等小分子配基。同時，由於末端具有n-羥基琥珀醯亞胺基團的活化介質與親和配基上的氨基親和性很高，因此反應速度快、效率高，使得親和配基上的氨基與活化介質之間形成穩定的醯胺鍵，得到的親和層析介質在儲存和層析過程中很少發生親和配基洩露的問題。由於6-氨基己酸一端是氨基，可以與溴化微球反應，另一端是羧基，可以與n-羥基琥珀醯亞胺發生偶聯反應。通過採用6-氨基己酸進行n-羥基琥珀醯亞胺的偶聯反應，可以使反應後得到的層析活化偶聯介質，與親和配基的結合性能大大提高。
附圖說明
[0031]
圖1是本發明效果實驗例2中的nhs濃度測定的標準曲線；
[0032]
圖2是本發明效果實驗例3中測定的蛋白濃度濃度的標準曲線。
具體實施方式
[0033]
本發明各實施例中未註明具體條件者，按照常規條件或製造商建議的條件進行。
所用試劑或儀器未註明生產廠商者，均為可以通過市購獲得的常規產品，不同廠家、型號的原料並不影響本發明技術方案的實施及技術效果的實現。
[0034]
實施例1
[0035]
本實施例中的層析活化偶聯介質，以聚丙烯酸酯微球為基球，且具有如式(ⅰ)所示的結構：
[0036][0037]
所述聚丙烯酸酯微球的粒徑為70微米。
[0038]
本實施例所述的層析活化偶聯介質的製備方法，包括如下步驟：
[0039]
(1)取聚丙烯酸酯微球，加入烯丙基縮水甘油醚，反應得到烯丙基化微球；
[0040]
(2)向步驟(1)中得到的所述烯丙基化微球中，加入溴，反應得到溴化微球；
[0041]
(3)向步驟(2)中得到的所述溴化微球中，加入6-氨基己酸，反應得到羧基化微球；
[0042]
(4)向步驟(3)中得到的所述羧基化微球中，加入n-羥基琥珀醯亞胺，反應得到層析活化偶聯介質。
[0043]
所述的層析活化偶聯介質的製備方法，具體包括如下步驟：
[0044]
(1)取聚丙烯酸酯微球，用2倍體積的去離子水清洗，並浸泡3min，抽乾，重複4次，得到清洗後的聚丙烯酸酯微球；
[0045]
取清洗後的所述聚丙烯酸酯微球、硫酸鈉、氫氧化鈉、硼氫化鈉，以水作為反應溶劑，將所述氫氧化鈉溶於水中，並與所述聚丙烯酸酯微球、硫酸鈉、硼氫化鈉，混合均勻，在溫度50℃、攪拌速度130rpm下，反應1h，得到第一反應物；
[0046]
再向所述第一反應物中加入烯丙基縮水甘油醚、水，在溫度50℃、攪拌速度130rpm下，反應16h，得到烯丙基化微球。
[0047]
其中，所述聚丙烯酸酯微球、硫酸鈉、氫氧化鈉、硼氫化鈉、烯丙基縮水甘油醚的重量比為1000:165:50:7:200。製備所述第一反應物時，水與所述氫氧化鈉的重量比為1:1。製備烯丙基化微球時，水與所述烯丙基縮水甘油醚的重量比為3:2。
[0048]
作為本實施例的優選實現方式，還包括對所述烯丙基化微球進行後處理的步驟：將得到的含有所述烯丙基化微球的反應混合物抽濾，過濾物依次用5倍體積的去離子水、5倍體積的95v/v％乙醇、2倍體積的去離子水、2倍體積的0.2mol/l的乙酸、5倍體積的去離子水洗滌，抽乾，得到烯丙基化微球。
[0049]
(2)向步驟(1)中得到的所述烯丙基化微球中，加入乙酸鈉、水，混合均勻；再向其中加入溴，在溫度20℃、攪拌速度130rpm下，反應2h；然後，向其中加入甲酸鈉，反應得到溴化微球。
[0050]
其中，所述烯丙基化微球、乙酸鈉的重量比為1000:5；所述烯丙基化微球與所述溴
的重量比為1000：10；所述烯丙基化微球與所述甲酸鈉的重量比為1000：15。
[0051]
作為本實施例的優選實現方式，還包括對溴化微球進行後處理的步驟：將得到的含有溴化微球的反應混合物抽濾，過濾物用去離子水洗滌，抽乾，得到溴化微球。
[0052]
(3)向步驟(2)中得到的所述溴化微球中，加入6-氨基己酸的水溶液，在溫度40℃、攪拌速度130rpm下，反應20h，得到羧基化微球；
[0053]
其中，所述6-氨基己酸的水溶液為6-氨基己酸與水按照1：10的質量比混合而成，並採用naoh調節ph值至12；所述溴化微球與6-氨基己酸的重量比為1000:100。
[0054]
作為本實施例的優選實現方式，還包括對羧基化微球進行後處理的步驟：將得到的含有羧基化微球的反應混合物抽濾，過濾物依次用去離子水、0.2mol/l的乙酸溶液、去離子水進行清洗，抽乾，得到羧基化微球。
[0055]
(4)將步驟(3)中得到的所述羧基化微球，採用2倍體積的無水乙醇淋洗，再用5倍體積的二氯甲烷淋洗，至除去水，抽乾，得到無水的羧基化微球；
[0056]
向所述羧基化微球中，加入n-羥基琥珀醯亞胺、二環己基碳二亞胺、二氯甲烷，在溫度35℃、攪拌速度130rpm下，反應16h，得到層析活化偶聯介質。
[0057]
其中，所述羧基化微球、n-羥基琥珀醯亞胺、二環己基碳二亞胺的重量比為1000:28:50。
[0058]
作為本實施例的優選實現方式，還包括對層析活化偶聯介質進行後處理的步驟：將得到的含有層析活化偶聯介質的反應混合物抽濾，過濾物依次用5倍體積的二氯甲烷、5倍體積的異丙醇衝洗，抽乾，得到層析活化偶聯介質。
[0059]
實施例2
[0060]
本實施例中的層析活化偶聯介質，以聚丙烯酸酯微球為基球，且具有如式(ⅰ)所示的結構：
[0061][0062]
所述聚丙烯酸酯微球的粒徑為50微米。
[0063]
本實施例所述的層析活化偶聯介質的製備方法，具體包括如下步驟：
[0064]
(1)取聚丙烯酸酯微球，用2倍體積的去離子水清洗，並浸泡5min，抽乾，重複6次，得到清洗後的聚丙烯酸酯微球；
[0065]
取清洗後的所述聚丙烯酸酯微球、硫酸鈉、氫氧化鈉、硼氫化鈉，以水作為反應溶劑，將所述氫氧化鈉溶於水中，並與所述聚丙烯酸酯微球、硫酸鈉、硼氫化鈉，混合均勻，在溫度40℃、攪拌速度110rpm下，反應2h，得到第一反應物；
[0066]
再向所述第一反應物中加入烯丙基縮水甘油醚、水，在溫度40℃、攪拌速度150rpm下，反應20h，得到烯丙基化微球。
[0067]
其中，所述聚丙烯酸酯微球、硫酸鈉、氫氧化鈉、硼氫化鈉、烯丙基縮水甘油醚的重量比為1000:165:50:7:100。製備所述第一反應物時，水與所述氫氧化鈉的重量比為1:1。製備烯丙基化微球時，水與所述烯丙基縮水甘油醚的重量比為3:2。
[0068]
作為本實施例的優選實現方式，還包括對所述烯丙基化微球進行後處理的步驟：將得到的含有所述烯丙基化微球的反應混合物抽濾，過濾物依次用5倍體積的去離子水、5倍體積的95v/v％乙醇、2倍體積的去離子水、2倍體積的0.2mol/l的乙酸、5倍體積的去離子水洗滌，抽乾，得到烯丙基化微球。
[0069]
(2)向步驟(1)中得到的所述烯丙基化微球中，加入乙酸鈉、水，混合均勻；再向其中加入溴，在溫度35℃、攪拌速度110rpm下，反應1h；然後，向其中加入甲酸鈉，反應得到溴化微球。
[0070]
其中，所述烯丙基化微球、乙酸鈉的重量比為1000:2；所述烯丙基化微球與所述溴的重量比為1000：5；所述烯丙基化微球與所述甲酸鈉的重量比為1000：10。
[0071]
作為本實施例的優選實現方式，還包括對溴化微球進行後處理的步驟：將得到的含有溴化微球的反應混合物抽濾，過濾物用去離子水洗滌，抽乾，得到溴化微球。
[0072]
(3)向步驟(2)中得到的所述溴化微球中，加入6-氨基己酸的水溶液，在溫度50℃、攪拌速度110rpm下，反應16h，得到羧基化微球；
[0073]
其中，所述6-氨基己酸的水溶液為6-氨基己酸與水按照1：10的質量比混合而成，並採用naoh調節ph值至12；所述溴化微球與6-氨基己酸的重量比為1000:110。
[0074]
作為本實施例的優選實現方式，還包括對羧基化微球進行後處理的步驟：將得到的含有羧基化微球的反應混合物抽濾，過濾物依次用去離子水、0.2mol/l的乙酸溶液、去離子水進行清洗，抽乾，得到羧基化微球。
[0075]
(4)將步驟(3)中得到的所述羧基化微球，採用2倍體積的無水乙醇淋洗，再用5倍體積的二氯甲烷淋洗，至除去水，抽乾，得到無水的羧基化微球；
[0076]
向所述羧基化微球中，加入n-羥基琥珀醯亞胺、二環己基碳二亞胺、二氯甲烷，在溫度20℃、攪拌速度150rpm下，反應20h，得到層析活化偶聯介質。
[0077]
其中，所述羧基化微球、n-羥基琥珀醯亞胺、二環己基碳二亞胺的重量比為1000:20:45。
[0078]
作為本實施例的優選實現方式，還包括對層析活化偶聯介質進行後處理的步驟：將得到的含有層析活化偶聯介質的反應混合物抽濾，過濾物依次用5倍體積的二氯甲烷、5倍體積的異丙醇衝洗，抽乾，得到層析活化偶聯介質。
[0079]
實施例3
[0080]
本實施例中的層析活化偶聯介質，以聚丙烯酸酯微球為基球，且具有如式(ⅰ)所示的結構：
[0081][0082]
所述聚丙烯酸酯微球的粒徑為90微米。
[0083]
本實施例所述的層析活化偶聯介質的製備方法，具體包括如下步驟：
[0084]
(1)取聚丙烯酸酯微球，用2倍體積的去離子水清洗，並浸泡4min，抽乾，重複5次，得到清洗後的聚丙烯酸酯微球；
[0085]
取清洗後的所述聚丙烯酸酯微球、硫酸鈉、氫氧化鈉、硼氫化鈉，以水作為反應溶劑，將所述氫氧化鈉溶於水中，並與所述聚丙烯酸酯微球、硫酸鈉、硼氫化鈉，混合均勻，在溫度45℃、攪拌速度150rpm下，反應1h，得到第一反應物；
[0086]
再向所述第一反應物中加入烯丙基縮水甘油醚、水，在溫度45℃、攪拌速度110rpm下，反應18h，得到烯丙基化微球。
[0087]
其中，所述聚丙烯酸酯微球、硫酸鈉、氫氧化鈉、硼氫化鈉、烯丙基縮水甘油醚的重量比為1000:165:50:7:300。製備所述第一反應物時，水與所述氫氧化鈉的重量比為1:1。製備烯丙基化微球時，水與所述烯丙基縮水甘油醚的重量比為3:2。
[0088]
作為本實施例的優選實現方式，還包括對所述烯丙基化微球進行後處理的步驟：將得到的含有所述烯丙基化微球的反應混合物抽濾，過濾物依次用5倍體積的去離子水、5倍體積的95v/v％乙醇、2倍體積的去離子水、2倍體積的0.2mol/l的乙酸、5倍體積的去離子水洗滌，抽乾，得到烯丙基化微球。
[0089]
(2)向步驟(1)中得到的所述烯丙基化微球中，加入乙酸鈉、水，混合均勻；再向其中加入溴，在溫度25℃、攪拌速度150rpm下，反應2h；然後，向其中加入甲酸鈉，反應得到溴化微球。
[0090]
其中，所述烯丙基化微球、乙酸鈉的重量比為1000:8；所述烯丙基化微球與所述溴的重量比為1000：7；所述烯丙基化微球與所述甲酸鈉的重量比為1000：20。
[0091]
作為本實施例的優選實現方式，還包括對溴化微球進行後處理的步驟：將得到的含有溴化微球的反應混合物抽濾，過濾物用去離子水洗滌，抽乾，得到溴化微球。
[0092]
(3)向步驟(2)中得到的所述溴化微球中，加入6-氨基己酸的水溶液，在溫度45℃、攪拌速度150rpm下，反應18h，得到羧基化微球；
[0093]
其中，所述6-氨基己酸的水溶液為6-氨基己酸與水按照1：10的質量比混合而成，並採用naoh調節ph值至12；所述溴化微球與6-氨基己酸的重量比為1000:80。
[0094]
作為本實施例的優選實現方式，還包括對羧基化微球進行後處理的步驟：將得到的含有羧基化微球的反應混合物抽濾，過濾物依次用去離子水、0.2mol/l的乙酸溶液、去離子水進行清洗，抽乾，得到羧基化微球。
[0095]
(4)將步驟(3)中得到的所述羧基化微球，採用2倍體積的無水乙醇淋洗，再用5倍
體積的二氯甲烷淋洗，至除去水，抽乾，得到無水的羧基化微球；
[0096]
向所述羧基化微球中，加入n-羥基琥珀醯亞胺、二環己基碳二亞胺、二氯甲烷，在溫度25℃、攪拌速度110rpm下，反應18h，得到層析活化偶聯介質。
[0097]
其中，所述羧基化微球、n-羥基琥珀醯亞胺、二環己基碳二亞胺的重量比為1000:35:60。
[0098]
作為本實施例的優選實現方式，還包括對層析活化偶聯介質進行後處理的步驟：將得到的含有層析活化偶聯介質的反應混合物抽濾，過濾物依次用5倍體積的二氯甲烷、5倍體積的異丙醇衝洗，抽乾，得到層析活化偶聯介質。
[0099]
實施例4
[0100]
本實施例中的層析活化偶聯介質，以聚丙烯酸酯微球為基球，且具有如式(ⅰ)所示的結構：
[0101][0102]
所述聚丙烯酸酯微球的粒徑為70微米。
[0103]
本實施例所述的層析活化偶聯介質的製備方法，具體包括如下步驟：
[0104]
(1)取聚丙烯酸酯微球、硫酸鈉、氫氧化鈉、硼氫化鈉，以水作為反應溶劑，將所述氫氧化鈉溶於水中，並與所述聚丙烯酸酯微球、硫酸鈉、硼氫化鈉，混合均勻，在溫度50℃、攪拌速度130rpm下，反應1h，得到第一反應物；
[0105]
再向所述第一反應物中加入烯丙基縮水甘油醚、水，在溫度50℃、攪拌速度130rpm下，反應16h，得到烯丙基化微球。
[0106]
其中，所述聚丙烯酸酯微球、硫酸鈉、氫氧化鈉、硼氫化鈉、烯丙基縮水甘油醚的重量比為1000:165:50:7:200。製備所述第一反應物時，水與所述氫氧化鈉的重量比為1:1。製備烯丙基化微球時，水與所述烯丙基縮水甘油醚的重量比為3:2。
[0107]
(2)向步驟(1)中得到的所述烯丙基化微球中，加入乙酸鈉、水，混合均勻；再向其中加入溴，在溫度20℃、攪拌速度130rpm下，反應2h；然後，向其中加入甲酸鈉，反應得到溴化微球。
[0108]
其中，所述烯丙基化微球、乙酸鈉的重量比為1000:5；所述烯丙基化微球與所述溴的重量比為1000：10；所述烯丙基化微球與所述甲酸鈉的重量比為1000：15。
[0109]
(3)向步驟(2)中得到的所述溴化微球中，加入6-氨基己酸的水溶液，在溫度40℃、攪拌速度130rpm下，反應20h，得到羧基化微球；
[0110]
其中，所述6-氨基己酸的水溶液為6-氨基己酸與水按照1：10的質量比混合而成，並採用naoh調節ph值至12；所述溴化微球與6-氨基己酸的重量比為1000:100。
[0111]
(4)將步驟(3)中得到的所述羧基化微球，採用2倍體積的無水乙醇淋洗，再用5倍
體積的二氯甲烷淋洗，至除去水，抽乾，得到無水的羧基化微球；
[0112]
向所述羧基化微球中，加入n-羥基琥珀醯亞胺、二環己基碳二亞胺、二氯甲烷，在溫度35℃、攪拌速度130rpm下，反應16h，得到層析活化偶聯介質。
[0113]
其中，所述羧基化微球、n-羥基琥珀醯亞胺、二環己基碳二亞胺的重量比為1000:28:50。
[0114]
對比例1
[0115]
本對比例中，採用瓊脂糖作為基球，並按照實施例1的原料及方法製備層析活化偶聯介質。
[0116]
對比例2
[0117]
本對比例中，按照實施例1的原料及方法製備層析活化偶聯介質，區別僅在於，步驟(3)中，將6-氨基己酸的水溶液替換為等重量的5-氨基戊酸。
[0118]
對比例3
[0119]
本對比例中，按照實施例1的原料及方法製備層析活化偶聯介質，區別僅在於，步驟(3)中，將6-氨基己酸的水溶液替換為等重量的7-氨基庚酸。
[0120]
對比例4
[0121]
本對比例中，按照實施例1的原料及方法製備層析活化偶聯介質，區別僅在於，步驟(1)中，所述聚丙烯酸酯微球、硫酸鈉、氫氧化鈉、硼氫化鈉、烯丙基縮水甘油醚的重量比為1000:165:50:7:400。
[0122]
對比例5
[0123]
本對比例中，按照實施例1的原料及方法製備層析活化偶聯介質，區別僅在於，步驟(1)中，所述聚丙烯酸酯微球、硫酸鈉、氫氧化鈉、硼氫化鈉、烯丙基縮水甘油醚的重量比為1000:165:50:7:50。
[0124]
效果實驗例
[0125]
為驗證本發明所述的層析活化偶聯介質的技術效果，進行以下試驗：
[0126]
取實施例1-4、對比例1-5中製備得到的層析活化偶聯介質，測試耐壓性能、配基密度、與親和配基偶聯率。
[0127]
效果實驗例1：耐壓性能測試
[0128]
一儀器/設備
[0129]
循環水真空泵、g3砂芯漏鬥抽洗系統、層析設備、層析柱(φ1.60cm
×
20.00cm)
[0130]
二步驟
[0131]
1、樣品處理
[0132]
取待測試填料20-25ml置於50ml規格g3砂芯漏鬥抽洗系統中，倒入20ml去離子水，打開真空泵進行抽洗，直至砂芯漏鬥1min內無液體滴下。重複該抽洗5次。
[0133]
2、樣品裝柱
[0134]
按照預裝柱填裝標準操作規程裝柱，控制填料床層高度為10
±
0.2cm。，3、樣品測試
[0135]
1)將填裝完成的層析柱接到層析設備上。
[0136]
2)從0開始設定一定的流速vx(ml/min)(v1為1ml/min，vx＝x ml/min)，保持該流速5min後，記錄此時系統顯示壓力px(mpa)。
[0137]
3)將流速以1ml/min的梯度持續增加，重複2)的過程，記錄相應vx時候的px。
[0138]
4)直至系統壓力超過1.2mpa為止，記錄此時對應的流速為v(ml/min)，即最大流速。或者當某一時刻增加流速時，系統壓力急劇增加，說明該填料達到了壓力耐受的極限，記錄下上一時刻的流速為最大流速v，對應的壓力為最大壓力p。
[0139]
5)將層析柱旁路，用上述方法記錄在同樣流速vx(ml/min)下儀器的背景壓力py。
[0140]
4、計算結果
[0141]
根據公式計算出vx與對應的柱壓pc。公式如下：
[0142]
1)vx對應柱壓pc計算公式
[0143]
pc＝p
x-py[0144]
式中：
[0145]
pc——流速vx下對應柱壓(mpa)；
[0146]
px——流速vx下對應系統壓力(mpa)；
[0147]
py——流速vx下對應儀器的背景壓力(mpa)。
[0148]
效果實驗例2：nhs配基密度測定
[0149]
一儀器/設備
[0150]
分光光度計、離心機、移液器、循環水式真空泵、砂芯漏鬥
[0151]
二試劑藥品
[0152]
n-羥基琥珀醯亞胺(nhs,mw 115.09)、濃氨水
[0153]
三步驟
[0154]
1、nhs標準曲線的製作
[0155]
1)配製氨水0.1mol/l
[0156]
準確量取0.667ml濃氨水(15m)加入到99.333ml去離子水並混勻。
[0157]
2)配製0.0002mol/l(0.2mm)的nhs標準品的水溶液
[0158]
準確稱取nhs固體0.0575g，加入5ml去離子水，配成0.10mol/l的nhs母液；量取0.020ml母液，加入去離子水9.980m混勻。
[0159]
3)在5ml離心管中按表所示的比例加入各樣品，混勻。
[0160]
4)取1ml樣品加入到石英比色皿中，分光光度計測定260nm的吸光值a
260
。將nhs終濃度與吸光值a
260
做標準曲線，並擬合出標準曲線公式a
260
＝a
×cnhs
，其中，nhs濃度測定的標準曲線如圖1所示。
[0161]
2、實際樣品的測定
[0162]
將待測nhs介質用砂芯漏鬥以去離子水抽洗5次，再稱取洗淨抽乾的nhs介質0.5g(精確到0.001g)，加入3.0ml 0.1mol/l的氨水混勻後在室溫下靜置過夜16h，離心(3000rpm,5min)取上清。取3.0ml氨水和0.5ml上清液混勻，測定吸光值a
260
，具體步驟與標準曲線測定基本一致。
[0163]
3、結果計算
[0164]
根據如下公式計算nhs介質的配基密度。
[0165][0166]
式中：
[0167]cnhs
為nhs介質的配基密度，μmol/g；
[0168]a260
為所測得上清液在波長260nm的吸光值；
[0169]
a為標準曲線擬合所得的常數；
[0170]
m為稱取的nhs介質質量，g。
[0171]
效果實驗例3：nhs介質與親和配基偶聯率測定
[0172]
一儀器/設備
[0173]
恆溫水浴振蕩搖床、循環水式真空泵、砂芯漏鬥、分光光度計、離心機
[0174]
二試劑藥品
[0175]
濃鹽酸、碳酸氫鈉、氯化鈉、考馬斯亮藍g-250、乙醇(95％)、磷酸(85％)牛血清白蛋白、溶菌酶
[0176]
三步驟
[0177]
1、配製考馬斯亮藍染液：
[0178]
取100mg考馬斯亮藍g-250，溶於50ml 95％乙醇中，溶解後加入100ml85％磷酸，用純水定容至1l，過夜後用濾紙過濾備用。(每次配製後用牛血清白蛋白bsa溶液做標準曲線。)
[0179]
標準曲線製作：準確配製牛血清白蛋白bsa母液2mg/ml備用。分別吸取bsa母液0.5ml、1ml、2ml、2.5ml、4ml稀釋到10ml，製成濃度分別為0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.5mg/ml、0.8mg/ml。取3ml考馬斯染液置於玻璃比色皿中再放入分光光度計背景清零，再向該比色皿中加入75ul上述蛋白溶液混勻後計時3min讀數紫外吸收值，重複此步驟測出上述不同濃度蛋白溶液的紫外吸收值。以蛋白濃度c和紫外吸收值a製作曲線得出標準曲線方程a＝c*a+b，其中，測定得到的蛋白濃度的標準曲線如圖2所示。
[0180]
2、配製緩衝液a(1mmhcl，2-8℃預冷)
[0181]
量取8ul濃鹽酸溶於100ml去離子水中混勻配得1m hcl，再取100ul1m hcl溶於999.9ml去離子水中混勻，再將該緩衝液置於2-8℃冰箱中預冷。
[0182]
3、配製緩衝液b(0.1mnahco3+0.5m nacl，ph 8.3)
[0183]
稱取8.40g碳酸氫鈉與29.22g氯化鈉溶於1000ml去離子水中，溶解後用hcl調ph為8.3.
[0184]
4、配置蛋白溶液：
[0185]
稱取200mg溶菌酶蛋白溶於20ml緩衝液(0.1mnahco3+0.5mnacl，ph 8.3)中，使得蛋白終濃度為10mg/ml。
[0186]
5、偶聯反應
[0187]
將nhs活化介質用4℃預冷的1mmhcl洗3-5次後抽乾，再用緩衝液(0.1mnahco3+0.5m nacl，ph 8.3)清洗2次；
[0188]
取5ml溶菌酶蛋白溶液加入到5ml預處理過的介質中，反應溫度恆定為室溫(25℃)，反應12-14h；
[0189]
反應停止後，上清離心(3000rpm，5min，室溫)，收集上清液。
[0190]
6、測定上清液蛋白濃度
[0191]
取3ml考馬斯染液置於玻璃比色皿中再放入分光光度計背景清零，再向該比色皿中加入75ul溶菌酶蛋白溶液(10mg/ml)混勻後計時3min讀數紫外吸收值為反應前上清液吸
收值a
前
。
[0192]
重複上述步驟檢測反應後收集上清液，讀取紫外吸收值為反應後上清液吸收值a
後
。
[0193]
7、結果計算
[0194]
根據如下公式計算蛋白偶聯效率：
[0195][0196]
式中：
[0197]
w為蛋白偶聯效率；
[0198]a後
反應後上清液吸收值；
[0199]a前
反應前上清液吸收值；
[0200]
a為蛋白濃度標準曲線方程係數；
[0201]
b為蛋白濃度標準曲線方程係數。
[0202]
效果實驗結果：
[0203]
經實驗，結果如下：
[0204][0205]
根據實施例1-4、對比例2-5與對比例1的對比可知，本發明中採用聚丙烯酸酯作為基球，相較於瓊脂糖，得到的層析活化偶聯介質的耐壓性能顯著提升。根據實施例1-4與對比例2-3的對比可知，本發明採用6-氨基己酸將n-羥基琥珀醯亞胺鍵合在溴化微球上，得到的層析活化偶聯介質的配基密度未產生較大影響，但對層析活化偶聯介質與親和配基結合的性能產生顯著影響。根據實施例1-4與對比例4-5的對比可知，聚丙烯酸酯微球與烯丙基縮水甘油醚的重量比對配基密度、與親和配基結合的性能產生較大影響，當烯丙基縮水甘油醚用量過少時，配基密度下降；當烯丙基縮水甘油醚用量過多時，配基密度雖然有一定程度的提升，但與親和配基結合的性能下降明顯。實施例1中的層析活化偶聯介質在耐壓性
能、配基密度、與親和配基結合的性能上均表現優異。
[0206]
由技術常識可知，本發明可以通過其它的不脫離其精神實質或必要特徵的實施方案來實現。因此，上述公開的實施方案，就各方面而言，都只是舉例說明，並不是僅有的。所有在本發明範圍內或在等同於本發明的範圍內的改變均被本發明包含。