從血液、血漿和其它液體中除去朊病毒的製作方法

2023-07-27 02:59:26 2

專利名稱：從血液、血漿和其它液體中除去朊病毒的製作方法
技術領域：
本發明總的涉及純化樣品的方法，具體涉及從血液和血液製品裡除去朊病毒的方法。
背景技術：
朊病毒是引起人體和動物體的中樞神經系統海綿狀腦病的感染性病毒。朊病毒不同於細菌、病毒和類病毒。目前的主要假設是朊病毒蛋白的感染不需要，核酸成分。還有感染一類動物(如人)的朊病毒不會感染另一類動物(如小鼠)。
研究朊病毒和由其引起的疾病的主要步驟是發現和純化稱為朊病毒蛋白的蛋白質(″PrP″)[Bolton等，Science 2181309-11(1982)；Prusiner等，Biochemistry 216942-50(1982)；McKinley等，Cell，3557-62(1983)]。完整的朊病毒蛋白—編碼基因已被克隆、測序和在轉基因動物中表達。PrPC由一條單拷貝的宿主基因所編碼[Basler等，Cell，46417-28(1986)]，通常在神經元外表面上發現。主導的假設是朊病毒疾病因PrPC轉化為稱為PrPSc的修飾形式而致。
顯然朊病毒蛋白(PrPSc)的瘋癢病(scrapie)異構形對於動物和人體可傳播的神經退行性疾病的傳播和致病是必需的。參見Prusiner，S.B.，″(朊病毒疾病的分子生物學)Molecular biology of prion disease″，Science2521515-1522(1991)。最常見的動物朊病毒疾病是綿羊和山羊的瘋癢病和牛的海綿狀腦病(BSE)[Wilesmith，J.和Wells，Microbiol.Immunol.17221-38(1991)]。業已鑑定了人的四種朊病毒疾病(1)庫魯病，(2)克羅伊茨費爾特—雅各布症候群克-雅病(CJD)，(3)Gerstmann-Strassler-Scheinker病(GSS)，和(4)致命的家族性失眠(FFI)[Gajdusek，D.C.，Science 197943-960(1977)；Medori等，N.Engl.J.Med.326444-449(1992)]。人體朊病毒疾病作為零星、遺傳和傳染性疾病存在形成了一個難題，業已通過PrP的細胞遺傳起源對此進行了解釋。
大多數CJD病例是個別發生的，但約10-15％作為常染色體顯性疾病而遺傳，由於人體PrP基因突變而引起〔Hsiao等，Neurology 401820-1827(1990)；Goldfarb等，Science 258806-808(1992)；Kitamoto等，Proc.R.Soc.Lond.343391-398]。醫原性CJD由屍體垂體和硬膜移植物的人生長激素所引起[Brown等，Lancet 34024-27(1992)]。儘管人們試圖將CJD與進食諸如瘋癢病感染的羊肉等感染源聯繫起來，但除了醫原性誘發的疾病外迄今沒有證據支持該觀點[Harries-Hones等，J.Neurol.Jeruosurg.Psychiatry 511113-1119(1998)]。另一方面，在Fore和New Guinea高地的鄰近部落橫行幾十年的庫魯病據信是因食人屍儀式期間受感染而傳播的[Alpers，M.P.，(神經系統的慢傳播疾病(Slow transmissible Diseases of theNervous System)，第1卷，S.B.Prusiner和W.J.Hadlow編輯。(紐約Academic Press)，66-90頁(1979)]。
CJD最初傳播到實驗室的靈長類動物有一定的歷史，開始於WilliamHadlow認識到庫魯病和瘋癢病之間的相似性。1959年，Hadlow提出，將從死於庫魯病的病人製備的提取物接種到非人類靈長目動物，在培養一長段時間後觀察到所預見的疾病發生了[Hadlow，W.J.Lancet2289-290(1959)]。7年後，Gajdusek，Gibbs和Alpers證明，在培養18到21個月後，庫魯病傳播給了黑猩猩[Gajdusek等，Nature 209794-796(1966)]。1968年〔Gibbs，Jr.等，Science 161388-389(1968)〕報導了用黑猩猩作的疾病傳播類似實驗提示庫魯病的神經病理學與CJD[Klatzo等，Lab Invest.8799-847(1959)]的相似。在最近25年中，約300例CJD、庫魯病和GSS已傳播給各種猿和猴子。
這類實驗的開支、資金缺乏和非人道性限制了此項工作，因此限制了知識的積累。雖然大多數可靠的傳播數據據說是得自用非人靈長目動物作的研究，一些人體朊病毒疾病已傳播給齧齒動物，但顯然簋少有規律性[Gibbs，Jr.等，神經系統慢傳播疾病(Slow Transmissible Diseases of the NervousSystem)，第2卷，S.B.Prusiner和W.J.Hadlow編輯(紐約AcademicPress)，87-110頁(1979)；Tateishi等，人體和動物的朊病毒疾病(PrionDiseases of Humans and Animals)，Prusiner等編輯(倫敦EllisHorwood)129-134頁(1992)]
Pattison在其研究瘋癢病病因在綿羊和齧齒動物之間傳播的研究中第一次揭示了人體朊病毒疾病不能經常地傳播給齧齒動物，這稱為「種屬屏障」[Pattison，I.H.，NINDB Monograph 2，D.C.Gajdusek，C.J.Gibbs Jr.和M.P.Alpers編輯(華盛頓DC美國政府出版)，pp.249-257(1965)]。在這些研究中，朊病毒從一個種屬到另一個種屬的最初傳播與延長培養時間有關，只有少數動物發病。在同一種屬裡的後代傳播的特徵是在相當短的培養時間後所有的動物都發病。
用轉基因(Tg)小鼠顯示了敘利亞倉鼠(SHa)和小鼠之間的種屬屏障的分子基礎存在於PrP基因序列中[Scott等，Cell 59847-857(1989)]；Locht等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 836372-6376(1986)]。用SHa朊病毒接種時，Tg(SHaPrP)小鼠表達SHaPrP培養時間縮短。當用小鼠表達人或綿羊的PrP轉移基因進行相似的研究時，種屬屏障並沒有消失，即被感染動物的百分率不可接受地低，培養時間不可接受地長。因此，如對於人朊病毒，不可能用轉基因動物(如含另一個種屬的PrP基因的小鼠)來可靠地檢定一個樣品確定其是否被朊病毒感染。下面舉例說明因缺乏這類試驗所導致的危及健康的嚴重性。
以前用人垂體的HGH治療過的45個年輕人產生了CJD〔Koch等，N.Engl.J.Med.313731-733(1985)；Brown等，Lancet34024-27(1992)；Fradkin等，JAMA 265880-884(1991)；Buchanan等，Br.Med.J.302824-828(1991)〕。幸運的是，現在使用重組的HGH，但高水平HGH刺激所致wtPrPc表達的增加看來可能會誘發朊病毒疾病〔Lasmezas等，Biochem.Biophys.Res.Commun1961163-1169(1993)〕。從垂體製備的HGH被朊病毒汙染的事實得到以下實驗的支持將受懷疑的一批HGH給猴子接種，66個月後猴子被傳染了朊病毒疾病[Gibbs，JR.等，N.Engl.J.Med.328358-359(1993)]。與朊病毒疾病有關的長培養時間不能完全揭示幾十年來世界範圍用HGH治療致數千人發生醫原性CJD的程度。四個用汙染的人垂體促性腺激素治療的不育婦女[Healy等，Br.J.Med.307517-518(1993)；Cochius等，Aust.N.Z.J.Med.20592-593(1990)；Cochius等，J.Neurol.Neruosurg.Psychiatry551094-1095(1992)]和至少11個接受硬膜移植物的病人[Nisbet等，J.Am.Med.Assoc.2611118(1989)；Thadani等，J.Neurosurg.69766-769(1988)；Willison等，J.Neurosurg.Psychiatric 54940(1991)；Brown等，Lancet34024-27(1992)]也發生了CJD。這些醫原性CJD病例強調了對可能被朊病毒汙染的藥物進行篩檢的需要。
最近，法國兩個醫生被指控為用屍體提取的生長激素治療過失殺害了一個兒童。該兒童發生了克-雅病。(參見New Scientist，1993，7月31日，p4)。根據巴斯德研究所報導，1989年以來，已有24例CJD報導的病例，患者是年輕人，在1983年和1985年中期之間曾接受人生長激素治療。這些孩子中的15人已經死亡。目前，在法國好像有幾百兒童冒著發生CJD的危險，因用過死屍提取的生長激素治療(參見New Scientist，1993，11月20日，p.10)鑑於此，很清楚需要一種方便、合算的手段除去血液和血製品中引起CJD的朊病毒。本發明提供了這種方法。
發明概述通過使諸如血液和血漿等生物材料與能結合朊病毒的生物製劑(如抗體)或化學試劑(如由磷鎢酸鈉構成的底物)(等複合製劑)接觸而從血液和血漿等生物材料中除去朊病毒。可採用能除去生物材料中任何構型朊病毒的底物，如用絡合劑包被的球形聚合物珠，放置在柱裡，讓血液、血漿或懷疑含有朊病毒的其它材料流過此柱。
本發明的一個實施方案是通過使樣品與由朊病毒絡合劑，如磷鎢酸鈉接觸，使血液中的朊病毒與絡合劑結合而從諸如人血液樣品中除去朊病毒的方法。
本發明的另一個實施方案是一種從液體樣品中除去朊病毒的裝置，該裝置由底物，如用絡合劑包被的聚合物鐵磁珠構成，其中底物優選地位於管狀殼體中，液體樣品則流經其中。
本發明的一個目的是提供一種從材料中除去朊病毒的簡單和經濟的手段。
本發明的一個優點是可能含朊病毒的血製品通過本發明加工後能證明沒有朊病毒。
本發明的一個特徵在於朊病毒與化學試劑，如雜多酸或雜多酸的金屬鹽選擇性地結合。用於本發明方法的優選的化學試劑是磷鎢酸鈉。
本發明的另一個特徵在於朊病毒能選擇性與生物試劑，如肽、小分子和選擇性的PrPSc結合抗體結合。
本發明的一個方面是球形聚合物珠形式、其表面有絡合劑包被的底物。在一個具體的實施方案中，球形珠具有鐵磁金屬核心，用磁場力可使珠子分離，該金屬核心外包惰性聚合物，再用磷鎢酸金屬鹽包被該聚合物。
本發明的另一個方面是已用本發明方法處理的血液和血製品，如血漿。
本發明的再一個方面是採用諸如血液過濾方法從生物材料中除去朊病毒的濾膜。
本發明的一個方面是一種由殼體(優選的是圓柱形殼體)構成的裝置，其表面包被有結合PrPsc的組合物，如用磷鎢酸鈉包被向球形鉛表面。
本技術領域的人員在閱讀了以下對結合劑、裝置和方法的詳細敘述後將會清楚地了解本發明的這些和其它目的、各方面內容、優點和特徵。
優選實施方案的詳述在揭示和描述本發明方法和裝置前，應當明白本發明不限於具體的絡合劑、蛋白質、標記物試驗或方法，它們當然是可以變化的。也應當明白，本文使用的術語僅用於闡述具體的實施方案，並非用於限定，因為本發明的範圍只由權利要求書所限定。
除非另有定義，本文使用的所有技術和科學術語的含義與本發明所屬領域的普通技術人員共同理解的是相同的。雖然可採用與本文描述的相似或等價的方法和材料來實施或檢驗本發明，現僅描述優選的方法和材料。本文提及的所有出版物都納入本文作參考以揭示和描述與引用的出版物有關的方法和/或材料。
本文討論的出版物只是本申請的申請日前公開的內容，在此並非承認本發明依賴於以前的發明。還有，若發現確切的
公開日期不同於本文提供的
公開日期，則可改變為確切的
公開日期。
定義本文使用的術語「絡合劑」是指與蛋白質的緊縮構型(如PrPsc)和/或與蛋白質的鬆弛構型(如PrPc)選擇性結合或絡合的任何材料。該絡合劑可為生物分子，如肽或抗體，如對PrPSc有選擇性的抗體，或化學試劑，如磷鎢酸(PTA)，它可以鹽形式，如磷鎢酸鈉形式加入。絡合劑可單獨使用或聯合使用。例如，生物絡合劑與化學絡合劑可一前一後地使用，如使用肽和化學試劑。在另一個實施例中，可一起使用同類型的兩種絡合劑，如磷鎢酸(和其鹽)和三氯乙酸的混合物，形成的絡合物必須提供將其與其餘組成分離的某種手段，例如絡合劑固定於底物表面時就可實現這種分離。優選的絡合劑與PrPSc結合比與PrPC結合更容易，特別優選的試劑以高親和力與PrPSc結合，而與PrPC沒有明顯的結合。客觀地說，優選的結合劑與PrPSc結合的結合親和力是與PrPC結合的兩倍或以上，更優選的是比與PrPC結合的結合親和力高五倍或以上。
本文使用的術語「蛋白質」意在涵蓋任何胺基酸序列，包括修飾的序列，如糖蛋白。該術語包括天然形成的蛋白質和肽，以及重組或合成的蛋白質和肽。與本發明有關的術語「蛋白質」特別指天然形成的蛋白質，它們有至少兩種不同的構型，其中兩種構型都有相同或基本相同的胺基酸序列，但有兩種或多種不同的三維結構。蛋白質的兩種構型包括至少一種不涉及疾病狀態的構型，和至少一種涉及疾病狀態—致病性的構型。與本說明書相關的具體和優選的蛋白質例子是PrP蛋白，它包括非致病形式，稱為PrPC形式，和與疾病相關的形式，稱為PrPSc。雖然朊病毒蛋白或PrP蛋白的PrPSc形式是感染的且是致病的，但其它蛋白質的致病構型不是感染性的，但是致病性的。本文使用的術語「致病的」表示真正引起疾病的蛋白質，或它只簡單地意味著蛋白質與疾病有關，因此在疾病存在時它是存在的。因此，與說明書中揭示有關的致病蛋白質不一定是蛋白質，它是具體疾病的致病因子(causativeagent)。
術語「PrP蛋白」、「PrP」等在本文可互換地使用，表示已知引起人和動物疾病(海綿狀腦病)的感染顆粒形式PrPSc和非感染形式PrPC，後者在合適的條件下會轉化為感染性PrPSc形式。
術語「朊病毒」、「朊病毒蛋白」和「PrPSc蛋白」等可互換使用，指PrP的感染性PrPSc形式，是「蛋白質」和「感染」二詞的縮合。顆粒主要(若非排他地)由PrP基因編碼的PrPSc分子構成。朊病毒一般是PrPSc的二聚體。朊病毒不同於細菌、病毒和類病毒。已知的朊病毒感染動物引起瘋癢病(一種可傳插的、綿羊和山羊的神經系統退化疾病)，以及牛海綿狀腦病(BSE)，或「狂牛症」，和貓的貓科海綿狀腦病。已知侵染人體的四種朊病毒疾病是(1)庫魯病，(2)Creutzfeldt-Jakob(克雅)病(CJD)，(3)Gerstmann-Straussler-Scheinker病(GSS)，和(4)致命的家族性失眠症(FFI)。本文使用的「朊病毒」包括引起動物(特別是人和家養的農場動物)中所有這些或其它疾病或其中之一的所有形式的朊病毒。
本文使用的術語「PrP基因」用來描述基因材料，所述基因材料表達包括已知多形性和致病性突變的蛋白質。術語「PrP基因」一般指能編碼PrP蛋白質任何形式的任何動物種類的任何基因。Gabriel等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA899097-9101(1992)和美國專利5,565,186；5,763,740；5,792,901；和WO97/04814揭示了一些通常公知的PrP序列，納入本文供參考以揭示和描述這類序列。PrP基因可來自任何動物，包括「宿主」和「試驗」動物和其任何和所有的多形性和變化，據認為，該術語包括尚未被發現的其它PrP基因。由這類基因表達的蛋白質可為PrPC(非致病)或PrPSc(致病)形式。
術語「抗體」代表能與抗原結合的免疫球蛋白。本文的抗體意在包括整個抗體以及能與抗原決定基、感興趣的抗原或抗原片段結合的抗體片段(如F(ab)』，Fab，Fv)。用於本發明試驗的優選抗體是免疫反應活性或免疫特異性的，因此能對感興趣的蛋白，如PrP蛋白，特別是PrPSc蛋白或PrPSc二聚體特異性或選擇性地結合。可使用對兩個天然非致病形式和致病形式(如對天然PrPC和天然PrPSc)具有免疫反應性的和免疫特異性的抗體。PrP抗體優選的是免疫特異性的，如與相關的材料沒有實質性的交叉反應。已發表的PCT申請WO97/10505中揭示了本發明中使用的一些特定抗體，納入本文作參考以揭示和描述這些抗體。該公開的PCT申請相應於美國專利5,846,533(1998，12，8頒布)，也納入本文供參考。術語「抗體」涵蓋所有類型的抗體，如多克隆、單克隆和噬菌體顯示方法產生的那些抗體。本發明特別優選的抗體是對天然PrPC和PrPSc都有相當高親和力的抗體，優選的是與PrPSc的結合親和力更高的抗體。本發明的抗體是本文定義的一種「絡合劑」。
用於結合PrPC的抗體是由雜種瘤(hybridoma)細胞系ATCC HB9222產生的單克隆抗體263K3F4，該雜交病1986年10月8日保藏在美國典型培養物保藏中心(美國MD 20852)，在美國專利4,806,627(1989年2月21日頒布)中有揭示和描述，在此納入本文作參考以揭示與PrPC，但不與PrPSc選擇性結合的抗體。
「純化的抗體」指沒有天然相伴隨的其它蛋白質、碳水化合物和脂質的抗體。這類抗體「優先地」與PrPSc蛋白(或其抗原片段)結合，基本上不識別或不與其它抗原性不相關的分子結合。本發明的純化抗體對其特定種類PrP是優先地免疫反應性的和免疫特異性的，對天然PrPSc更是優先免疫特異性的。
蛋白質的「抗原片段」(如PrP蛋白)指能與抗體結合的這類蛋白的一部分。
「特異性結合」指抗體對特定多肽，如蛋白質(如PrPSc)的抗原決定基，高親合力或/和高親和力結合。抗體對特定多肽上的其抗原決定基的結合，優選的比同一抗體對任何其它抗原決定基，特別是樣品中相關分子或感興趣的特定多肽中存在的其它抗原決定基的結合更強，如與諸如PrPSc的蛋白質的基因決定基片段的結合更強，這樣通過調節結合條件，抗體幾乎是排他地只與所需蛋白的抗原決定基位點或片段，如PrPSc的抗原決定基片段結合。
「可檢測的標記抗體」、「可檢測的標記抗PrP」或「可檢測的標記抗PrP片段」指具有連接的可檢測標記的抗體(或保留結合特異性的抗體片段)。通常通過化學交聯連接可檢測的標記物，但當標記物是多肽時，可另用基因工程技術來連接。製備可檢測標記蛋白的方法是本技術領域公知的。本技術領域已知的可檢測標記物通常是放射性同位素、螢光團、順磁性標記物、酶(如，辣根過氧化酶)，或能發射可檢測信號(如放射活性、螢光、顏色)或該標記物接觸其底物後能發射可檢測信號的其它分子或化合物。各種可檢測標記物/底物對(如辣根過氧化酶/二氨基聯苯胺，生物素/鏈黴視和素，螢光素酶/螢光素)，標記抗體的方法，和使用標記抗體的方法是本技術領域公知的(參見，如Harlow和Lane編輯(抗體實驗室手冊(1988)，Cold Spring HarborLaboratory Press，美國紐約))。銪是特別優選的標記物。
本文使用的縮寫包括CNS中樞神經系統；BSE牛海綿狀腦病；CJD克羅伊茨費爾特—雅各布結合徵(克-雅徵)FFI致命的家族性失眠病；GdnHCl鹽酸胍；GSSGerstamnn-Strassler-Scheinker病；Hu人；HuPrP人朊病毒蛋白；Mo小鼠；MoPrP小鼠朊病毒蛋白；
SHa敘利亞倉鼠；SHaPrP敘利亞倉鼠朊病毒蛋白；PrPSc朊病毒蛋白的瘋癢病異構形式；PrPC朊病毒蛋白的細胞所含的共同正常異構形式；PrPCJDPrP蛋白的CJD異構形式；FVB通常用於產生轉基因小鼠的標準近交系小鼠，因為FVB小鼠的卵相當大，能相當好地耐受外源性DNA的顯微注射；〔PrPβ〕-β-片層構型的朊病毒蛋白的縮寫；〔DRC〕-蛋白質與疾病有關構型的縮寫；PTA-磷鎢酸；NaPTA-磷鎢酸鈉；TCA-三氯乙酸；AC-親和層析發明概述檢測朊病毒的試驗正在發展中，但尚沒有商品化。另外，尚未確定這類試驗(大規模下)的成本、方便性或準確性。因此，當諸如人血漿等材料被懷疑含有朊病毒時，該材料即被銷毀；參見華爾街雜誌，1998，11月25日p.1，文章名為「『Mad Cow』Fears Leads U.K.to Destroy Parts of all DonatedBlood」，它報導英國消毀了其人血漿供給。採取該戲劇性的行動是由於(1)朊病毒可能存在於英國的人血漿中，(2)朊病毒疾病是致命的，目前尚不可治療，(3)目前沒有測定朊病毒的商品化試驗，和(4)目前沒有商品化的從樣品中除去朊病毒的方法。本發明包括了除去朊病毒的一種方法。
一些蛋白質，如由PrP基因表達的蛋白質有一個以上的構型。例如PrP蛋白可假設為其細胞形式，即PrPC形式，或其瘋癢病形式，即PrPSc形式。該蛋白質的一個形式(如PrPC)是無害的，而該蛋白質的另一種形式(如PrPSc)是致病的。該蛋白質的致病形式，如PrPSc在動物中以極小數量存在時，動物不顯示疾病症狀。但是，動物會產生與該蛋白質致病形式相關的疾病—如，產生朊病毒病。為了避免疾病的發展和/或可能的傳播，重要的是從生物性液體，特別是被輸入患者體內的生物性液體(如血製品)中除存在的任何PrPSc。本發明用於(1)從樣品中消除該蛋白質的致病形式，使材料「沒有朊病毒」和/或(2)將材料裡該蛋白質的致病形式的濃度減少到使該材料「無感染性」的水平。
本發明通過使樣品接觸絡合劑，絡合劑與PrPSc結合(優先選擇性結合)來除去PrPSc，使得從生物性樣品中除去朊病毒成為可能。本發明方法特別(但不是排他地)可用來處理全血和/或從全血中除去PrPSc。可通過與固定的絡合劑絡合來除去，即使樣品接觸帶有固定絡合劑的親和柱、膜、濾器或珠。此絡合劑能有效地從樣品中除去PrPSc，而讓樣品保持基本相同的形式，以便合適地使用該樣品，即保持合適的pH，細胞和蛋白質的結構完整性等等。
一般過程任何類型的樣品可用本發明方法來除去其蛋白質的致病形式。雖然本發明可用來除去具有結束的和鬆弛形式的任何蛋白質中的受約束形式，但本發明特別涉及除去PrP蛋白的致病形式，即濃集和除去PrPSc。
待處理的生物性樣品在室溫下(15-30℃)是液體可流動的形式。溶液的pH應為約6.4-8.4，優選的是7.4，應不含過量的鎂或鈣。
下一步驟是本發明方法中最重要的步驟。使樣品接觸一絡合劑，該絡合劑固定於一固體表面，或採取能使結合的朊病毒絡合劑與樣品分開的方式。此絡合劑形成了一種與樣品中存在的該蛋白質的約束形式(一般是致病形式)優先或排他地結合的絡合物。這樣當樣品接觸固定的絡合劑時就能有效地將樣品中存在的PrPSc固定在固體表面。
在一個實施方案中，將諸如雜多酸(如PTA)或優選的其金屬鹽(NaPTA)等化學試劑固定在諸如膜過濾器、磁性珠等的固體表面上。在足以使樣品中所有的PrPSc與PTA絡合的時間裡使樣品與絡合劑接觸。例如，將樣品在約30-45℃(優選約37℃)培養約1-16小時。絡合劑形成了與PrPSc的絡合物。重要的是形成的絡合物可用一些手段，如過濾、使用磁場、沉積等，與樣品的其餘成分分開。
本發明的方法產生了一種生物性樣品，其中PrPSc或其它致病蛋白質基本上從樣品中除去，優選達到用常規手段不可檢測到PrPSc的水平。除去PrPSc方法通過提供沒有感染水平的朊病毒，即「無朊病毒」的生物性樣品來預防PrPSc所介導疾病的傳播。
絡合劑用作本發明絡合劑的化合物包括抗體、酶、肽、化學品、結合分子等。這些絡合劑所應用的方式應能結合朊病毒，並從生物溶液中除去朊病毒，同時保留該生物材料完整性的必要元素，如保留分子形態和蛋白質的完整性。這類絡合劑可用於全血，諸如血漿和血小板的血組分，和本技術領域人員了解的其它生物性液體。
化學試劑在本發明的一個實施方案中，從生物性材料中除去朊病毒的化合物是能沉澱PrPSc的化學試劑。本發明中用作絡合劑的一類優選的化學試劑是雜多酸及其鹽。雜多酸是全部或部分質子化的氧陰離子，具有至少一個中心元素和至少一個配位元素。雜多酸可有Keggin或Dawson結構。
一類特殊的雜多酸是質子化形式的雜多鉬酸鹽。這些陰離子含有2-18個六價的鉬原子圍繞著一個或多個中心原子。約36種不同的元素被確定為這些雜多鉬酸鹽的中心原子。這些陰離子都是高度氧化的。雜多鉬酸鹽的例子包括[PMo12O40]3，[As2Mo18O62]6，和[TeMo6O24]6，其中中心原子是各自是P5+、As5+和Te6+。在Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology第3版，15，688-689(1981)中提供了雜多鉬酸鹽更詳細的討論。
與雜多鉬酸鹽的質子形式類似的另一類雜多酸是雜多鎢酸鹽的質子化形式。在雜多鎢酸鹽中，配位元素是鎢而不是鉬。美國專利4,376,219討論了各種雜多酸的製備，本文納人其全文供參考。這些雜多酸的中心元素可選自P，Si，B，Ge，As，Se，Ti，Zr，Mn，F，V，Ce和Th。這些雜多酸的配位元素包括Mo和/或W。任選的配位元素包括V，Mn，Co，Ni，Cu，Zn，和Fe。配位元素數與中心元素數數目的比為2.5-12，優選9-12。特殊的雜多酸在美國專利4,376,219中有例舉，包括磷鎢酸，矽鎢酸，10-鎢-2-礬磷酸，6-鎢-6-鉬磷酸，磷鉬酸，矽鉬酸，鍺鎢酸，鎢氟酸和18-鎢-2-磷酸及其這些酸的所有或任何一種鹽，如諸如Na，K，Mg和Ca鹽等金屬鹽。用於本發明具體的雜多酸是磷鎢酸，即H3PW12O40和其金屬鹽，特別是Na鹽。這類絡合劑能有效地與PrPSc結合。
這類化學試劑可單獨使用，組合使用或與其它非生物活性的化學品，如緩衝液和惰性結合化學品一起使用。本發明的雜多酸(如PTA)優選的是(雖然不排他)以金屬鹽形式使用。金屬鹽包括，但不限於，鈉，鉀，鈣等。
與支持材料組合的雜多酸或其鹽的存在量應足以從生物性液體中顯著除去PrPSc，優選的量應足以將PrPSc除去到不可檢測水平，或至少非感染水平。雜多酸與支持材料的重量比可為，如約1∶20-1∶1。雜多酸與支持材料的組合採用的方式應使雜多酸充分分散，從而增加雜多酸的有效表面積。將這些組分組合的優選技術是用雜多酸浸漬支持材料。浸漬技術可能涉及將雜多酸水溶液吸入支持材料的多孔區域，然後乾燥，除去水，留下被支持的雜多酸。可用本領域技術人員閱讀了本說明書後能明白的其它固定雜多酸或其鹽的方法來固定這些絡合劑。
生物試劑在另一個實施方案中，絡合劑是蛋白質、肽或其它與PrPSc選擇結合的生物分子。
在一個實施方案中，絡合劑是能與朊病毒選擇性結合的肽類或其它小分子。優選的是，此肽類或小分子優先與PrPSc結合。「優先結合」表示肽類與PrPSc的結合此與生物溶液裡其它蛋白質的結合至少高20倍或更多，優選50倍或更多，更好是100倍或更多，甚至1000倍或更多。本發明的肽優先地與PrPSc的天然形式(與變性形式相反)結合，因為生物性液體一般含有天然形式的PrPSc。正如本技術領域人員可預見地通過設計使肽更易於結合PrPSc而使其與最大程度結合PrPSc。美國專利5,846,533(1998，12月8日頒布)揭示和描示了結合PrPSc的有用的抗體，納入本文以揭示和描述該抗體和製備抗體的方法。與PrPSc結合的這些抗體部分是肽，它們能與支持物表面結合，並用於本發明。
或者，肽類可設計成選擇性地與PrPC結合，或與PrPSc和PrPC都能結合。雖然朊病毒的PrPSc形式是感染性部分，但除去正常細胞朊病毒蛋白也可有效地停止或減緩朊病毒介導疾病的進程。
本發明的絡合劑也可是對朊病毒有選擇性的抗體。該抗體可直接固定或與另一個組分(如高密度金屬)結合。該抗體，如美國專利5,846,533揭示的抗體，可與PrPSc結合。為了除去樣品中存在的PrPC，可使用選擇地或排他地與PrPc結合的抗體。美國專利4,806,627(1989，2月21日頒布)揭示了這類抗體，它揭示由細胞系ATCC HB9222(1986，10月8日保藏)產生的單克隆抗體263K3F4，在此納入本文供參考。產生該抗體的細胞系可從美國典型培養物保藏中心(ATCC，12301 Parklawn Drive，Rockville，MD 20852)獲得。
一般來說，瘋癢病感染不能產生免疫應答，宿主器官對來自同一種屬的PrPSc有耐受性。美國專利5,846,533揭示了與PrPC結合、或與PrPSc結合的抗體。可使用與PrPC結合、與PrPSc不結合的任何抗體，本領域的技術人員可用已知方法來產生這些抗體，如參見美國專利5,223,409裡的製備噬菌體展示抗體文庫的方法。在用大量甲酸或SDS-變性的SHaPrP 27-30免疫後，兔子中出現了多克隆抗-PrP抗體[Bendheim，Barry等，(1984)Nature310418-421；Bode，Pocchiari等(1985).J.Gen Virol 662471-2478；Safar，Ceroni等(1990)Neurology 40513-517]。相似的是，在小鼠中也產生了抗PrP 27-30的少量抗-PrP單克隆抗體[Barry和Prusiner(1986)J.Infect Dis 154518-521；Kascsak，Rubenstein等(1987)J Virol 613688-3693]。這些抗體針對甲酸—或SDS-變性的PrP 27-30而產生，能識別SHa和人的天然的PrPC和處理過的或變性的PrPSc，但與MoPrP不結合。並不奇怪，；圖示這些抗體識別的抗原決定基位於含有SHa-和MoPrP之間不同胺基酸序列的區域中[Rogers，Yehiely等(1993)Proc Natl Acad Sci USA 903182-3186]。
尚不完全清楚為何上述許多類型的抗體會與PrPC和處理過的或變性的PrPSc結合，而不與天然PrPSc結合。不受任何特定的理論所束縛，據信這可能是由於當該蛋白質是PrPC構型時，被暴露的抗原決定基在PrPSc構型中是不暴露的，或隱藏的此時該蛋白質相對不溶，更緊密地摺疊在一起。
本發明中，沒有結合發生表示平衡或親和常數Ka是106升/摩爾或更低。另外，當Ka為107升/摩爾或更高，優選108升/摩爾或更高時，認為有結合存在。結合親和力為107或更高可能是由於存在(1)一種單克隆抗體(即大量的一種抗體)或(2)多種不同的單克隆抗體(如大量五種不同單克隆抗體的每種)或(3)大量多克隆抗體。也可能使用(1)-(3)的組合。當與PrPSc天然構型的結合相比，所選的優選抗體與處理過的或變性的該蛋白質的PrPSc形式的結合是前者的至少四倍。可用幾種不同的抗體，如上述(1)-(3)，得到結合親和力的四倍差異，這類混合物裡的一些抗體可能低於四倍差異。
一種或多種不同的抗體可用於各種不同的方法。本領域技術人員知道，抗體可用已知標記物標記，用於目前可得到的機器人技術，夾心試驗，電子檢測儀，流式細胞計數儀等等。進一步的是，抗體可直接與緻密組分連接或通過其它中間體，如抗—抗體連接。
『純化方法本發明的絡合劑可用於各種純化方法，以從生物材料中有效除去朊病毒。以下綜述了本發明中使用的許多方法。
親和層析親和層析(AC)依賴於朊病毒與固定化配體之間的相互作用。AC部分是依據連接於層析支持物的配體的相互作用。與基質偶聯的疏水性配體本文稱為AC支持物、AC凝膠或AC柱。進一步應當了解蛋白質和AC支持物之間的相互作用強度不僅是蛋白質上非極性與極性表面比例的函數，而且還受非極性表面分布的影響。
許多基質可用於製備AC柱。優選的是，這類基質是珠，更優選球形珠，用作本發明絡合劑的支持表面。作為基質的建議性材料包括瓊脂糖、交聯糊精、多羥基異丁烯酸乙酯、聚丙烯醯胺、纖維素及其衍生物或其組合，優選多孔球形式。乙酸纖維素曾成功地用於純化生物性液體的裝置中，如體外血液純化裝置。聚氨酯與血液特別相容。矽膠和其衍生物也可特別用作與雜多酸一起使用的支持材料。參見美國專利5,475,178和5,366,945，在此納入本文供參考。
用於本發明方法的優選材料是瓊脂糖，一種天然形成的親水性聚合物。通過改變瓊脂糖的百分比可形成空隙率為90-96％的珠狀凝膠。凝膠的分子量範圍是對於10％瓊脂糖為500,000到對於4％瓊脂糖為20,000,000。市售顆粒的粒徑為20-200微米。通過增加瓊脂糖的百分比，或者，使用J.Porath等在Chromat 60，167(1971)中的方法，可用表氯醇或2，3-二溴丙醇交聯珠來增加瓊脂糖珠的機械強度。這可相應增加最大的操作壓力(瓊脂糖增加50％可致最大操作壓力增加2-4倍)。
確定合適偶聯方法的標準是最大程度減少支持物上的絡合劑滲漏，保持化合物的熱穩定性，和維持絡合劑的最適量。該技術還必須不引起支持物材料破壞，或不引起支持物上反應性基團的產生，這些基團可能結合體內血組分。絡合劑還必須在一定時間裡保留其反應性。
在優化親和層析偶聯方法中必須考慮的其它因素是偶聯劑在顆粒和/或柱裡的分布程度；pH；溫度；生物樣品流經柱子的速度；結合的絡合劑的大小；和/或具體支持物的直徑和孔徑。對於某具體方法、生物性樣品和絡合劑應優化這些條件的每個條件，本領域技術人員是懂得的。
本發明的AC組合物可裝在過濾柱體內，以便易在生物性液體純化方法中使用此組合物。當柱組合物裝在一個柱體內時，當該組合物的純化能力耗盡時可容易和方便地更換。或者，此柱體可為一純化裝置裡的一個整合部分，一旦過濾組合物耗盡其效力後可更換整個裝置。將帶有絡合劑的支持物顆粒裝在柱體內，使能與絡合劑反應的溶液通過柱體循環。用於透析、血液交換或氧化的市售單元適合用作純化裝置。
過濾方法可用於從生物樣品中除去朊病毒的另一個方法涉及膜過濾。該膜上可具有朊病毒絡合劑，該絡合劑值接聯接於膜，位於面對生物性液體的一面，或更佳的在離開生物性液體的一面上。或者，絡合劑被劃分到膜後面的區域裡，它不能接近生物性材料的較大組分，如血細胞。在後一的實施例中，絡合劑可與膜後面的不溶性基質結合。用於本發明的膜可以為平面形式、一個或多個空心纖維形式和/或平箔形式。參見美國專利4,361,484，在此納入本文供參考。
膜的合適材料包括再生纖維素、乙酸纖維素、無紡丙烯酸共聚物、聚碸、聚醚碸、聚丙烯腈、聚醯胺等。將生物性活性材料固定在孔中和/或背離生物性液體的一面的膜表面上。因此，可預防諸如紅血球等血組分與該活性材料接觸。膜的孔通常大小為0.01-0.8微米，優選0.15-0.45微米。聚合物支持物必須在其計劃使用的條件下穩定，即，不應被血液中的化學成分或酶成分所降解，支持物和固定絡合劑必須與血液相容，在臨床流動速率範圍150-250毫升/分鐘下，支持物應當有良好的流動特徵和可壓縮性低。
通過微孔膜的上述構建，即非對稱性固定朊病毒絡合劑，生物性液體不需要接觸任何後續的過濾來除去可能遺留的有害殘留物。分離和除去這些物質因此可在一個相同步驟裡完成。
微孔半滲膜可為單纖維形式，成束並並包封入一個相同裝置中，具有生物性液體的入口和出口。纖維末端用合適粘合劑膠合，以使單個纖維在包裝裡基本上平行。纖維或纖維束的一端與入口相連，而相反端與出口相連。
將生物材料通過入口泵入此裝置，通過纖維的縱向空間，通過出口離開此裝置。在該經此裝置時，液體遭遇壓力的變化，這樣只有可滲透組分被迫在每個方向穿過纖維壁流入另一路徑，，與朊病毒絡合材料接觸。實現壓力變化的裝置可由分別與單個纖維之間和纖維束之間的空間相連的膨脹室構成。由於通過液體穿過纖維壁實現了自動過濾，所以生物材料不再需要後續的過濾來除去可能的有害殘留物。
壓力變化可為-200到+200mmHg，優選-100到+100mmHg。例如，若朊病毒絡合劑與膜後的不容性基質結合，血液的擴散距離越長，達到所需分離效果需要的補償壓力變化越高。在一相應的方法中，壓力變化的頻率可變化於0.05-10Hz，優選0.5-1Hz。在通過該處理單位後，生物材料，如全血可直接再輸入人體，或可儲存供將來使用。處理的血液可整體保存，或以其不同的組分，如血漿、血小板、紅血球等進行保存。或者，在除去朊病毒前將血液分離成各個組分。
當絡合劑是抗體時，常常需要一種分子澡隔片段形成將抗體與中空纖維膜多孔外側面的壁隔開的裝置。當抗原的分子量很大，如100,000道爾噸或更大時，這樣的安排是優選的。例如，六個或八個碳的亞甲基能方便地作為抗體和膜表面之間的間隔或「把手」。當抗原很容易地被白蛋白吸附，或比濾膜表面的材料更易於與白蛋白發生化學反應時，間隔分子可為白蛋白芽蛋白質。膜的外表面與內表面相比可考慮採用相對多孔的材料，內表面通常是不對稱類型，有時稱為各向異性類型的超濾膜的有效過濾表面。因此，膜的多孔外側面可用17％人白蛋白鹽水溶液處理。白蛋白將包被在此膜結構的多孔區域(即，襯著膜屏障層的區域)的表面，此後，蛋白質溶液(如PrPSc抗體)可沉積在白蛋白上。通常需要(用稀戊二醛溶液或一些其它這類溫和的交聯誘導劑)稍微交聯蛋白質；這有助於將材料固定在膜表面。
製備能除去血液致病因子的柱體的一種方法是用充分滲透性的纖維膜製作的體外循環系統，它能將血液致病因子通過膜除去，並進入隔離在纖維外空間的溶解的固定抗體。這涉及形成PrPSc抗體和PrPSc的高分子聚合性偶聯物，它們不能穿越膜過濾面進入生物樣品剩餘部分(細胞保留在此)。
為了形成可溶的、固定的絡合劑，免疫反應活性的絡合劑分子量大小可增加到不會從纖維的外部多孔部分擴散並進入待純化的血液中。這可通過使絡合劑與高分子量、水溶性物質，如矽膠或右旋糖進行化學反應，或通過使免疫反應活性絡合劑聚合而達到。由於增加了團塊轉移的極化作用速度和結合動力學，故使用這類帶有大分子的抗體對於抗原的高吸附率是有利的。
或者，此膜可由機械上彼此相同、但化學上可由不同材料構成的兩個半膜構成。在此情況下，若只有朝向生物材料離去的那半膜能與朊病毒絡合劑結合就足夠了。例如，兩個半膜是一種彼此鄰接的關係，其中PrPSc絡合劑優選地結合在孔中和朝向生物材料離去的半膜的兩個表面上。
絡合劑(如NaPTA或抗-PrPSc抗體)也可固定在膜上，這樣朝向生物材料的表面沒有接觸試劑。這避免了紅血球和該試劑之間的接觸，從而避免了熱原反應和/或過敏的反應。因此，這是一種對稱的固定形式，其中在膜的一個表面上(以及在孔中)固定有朊病毒絡合劑。固定在膜的孔中的優點在於與肉眼可見的表面相比，可增加活性顯微表面100倍以上。由於絡合劑固定在朝向生物材料離去的部分膜上，生物材料不能與絡合劑接觸。結果，不需要後續的生物材料分離過濾。
或者，朊病毒絡合劑被結合到膜後面的不溶性基質上。處理的方法很相似，但由於必須的擴散距離長約10倍，可能需要安排更實際的液流流經此膜。
不論朊病毒絡合劑是否固定在孔中或固定在膜後面的不溶性基質上，優選的是固定過程，使朊病毒和絡合劑的絡合物保持被結合和固定，即，在純化技術後不再存在於血液中。一般來說，共價偶聯是最安全的固定。所用的共價偶聯的性質取決於膜材料的選擇和絡合劑的性質。
磁性顆粒也可用由朊病毒絡合劑構成的磁性顆粒除去生物材料中的朊病毒。本發明的磁性顆粒的主要組分是磁芯。芯材由氧化鐵或其它磁性材料的顆粒構成。本發明的PrPSc結合劑可直接摻入磁芯，或如通過使用纖維材料和結合劑間接地摻入磁芯。纖維材料包括纖維形式的有機聚合物，如碳水化合物聚合物、脲甲醛或聚亞壬基脲，以及特別是纖維素纖維。結合劑是一種引入磁芯和纖維線之間的液體或溶液材料，在凍結、聚合或溶劑蒸發期間被固化。合適的結合劑的例子是瓊脂糖、明膠環樹脂或脲甲醛糠基醇。
用於該方法的磁性微粒可為各種形狀，有規則或不規則的，優選的是使微粒的表面積最大的形狀。磁微粒的大小應當能不困難地通過過濾或磁場分離而與溶液分開。另外，磁微粒不應大到使表面積最小或不適合微小規模操作。合適的粒徑約為0.1-100μ的平均直徑。優選的粒徑約為1.0μ的平均直徑。合適的磁微粒可購自PerSeptive Diagnostics，商品名BioMag COOH(分類號8-4125)。
可通過在含在纖維材料、朊病毒絡合劑和結合劑的懸液中攪拌或混合芯顆粒來產生本發明包被的磁顆粒。與芯顆粒和結合劑連接的纖維填滿了空隙。然後用上述的一種方法使結合劑固化，以這種方法朊病毒絡合劑接近外表面。美國專利5,705,628描述了這類系統的一個例子，它使用氧化鐵作為芯顆粒，纖維素纖維作為纖維材料，瓊脂糖作為結合劑，在此納入本文供參考。
在本發明的範圍裡也包括符複合的磁性樹脂，它含有包埋在有機聚合物基質中的磁性顆粒，所述的有機聚合物或含有，或其上連接有對朊病毒有選擇性的位點。
此複合物因此可含有包埋在含有可選擇性吸附朊病毒的活性位點或化學物的聚合樹脂中的磁性顆粒。例如，此聚合樹脂具有其上連接有可選擇性吸附物的小顆粒。選擇性的吸附物可為，如磷鎢酸的金屬鹽。
本發明的複合磁性顆粒可用於除去可流動性生物樣品中的朊病毒的方法。可這樣從人體產物中除去朊病毒使待處理的溶液與帶有固定絡合劑的複合磁性樹脂顆粒接觸，通過磁過濾將溶液與複合磁性樹脂顆粒分開。這些磁性顆粒可使用一次即棄去，或重複用於純化其它血液產品。用合適的再生溶液使分離的複合磁性樹脂顆粒再生，將生溶液與再生的複合磁性樹脂顆粒分開可重複使用這些顆粒。
帶有結合的朊病毒的複合磁性樹脂顆粒然後通過磁過濾，用本領域公知的技術從溶液中選擇性地除去。然後從濾液中回收複合磁性樹脂顆粒，用合適的再生溶液，如酸溶液除去其中的朊病毒。然後通過磁過濾從再生溶液中回收清潔的複合磁性樹脂顆粒，清潔的顆粒重複用於其它用途。
病人的生物材料的純化可通過體外處理單元進行，處理後，可保存純化的液體，或將純化的液體再輸入病人體內。將病人的生物材料泵入一處理單元，該單元含有孔徑為0.01-0.8微米，優選0.15-0.45微米的微孔半透膜。在通過該處理單元期間，生物材料被遭遇壓力的變化(如從-200mmHg到+200mmHg，優選從-100mmHg到+100mmHg)，從而使該生物材料的可滲透組分，如血漿從每個方向穿過膜壁流入另一路徑以接觸絡合劑。
實施例下列實施例旨在完整地揭示和描述，讓本領域的普通技術人員能實施和應用本發明，並非用來限制本發明的範圍，發明者認為他們的發明也並非由下列的實驗(他們曾經做過的所有實驗或僅有的實驗)所代表。發明者已作出努力保證所用數字(如數量、溫度等)的準確性，但也存在著一些實驗偏差。除非另作指出，份數是重量份數，分子量是平均分子重量，溫度是攝氏度，壓力是大氣壓或接近大氣壓。
實施例1在圓柱形金屬層析設備中採用了矽酸鹽衍生物組成的球形珠。在放入層析室前，用PTA浸漬珠來製備親和層析用珠。通過由此開始的溼潤方法，用25重量％H3PW12O40負載來浸漬約5毫米的珠。包被的珠在真空爐裡乾燥以除去過量的水。最後，將這些包被的珠在氮氣中350℃煅燒1小時和空氣中煅燒4小時。
將包被的球形珠冷卻到約27℃，放在層析柱裡，用pH 720mM磷酸鈉液平衡。將人血漿製劑加入混合物中，以足以使朊病毒與固定的PTA結合的速度使其流過柱。然後用Western印跡分析測試等分純化的血漿中朊病毒的存在。
實施例2按照美國專利4,361,484(納入本文供參考)描述的方法來製備胺基取代尼龍膜。將對朊病毒有選擇性的抗體交聯於胺苯取代的膜用於過濾。將α-PrPSc分子的IgG部分用戊二醛固定在膜上。用2.5％戊二醛的pH＝6.8的0.1M磷酸緩衝液處理此膜，用蒸餾水淋洗，乾燥。將含α-PrPSc的溶液溶於0.1mM磷酸緩衝液(pH＝6.0，4℃)中，將該溶液與處理過的膜一起培育。4℃使抗體與膜偶聯15小時。培育後，膜用蒸餾水淋洗，收集未結合的α-PrPSc和第一次淋洗水供後面使用。
帶有結合的α-PrPSc的膜然後用於血液過濾裝置，以除去人血液中的PrPSc蛋白。將α-PrPSc-結合的濾膜放入血液過濾裝置中，如美國專利5858,238、5,855,782和5,851,394所述，每個專利都納入本文供參考。
實施例3純化活體動物血液的一個方法涉及使血液通過體外分流器。用ID為200μl，內壁厚度為30微米的纖維素性中空纖維物建分流器用於該目的。所形成的柱體管內表面總面積為0.6平方米。
用抗-PrPSc抗體的硼酸鹽緩衝液維持pH8.5灌注中空纖維。重複循環三小時後，柱體用鹽水充分洗滌。為了評價纖維壁攝取抗體的程度，用本領域所知的免疫擴散技術，在重複循環步驟之前和之後分析了溶液裡的抗-PrPSc抗體。接著以氮氣流乾燥此柱體，放在塑膠袋子中並密封。
以「逆向」超濾模式，從外面經纖維壁泵入鹽水溶液洗滌含1000根不對稱中空纖維的柱體，所述的中空纖維截留孔徑為500,000道爾噸分子量，內徑為150-200微米。此後，為了將白蛋白的單分子層沉積在管狀膜的外側面的多孔表面上，以相同的方法將1％人血清白蛋白溶液泵入通過纖維壁。此後，使抗-PrPSc抗體溶液以「逆向」方向通過中空纖維壁過濾，讓抗體在膜的外側面或在接近膜的外部區域中直接結合。分析濾過前溶液和過濾離開內腔溶液的抗-PrPSc抗體的活性。其差額為沉積在柱體內的免疫活性抗體的量。用鏈黴素和鹽水衝洗中空纖維內腔後，將柱體放入塑膠袋並密封。這樣製備的柱體可用於體外分流。
實施例4室溫用針對天然PrPSc的單克隆抗體包被含有磁鐵的超順磁聚苯乙烯珠(平均直徑0.8μm，67％磁含量--Sigma Chemical Co.)過夜。將所得的抗體包被珠放入注射器腔體的容器構成的裝置中，該裝置含有支持基質，被螺旋狀纏繞的銅線包圍，通過合適的開關裝置連接合適的交流電。
將10毫升含有朊病毒蛋白的牛血加入珠中，培育10分鐘(在施加磁場存在下)。對線圈施加A/C場(50Hz，50伏)以產生磁場，使磁性珠與血液分開。通過免疫-螢光染色技術，用抗-PrP螢光FITC偶聯物(BradsureBiochemicals Ltd.)檢驗絡合的珠中朊病毒的存在。用該方法檢測的朊病毒絡合物清楚地表明已實現了朊病毒的特異性捕獲。
雖然本發明已參照具體的實施方案作了闡述，但本領域的技術人員應當明白，可進行的各種改變或用等價物替代的不脫離本發明的真正宗旨和範圍。另外，可對本發明的目的、精神和範圍做出許多修改以適合具體的情況、材料、組成、方法、加工步驟。這類修改均在本發明的權利要求的範圍內。
權利要求
1.一種除去樣品中朊病毒的方法，其特徵在於，該方法包括下列步驟使可流動液體狀態的樣品與朊病毒絡合劑構成的固體底物接觸；和讓樣品保持與底物接觸一段時間以使樣品中的朊病毒與該底物結合。
2.根據權利要求1所述的方法，其中絡合劑選自雜多酸或其鹽，磷鎢酸的金屬鹽，肽和抗體。
3.根據權利要求1所述的方法，其中絡合劑是抗體，和選擇性地與PrPsc結合的抗體。
4.根據權利要求1所述的方法，其中樣品包括人體體液。
5.根據權利要求4所述的方法，其中人體體液包括人血液。
6.根據權利要求4所述的方法，其中底物為球形珠形式，由其上包被有聚合物的磁鐵金屬組成，其中絡合劑是磷鎢酸的金屬鹽。
7.根據權利要求6所述的方法，該方法還包括通過施加磁能從與人體體液接觸中取出該底物。
8.一種除去樣品中朊病毒的裝置，其包括水不溶聚合物；和包被在聚合物表面上的朊病毒絡合劑。
9.根據權利要求8所述的裝置，其包括磁鐵金屬，其中聚合物包被在磁鐵金屬上，絡合劑選自磷鎢酸或其鹽，和能與PrPsc結合的抗體。
10.一種沒有朊病毒的液體，其特徵在於使其經過權利要求1所述的方法。
11.根據權利要求10所述的沒有朊病毒的液體，其中該液體的進一步特徵是來自人體。
12.根據權利要求11所述的沒有朊病毒的液體，其中液體是人血液。
13.根據權利要求11所述的沒有朊病毒的液體，其中液體是人血漿。
14.一種用於除去液體樣品中朊病毒的流過裝置，它包括一個供液體樣品流過的殼體；和由朊病毒絡合劑組成的底物表面。
15.根據權利要求14所述的裝置，其中殼體是圓柱形的，底物是其表面包被有磷鎢酸鈉的聚合物珠。
全文摘要
本發明公開了流過柱的裝置,製備球形聚合物珠的底物,和使用這類裝置從液體樣品中除去朊病毒的方法。底物的表面用朊病毒絡合劑,如磷鎢酸的金屬鹽(如鈉鹽)包被。使血液或血漿通過含有用朊病毒絡合劑包被珠的柱後即去除了朊病毒。珠由鐵磁芯組成,有利於從樣品中取出珠。
文檔編號A01N1/02GK1357109SQ99815767
公開日2002年7月3日 申請日期1999年12月17日 優先權日1999年1月20日
發明者S·B·普魯賽納, J·G·薩法 申請人:加利福尼亞大學董事會