一種利用黑麴黴發酵生產β-甘露聚糖酶的方法

2023-08-09 08:22:11 1

專利名稱：一種利用黑麴黴發酵生產β-甘露聚糖酶的方法
技術領域：
本發明涉及一種利用黑麴黴發酵生產β-甘露聚糖酶的方法，本發明還涉及一種飼料添加劑。
背景技術：
玉米-豆柏型日糧是我國飼養單胃動物的主要日糧，大豆中所含有的甘露聚糖有很強的抗營養作用。目前，我國每年大豆進口量為4000萬噸左右，其中80%以上用於飼料工業。甘露聚糖是植物半纖維素的重要組分，是由β-1，4- 吡喃甘露糖連接而成的線狀多糖，豆柏中甘露聚糖的 含量在1.2%以上。甘露聚糖具有高親水性，在單胃動物的消化道內大量吸水，增加了消化道內容物的粘度，抵抗胃腸的蠕動，直接影響動物對營養物質的消化吸收，排洩物中因含有較多的有機物而造成養殖場環境汙染。甘露聚糖的完全酶解需要β -甘露聚糖酶、β -甘露糖苷酶、β -葡糖苷酶等多種酶的協同作用。其中β_甘露聚糖酶能夠高效降解甘露聚糖的粘度，在飼料中的應用比較廣泛。β -甘露聚糖酶是一類能水解甘露聚糖的半纖維素酶類，廣泛存在於動植物和微生物中。甘露聚糖酶能降解飼料中的甘露聚糖，不僅可以消除甘露聚糖的抗營養作用，同時生成的甘露寡糖在動物生產中起著重要的作用。試驗證明:甘露寡糖能提高仔豬日增重和飼料轉化率，其原因可能是其提高了仔豬的免疫力，抑制了病原菌在胃腸道的增殖。另夕卜，甘露寡糖還具有一定的免疫原性，能夠刺激機體免疫應答，與病毒、毒素結合，減緩抗原的吸收，調節腸道的菌群平衡，幹擾病原菌的定植。研究還發現，甘露寡糖能夠顯著提高無菌仔豬血清和腸黏膜中IgA、IgG和IgM的含量及血液中白細胞介素-2的水平，增強T淋巴細胞功能和小腸原始淋巴細胞的活性，增強小腸內白細胞的吞噬能力和促進淋巴細胞釋放IFN-Y細胞素。邵良平等報導，甘露寡糖能極顯著提高仔豬白細胞分化抗體CD3的水平。近年來，關於甘露寡糖吸附黴菌毒素的研究也越來越受到人們的重視，甘露寡糖可結合玉米赤黴烯酮，通過物理吸附或直接結合黴菌毒素，且不影響其他飼料成分。

發明內容
本發明的目的是提供一種利用黑麴黴發酵生產β_甘露聚糖酶的方法。該黑麴黴(Aspergillus niger)YM33182,直接接來源於曹雲鶴處，間接來源為陳有為，該菌種已於2006年10月31日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為:CCTCCNo M206113。—種利用黑麴黴發酵生產β_甘露聚糖酶的方法，其特徵在於，所述黑麴黴發酵生產β-甘露聚糖酶方法的步驟如下:(一)製備發酵菌種:將斜面培養的黑麴黴(Aspergillusniger)YM33182經液體菌種斜面菌種培養和一級液體培養後，得到發酵菌種；其具體過程是:I)斜面菌種:使用土豆培養基,將4°C冰箱保存的菌種劃線接種到培養基上,在30-35°C條件下，搖瓶種子培養基培養24-72小時，待孢子長滿後，用無菌冷卻水洗下；2) 一級液體培養:用一支斜面試管用IOml無菌水，製備孢子懸液，使得孢子含量在lX108CFU/ml以上，取Iml孢子懸液接種到250ml種子培養基中，在25_35°C、250rpm條件下瓶培養8-48小時，獲得種子發酵液；(二)利用上述得到的菌種發酵生產β -甘露聚糖酶:3)、利用得到的菌種發酵生產β -甘露聚糖酶是採用液體發酵方法生產，使用的發酵培養基配方以重量份數計包括:玉米粉35-45份、豆柏11-14份、硫酸銨1-2份、K2HPO4
3.5-4.5份，魔芋粉0.5-1.0g,溶於lOOOmL，蒸餾水中，調節pH值，高壓滅菌。2、根據權利要求1所述的一種利用黑麴黴發酵生產β -甘露聚糖酶的方法，其特徵在所述液體發酵培養基中測定甘露聚糖酶的活力在60-84小時，酶活力最高；所述液體發酵培養基酶的最佳催化PH在2-6.0有較高的催化活力；3、根據權利要求1所述的方法，其特徵在於:所述液體發酵培養基產生的酶在60-70度有較好的耐熱性；4、根據權利要求1所述的方法，其特徵在於:所述土豆培養基配方以重量份數計包括:土豆去皮切碎，15-25份；蔗糖，1.5-2.5份；瓊脂1-2.0份；自來水100份，水:原料=I: 0.015-0.2 ；5、根據權利要求1所述的方法，其特徵在於:所述滅菌條件是:115_125°C高壓滅菌15-25分鐘；6、根據權利要求1所述的一種利用黑麴黴發酵生產β_甘露聚糖酶的方法，其特徵在於利用黑麴黴發酵得到的酸性β_甘露聚糖酶水解甘露聚糖。7、根據權利要求6所述的酸性β -甘露聚糖酶水解甘露聚糖，其特徵在於:所述甘露聚糖為魔芋精粉和玉米粉。本發明的黑麴黴在液體培養基中生長96小時，能夠分泌表達β_甘露聚糖酶。甘露聚糖酶的最適催化溫度為40°C，最適pH值在2-6之間，在70°C時，保溫20分鐘，酶的催化活性損失不超過40%，具有較好的耐熱性。在搖瓶條件下，發酵活力最高達到1200U/mL，具有用於飼料添加劑的潛在前景。


圖1是發酵不同時間點的上清液甘露聚糖酶的酶活力(U/ml)；圖2是不同溫度條件下甘露聚糖酶的相對活力(百分數％ )；圖3是甘露聚糖酶在不同pH條件下的相對催化活力(百分數％ )；
具體實施例方式DNS試劑的配製:稱取酒石酸鉀鈉91.0g，溶於500mL水中，加入3,5- 二硝基水楊酸3.15g、Na0H 20.0g，不超過50°C水浴溶解；再加入苯酚2.5g、無水亞硫酸鈉2.5g，攪拌溶
解，冷卻後定容至IOOOmL ;儲存於棕色瓶中，放置一周後使用。
β -甘露聚糖酶酶活的測定(DNS法):取待測溶液lmL，加入ImL 0.8% (質量百分含量)甘露聚糖溶液，恆溫水浴中反應20min，然後加入2.5mL DNS試劑(終止反應)。沸水浴煮5min,然後冷卻至室溫,用蒸懼水定容至12.5mL,測OD540。
在pH6.0和37°C條件下，每分鐘從底物半乳甘露聚糖(Sigma，G0753)中水解產生I μ mo I的甘露糖的所需的酶量定義為I個酶活單位，用U表示。實施例1:製備黑麴黴發酵囷種斜面培養基:土豆培養基(土豆去皮切碎，20g ;蔗糖，2.0g ;瓊脂1.5g ;自來水IOOmL, 120°C高壓滅菌20分鐘)；搖瓶種子培養基:土豆培養基(不含瓊脂)。將4°C冰箱保藏的菌種接種於斜面培養基，30°C培養48hr，待孢子長滿後，用無菌冷卻水洗下。一支斜面試管用IOml無菌水，製備孢子懸液，孢子的含量在108CFU/ml以上。在250mL種子培養基中接種ImL孢子懸液。30°C、250rpm搖瓶培養20hr，獲得種子發酵液。實施例2:黑麴黴搖瓶發酵生產β -甘露聚糖酶工藝發酵培養基配方:玉米粉40g、豆柏12.5g、硫酸銨1.5g、K2HPO4 4.0g，魔芋粉0.75g，溶於lOOOmL，蒸餾水中，調節pH值至6.2，120°C高壓滅菌20分鐘。500mL搖瓶裝液量60mL。按照1: 1000的比例接種種子液，30°C、250rpm連續震蕩培養96hr，每隔12hr取發酵液lmL，12000rpm離心，取上清液在pH6.0和37°C條件下測定甘露聚糖酶的活力。結果見圖1。實施例3: β -甘露聚糖酶的酶學性質 1、最適溫度的測定:分別在20°C、30 V、40°C、50 V、60 V和70 V條件下測定酶的
相對催化活力。酶的最佳催化溫度為40°C，在30-60°C範圍內，均保持在最佳催化活性的60%以上。結果見圖2。2、最適催化pH值的測定:分別在2.0,3.0,4.0,5.0,6.0,7.0緩衝液中，測定酶的
催化活性。酶的最佳催化PH4.0，在2.0-5.0範圍內都有較高的催化活力。結果見圖3。3、溫度穩定性的測定:把粗酶液分別在60°C、70°C和80°C保溫20分鐘，然後在最適催化條件下測定剩餘酶。與未經加熱處理的酶的活力相比較，計算殘餘酶活。該甘露聚糖酶在70°C保溫20分鐘還有55%的殘餘酶活，該酶具有較好的耐熱性。結果見表I。表1、甘露聚糖酶的耐熱性
權利要求
1.一種利用黑麴黴發酵生產β-甘露聚糖酶的方法，其特徵在於，所述黑麴黴發酵生產β-甘露聚糖酶方法的步驟如下: (一)製備發酵菌種:將斜面培養的黑麴黴(Aspergillusniger)YM33182經液體菌種斜面菌種培養和一級液體培養後，得到發酵菌種；其具體過程是: 1)斜面菌種:使用土豆培養基，將4°C冰箱保存的菌種劃線接種到培養基上，在30-35°C條件下，搖瓶種子培養基培養24-72小時，待孢子長滿後，用無菌冷卻水洗下； 2)一級液體培養:用一支斜面試管用IOml無菌水，製備孢子懸液，使得孢子含量在I X 108CFU/ml以上，取Iml孢子懸液接種到250ml種子培養基中，在25_35°C、250rpm條件下瓶培養8-48小時，獲得種子發酵液； (二)利用上述得到的菌種發酵生產β-甘露聚糖酶: 3)、利用得到的菌種發酵生產β-甘露聚糖酶是採用液體發酵方法生產，使用的發酵培養基配方以重量份數計包括:玉米粉35-45份、豆柏11-14份、硫酸銨1-2份、K2HPO43.5-4.5份，魔芋粉0.5-1.0g,溶於lOOOmL，蒸餾水中，調節pH值，高壓滅菌。
2.根據權利要求1所述的一種利用黑麴黴發酵生產β_甘露聚糖酶的方法，其特徵在所述液體發酵培養基中測定甘露聚糖酶的活力在60-84小時，酶活力最高；所述液體發酵培養基酶的最佳催化PH在2-6.0有較高的催化活力；
3.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於:所述液體發酵培養基產生的酶在60-70度有較好的耐熱性；
4.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於:所述土豆培養基配方以重量份數計包括:土豆去皮切碎，15-25份； 蔗糖，1.5-2.5份；瓊脂1-2.0份；自來水100份，水:原料=I: 0.015-0.2 ；
5.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於:所述滅菌條件是:115-125°C高壓滅菌15-25分鐘；
6.根據權利要求1所述的一種利用黑麴黴發酵生產β_甘露聚糖酶的方法，其特徵在於利用黑麴黴發酵得到的酸性β-甘露聚糖酶水解甘露聚糖。
7.根據權利要求6所述的酸性β_甘露聚糖酶水解甘露聚糖，其特徵在於:所述甘露聚糖為魔芋精粉和玉米粉。
全文摘要
本發明的目的是提供一種利用黑麴黴發酵生產β-甘露聚糖酶的方法。該方法所用的黑麴黴在液體培養基中生長96小時，能夠分泌表達β-甘露聚糖酶。甘露聚糖酶的最適催化溫度為40℃，最適pH值在2-6之間，在70℃時，保溫20分鐘，酶的催化活性損失不超過40％，具有較好的耐熱性。在搖瓶條件下，發酵活力最高達到1200U/mL，具有用於飼料添加劑的潛在前景。
文檔編號C12N9/42GK103173427SQ201210240229
公開日2013年6月26日 申請日期2012年7月12日 優先權日2012年7月12日
發明者催栩, 董建輝, 劉玉榮, 姚宏明 申請人:北京偉嘉人生物技術有限公司, 瀋陽偉嘉牧業技術有限公司, 北京偉嘉盛邦生物技術有限公司