檢測犬貓鉤端螺旋體的螢光定量pcr方法及其引物和檢測試劑盒的製作方法
2023-07-26 18:11:11
專利名稱：檢測犬貓鉤端螺旋體的螢光定量pcr方法及其引物和檢測試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種快速檢測犬貓鉤端螺旋體的螢光定量PCR方法，還涉及該方法用 的引物和檢測試劑盒。屬於生物製藥技術領域。
背景技術：
鉤端螺旋體(簡稱「鉤體」)，隸屬於螺旋體目鉤端螺旋體科鉤端螺旋體屬 (Leptospira)，分為致病性的問號鉤體(L. interrogans)和腐生性的雙曲鉤端螺旋體 (Lbiflexa)0鉤體的自然宿主眾多，其中作為傳染源對人類危害最大的主要是鼠類、蛙類 和家畜(豬、牛、犬為主)。寵物犬作為目前與人類最為密切的伴侶動物，開展對伴侶動物的 鉤體檢測和防治工作尤為重要。鉤端螺旋體病感染人或寵物後，可通過多種途徑交叉感染 幾乎所有溫血動物，在臨床症狀消失後，即使犬體內有較高滴度抗體時，仍可通過尿液間歇 性排菌達數月至數年，使犬成為危險的帶菌者。Meyer等報導了 323例犬熱病，並首次分離了犬鉤端螺旋體。Randall和Copper 等也成功分離鑑定了犬鉤體。由於鉤體血清群眾多(28個血清群、250餘個血清型)，各血 清群、型抗體之間交叉保護作用較弱或無，不同國家甚至同一國家不同地區主要流行的鉤 體血清群、型差異很大，而生態環境改變、自然宿主變更、人口流行增強等原因，極易導致優 勢血清群型更迭，導致免疫失敗。因此，研究具有不同血清群、型之間有廣泛交叉保護作用 的免疫原，對於鉤體病診斷和預防均具有極為重要的意義。迄今為止，從犬體內已分離到菌 群有黃疸出血群、犬群、七日熱群、秋季群、巴達維亞群、澳洲甲群、色若群、波摩那群等。在 犬的鉤體感染中，最常見的是犬群，但致死性的大多是黃疸出血群。犬感染後，血清抗體可 存在數年至一生。我國已從犬中分離出8個型。犬型最常見，其次為黃疸出血型及波摩那 型。鉤端螺旋體傳統的檢測方法主要是菌株分離培養和血清學檢測。但該菌不易培 養，早期患畜血液中雖含病原體，但抗體滴度很低，傳統的血清學檢測不易檢測。因此，臨床 檢測主要依賴分子檢測方法。如DNA探針檢測；PCR擴增溶血相關抗原Hapl ；利用LipL32 作為模板；擴增16S rRNA片段；多重PCR擴增23S rDNA片段，並酶切鑑別致病菌株和非致 病菌株。
發明內容
本發明的目的在於解決上述問題，提供一種靈敏度高、特異性強的犬貓鉤端螺旋 體的螢光定量PCR方法及其該方法用的引物和檢測試劑盒，為鉤端螺旋體病早期快速進行 特異性檢測提供新途徑。為了實現本發明的目的，本發明的技術方案是檢測犬貓鉤端螺旋體的螢光定量PCR方法，其採用16s rRNA基因序 列為設計引物，上遊引物(Gl) :5』 -ACGAAAGCGTGGGTAGTG-3』 ；下遊引物(G2)5，-GCGGTCTACTTAATCCGT-3，。擴增片段長度為 119bp。本發明以16s rRNA標準質粒為模板，上遊、下遊引物為引物，將標準質粒進行10 倍梯度稀釋後作為模板進行螢光定量PCR反應，建立螢光定量PCR標準曲線。其中，螢光定量PCR 反應體系2XSYBR Green I 10 μ L, ROX ReferenceDye (50X) 0. 4 μ L,上遊弓丨物(50pmol/μ L) 0. 2 μ L，下遊弓丨物(50pmol/ μ L)0. 2μ L, DNA 1 μ L，Dilution water 8· 2 μ L ；反應條件為95 °C 10 秒一(94 °C 5 秒 —60 °C 10 秒—72 °C 15 秒)X 40。具體地說，本發明檢測犬貓鉤端螺旋體的螢光定量PCR方法，包括如下步驟1)目的基因的擴增以16s rRNA的基因核苷酸序列為模板，進行PCR反應，其中上遊引物為CAA TAC TCA GCG GCG AAC ；下遊引物為TTT TTG AGA TTAGCT CCC C ；回收 PCR 擴增產物；2)目的基因的克隆將步驟1)所擴增的目的基因克隆至pGEM-T easy載體中，轉化至E. coli DH5 α 株並擴增，鹼變性法提取質粒；3)螢光定量PCR檢測然後建立螢光定量PCR標準曲線，以陽性重組標準質粒為模板，上遊、下遊引物為 引物，進行螢光定量PCR檢測。本發明還提供用於檢測犬貓鉤端螺旋體的螢光定量PCR方法的引物，其 16s rRNA 基因序列為設計引物，上遊引物5』 -ACGAAAGCGTGGGTAGTG-3』；下遊引物 5，-GCGGTCTACTTAATCCGT-3，，擴增片段長度為 119bp。本發明進一步提供一種含所述引物的檢測試劑盒。本發明的方法具有良好的重複性。當模板濃度為lOcopies/yL以上時，均可擴 增出特異性產物。在最佳反應條件下反應效率為0.98，獲得的標準曲線相關係數R值達 1. 000，說明該標準品和所確定的擴增條件符合要求。標準曲線的線性範圍達到1 IXlO7 拷貝8個數量級，最低可檢測到約1個目的拷貝，即1. 2fgDNA。本發明選用犬型、黃疸出血型及波摩那型鉤體的16S rRNA及其保守性序列設計引 物進行螢光定量PCR全封閉反應，旨在對感染犬的各血清型進行流行病學調查，並對致病 的犬型、黃疸出血型及波摩那型鉤體等主要致病菌進行特異性檢測，這將填補國內空白。上海市地處長江三角洲，人口密度大，具備鉤端螺旋體滋生和傳播的良好條件，而 近年來上海寵物市場潛力在不斷擴大，造成整個生態結構極為複雜，因此，建立一套犬貓鉤 端螺旋體快速分子生物學檢查技術或快速、簡便的血清學檢測技術及進行鉤端螺旋體的流 行病學調查與分析，是保障我市人民和諧生活的關鍵環節之一，具有非常重要的公共衛生
眉、ο
圖1為本發明16s rRNA基因擴增結果，其中，1為陰性對照，2為目的條帶；圖2為本發明螢光定量PCR檢測陽性質粒pT16S，其中，1 8 依次為pT16S質粒 DNA倍比稀釋1 IO8為模板；圖3為本發明螢光定量PCR標準曲線；
圖4為本發明螢光定量PCR引物的融解曲線；圖5為本發明特異性檢測，其中，1 鉤體56601株DNA ；2 其他細菌或寄生蟲DNA。
具體實施例方式以下實施例用於說明本發明，但不用來限制本發明的保護範圍。實施例1本發明以我國參考標準株黃疸出血群賴型賴株(56601)，採用苯酚-氯仿法提取 上述DNA，經無DNA酶的RNA酶消化後，再次用苯酚-氯仿法提取DNA，用分光光度法測定 DNA的濃度和純度。根據Genbank中的16s rRNA的基因核苷酸序列，設計特異性引物，由上海英駿生 物技術有限公司合成。16s rRNA 的引物為:P16F_CAA TACTCA GCG GCG AAC ；P16R-TTT TTG AGA TTA GCT CCC C，大小為 616bp。採用 Accquire Taq HF 高保真酶(購自 Invitrogen 公 司)擴增16s rRNA基因，反應總體積為50 μ L，包括20pM P16F和P16R引物，IOOng DNA模 板、25 μ L 2X高保真酶Buffer和1 μ L高保真酶。PCR反應參數為94°C加熱解鏈30s，然 後54°C退火30s，72°C延伸60s，以上步驟共30個循環，再於72°C延伸lOmin。1. 0%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物，並切膠回收目的片段，回收過程參見Qiagen 瓊脂糖凝膠回收試劑盒說明書。用TA克隆試劑盒(購自Promega公司)將擴增的目的片段克隆至pGEM-T easy 載體中，轉化至E.coli DH5a株並擴增，鹼變性法提取質粒(步驟參見Qiagen質粒小提試 劑盒說明書)，EcoRI (購自Takara公司)單酶切鑑定，陽性質粒應被切為3. Okb和0. 6kb 兩條帶，將陽性質粒送北京華大基因公司利用T7Promoter測序引物測序，測序結果顯示該片段與Genbank 相應的16s rRNA序列完全相同。因此，將陽性質粒命名為pT16S。以 pT16S 標準質粒為模板，以 Gl (ACGAAAGCGTGGGTAGTG)、 G2 (GCGGTCTACTTAATCCGT)為引物，選用不同的引物濃度、退火溫度、延伸時間進行Real Time PCR反應，使用EppendorfRealplex螢光定量PCR儀進行反應。根據PCR反應結果，選 擇最佳反應條件。將標準質粒進行適度稀釋，測定其OD值，計算出標準質粒的拷貝數，並進行10倍 梯度稀釋。取濃度為Io7-Icopies/μ L的標準質粒為模板，進行Real-Time PCR，每個濃度 做3個平行樣，以建立標準質粒的擴增曲線，並計算出曲線的相關係數和PCR擴增效率。Real Time PCR擴增結束後根據擴增曲線及熔解曲線分析，有特異性產物的最低 起始模板濃度，並對比常規PCR反應，即為該Real-Time PCR的靈敏度。2 結果2. lpT16S標準質粒的構建2. 1. 1 16s rRNA基因的擴增與鑑定通過PCR擴增得到的產物，經1. 2%瓊脂糖凝膠電泳，結果顯示從鉤體56601株 DNA模板中分別擴增獲得預期大小的16s rRNA基因片段(圖1)。分別電泳回收目的基因， 連接T載體，經測序，結果顯示該患犬尿液DNA擴增獲得的16s rRNA序列與賴株的序列完 全相同。命名為pT16S。2.1.2 pT16S標準質粒的純度及拷貝數的計算
NanoDrop (ND-1000)測得 pT16S 標準質粒為 287ng/y L。根據公式copies/y L = Con (ng/ μ L) X 6. 02 X IO23 X 10_9/660 X鹼基數，計算標準品的拷貝數，進行10倍梯度稀釋， 稀釋至1拷貝/μ L。2. 2螢光定量PCR標準曲線的建立及溶解曲線分析SYBR Green Real-Time PCR 反應體系2 X SYBR Green I 10 μ L, ROXReference Dye(50X)0. 4μ L, Gl (50pmol/ul) 0. 2 μ L, G2 (50pmol/μ L) 0. 2 μ L, DNAl μ L, Dilution water 8· 2μ L。反應條件為95°C IOsec — (94°C 5sec — 60°C IOsec — 72°C 15sec) X40。 將標準質粒進行10倍梯度稀釋後作為模板進行螢光定量PCR，擴增結束後，進行融解曲線 分析結果顯示擴增產物中無引物二聚體，說明本發明設計的引物是特異的，且退火溫度合 適(圖4)。根據起始模板濃度的對數值和相應的Ct值擬出標準曲線。結果顯示標準曲 線的相關係數=1. 000。這表明不同梯度定量模板的對數值與Ct值之間呈現良好的線性關 系，標準曲線直線性好(圖2、3)。2. 3重複性及靈敏度檢測對於不同濃度的模板，三組樣品的擴增曲線表明，該方法具有良好的重複性。當模 板濃度為lOcopies/μ L以上時，均可擴增出特異性產物(圖5)。在最佳反應條件下反應效 率為0. 98，獲得的標準曲線相關係數R值達1. 000，說明該標準品和所確定的擴增條件符合 要求。標準曲線的線性範圍達到1 IX IO7拷貝8個數量級，最低可檢測到約1個目的拷 貝，SP 1. 2fgDNA。試驗例1我國參考標準株黃疸出血群賴型賴株(56601)購自中國藥品生物製品檢定所。鉤 體分枝桿菌(M. tuberculosis) H37Rv 株、牛分枝桿菌(M. bovissubsp. bovis) AF2122/97 株、 鳥分枝桿菌(M. avium subsp. avium) ATCC 15769株購自上海市肺科醫院檢驗科；草分枝杆 菌(M.phlei)、恥垢分枝桿菌(M. smegmatis)、海分枝桿菌(M. marinum)購自中國科學院微 生物研究所；卡介苗(Bacille Calmette-Guerin，BCG)、金黃色葡萄球菌、啤酒酵母菌、大腸 桿菌、鏈球菌、枯草桿菌、犬隱孢子蟲、犬球蟲、剛地弓形蟲等DNA陽性樣品由中國農科學院 上海獸醫研究所提供。以鉤體黃疸出血群賴株56601毒株DNA作為陽性對照，鉤體分枝桿菌、牛鉤體杆 菌、卡介苗，金黃色葡萄球菌、啤酒酵母菌、大腸桿菌、鏈球菌、枯草桿菌、犬隱孢子蟲、犬球 蟲、剛地弓形蟲基因組DNA和超純水作為陰2性對照，每種樣品DNA模板量為20ng/y L，並 以超純水作為對照，Real TimePCR擴增，進行特異性分析。用於特異性檢測的所有上述模板DNA濃度統一稀釋為50ng/ μ L，反應條件和反應 體系均參照上述方法進行。結果可見鉤體56601毒株模板基因組DNA為陽性(判定標準 Ct值明顯小於25)；從非特異菌株基因組DNA擴增Ct值比對可見鉤體分枝桿菌、牛分支杆 菌、鳥分支桿菌、恥垢分枝桿菌、海分枝桿菌、草分枝桿菌，金黃色葡萄球菌，大腸桿菌，弓形 蟲則的Ct值與陰性對照相當，明顯大於25(圖5)。結果顯示以上菌株檢測顯示為陰性。 這表明該方法應用於檢測臨床樣品時具有良好的特異性。試驗例22006-2009年間，本發明研究人員採集上海各區縣犬貓血液樣品103份和尿液 481份，其中，尿液樣品經12000rpm離心lOmin，沉澱分為兩份，其中一份利用加有新黴素(10 μ g/mL)的Korthof培養基分離培養，另一份經無DNA酶的RNA酶消化後，再次用苯 酚_氯仿法提取DNA，用分光光度法測定DNA的濃度和純度。經血液和尿液基因組DNA提取 後，利用上述方法進行螢光定量PCR檢測。以56601株DNA和pT16S DNA為陽性對照，超純 水為陰性對照。採用已建立的SYBR Green I螢光定量PCR鑑定，擴增結果顯示；103份犬貓血液 樣品檢測為僅1份陽性，而固體培養陽性率亦為1份，符合率為100% ；另外，481份犬貓尿 液樣品未檢測到陽性，培養為陰性。雖然，上文中已經用一般性說明及具體實施方案對本發明作了詳盡的描述，但在 本發明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因 此，在不偏離本發明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬於本發明要求保護的範圍。
權利要求
檢測犬貓鉤端螺旋體的螢光定量PCR方法，其特徵在於，其16s rRNA基因序列為設計引物，上遊引物5』 ACGAAAGCGTGGGTAGTG 3』；下遊引物5』 GCGGTCTACTTAATCCGT 3』，擴增片段長度為119bp。
2.如權利要求1所述螢光定量PCR方法，其特徵在於，以16srRNA標準質粒為模板，上 遊、下遊引物為引物，將標準質粒進行10倍梯度稀釋後作為模板進行螢光定量PCR反應，建 立螢光定量PCR標準曲線。
3.如權利要求2所述螢光定量PCR方法，其特徵在於，螢光定量PCR反應體系2XSYBR Green I 10 μ L，ROX Reference Dye (50 X) 0· 4 μ L，上遊引物(50pmol/μ L) 0· 2 μ L，下遊 引物(50pmol/y L)0. 2μ L，DNA 1 μ L, Dilution water 8· 2 μ L ；反應條件為95°C 10 秒 —(94°C 5 秒—60 0C 10 秒—72 0C 15 秒)X 40。
4.如權利要求1-3任意一項所述螢光定量PCR方法，其特徵在於，包括如下步驟1)目的基因的擴增以16s rRNA的基因核苷酸序列為模板，進行PCR反應，其中上遊引物為CAA TAC TCA GCG GCG AAC ；下遊引物為:TTT TTGAGATTA GCT CCC C ；回收 PCR 擴增產物；2)目的基因的克隆將步驟1)所擴增的目的基因克隆至PGEM-T easy載體中，轉化至Ε. coli DH5 α株並 擴增，鹼變性法提取質粒；3)螢光定量PCR檢測然後建立螢光定量PCR標準曲線，以陽性重組標準質粒為模板，上遊、下遊引物為引 物，進行螢光定量PCR檢測。
5.如權利要求1所述檢測犬貓鉤端螺旋體的螢光定量PCR方法用的引物，其特徵在 於，其16s rRNA基因序列為設計引物，上遊引物5』 -ACGAAAGCGTGGGTAGTG-3，；下遊引物 5，-GCGGTCTACTTAATCCGT-3，，擴增片段長度為 119bp。
6.如權利要求5所述引物的檢測試劑盒。
全文摘要
本發明提供檢測犬貓鉤端螺旋體的螢光定量PCR方法及其引物和檢測試劑盒，其採用16s rRNA基因序列為設計引物，上遊引物5』-ACGAAAGCGTGGGTAGTG-3』；下遊引物5』-GCGGTCTACTTAATCCGT-3』。本發明基於16s rRNA基因建立了鑑定犬貓鉤端螺旋體的SYBR Green I螢光定量PCR方法。在最佳反應條件下反應效率為0.98，獲得的標準曲線相關係數R值達1.000，標準曲線的線性範圍達到1～1×107拷貝8個數量級，最低可檢測到約1個目的拷貝，即1.2fg DNA。本發明建立的SYBR Green I螢光定量方法具有特異性強、靈敏度高、定量範圍廣的特點。
文檔編號C12Q1/68GK101935696SQ20101013808
公開日2011年1月5日 申請日期2010年4月1日 優先權日2010年4月1日
發明者丁鏟, 於聖青, 仇旭升, 宋翠萍, 胡青海, 陳鴻軍, 韓先幹 申請人:中國農業科學院上海獸醫研究所