可溶的「只有重鏈的」抗體的製作方法

2023-07-25 22:35:51

專利名稱：可溶的「只有重鏈的」抗體的製作方法
技術領域：
本發明涉及用於自轉基因非人哺乳動物分離功能性可溶的只有重鏈的抗體和源自它們的可溶的VH結構域的多樣化庫的改良方法，所述可溶的VH結構域在結構上與源自包含重鏈和輕鏈的抗體的VH結構域不同。優選只有重鏈的抗體和可溶的VH結構域源自長壽命的漿細胞或記憶B細胞。
背景技術：
單克隆抗體或其變體將代表21世紀投產新藥的主要部分。單克隆抗體療法業已被接受為用於治療類風溼性關節炎和克羅恩病的優選途徑，並在治療癌症方面有令人印象深刻的進展。亦在將基於抗體的產品開發用於心血管病和傳染病的治療中。最有市場的單克隆抗體產品識別並結合靶配體(例如TNF α)上的單一的明確表位。抗體結構在本領域眾所周知。大部分天然抗體為四聚體，包含兩條重鏈和兩條輕鏈。重鏈經由位於沿各重鏈的大約一半處的鉸鏈結構域之間的二硫鍵彼此連接在一起。輕鏈在鉸鏈結構域的N-末端側與各重鏈締合。每條輕鏈通常通過靠近鉸鏈結構域的二硫鍵與其各自的重鏈結合。當抗體分子正確摺疊時，每條鏈摺疊為由更線性的多肽序列連接的一些獨特的球狀結構域。例如，輕鏈摺疊為可變(VL)結構域和恆定(CL)結構域。重鏈具有毗連輕鏈可變結構域(VL)的單個可變結構域(VH)、第一恆定結構域(CHl)、鉸鏈結構域和兩個或三個另外的恆定結構域。重鏈可變結構域(VH)和輕鏈可變結構域(VL)的相互作用導致形成抗原結合區(Fv)。重鏈和輕鏈之間的相互作用由重鏈的第一恆定結構域(CHl)和輕鏈恆定結構域 (CL)介導。然而，在重鏈可變結構域(VH)和輕鏈可變結構域(VL)之間亦存在參與重鏈和輕鏈之間的相互作用的界面(interface)。因為可變區具有可變胺基酸序列，所以設計了用於為這些結構域的胺基酸殘基編號的系統。該編號系統參見Kabat等((1991)US Public Health Services, NIH publication 91-3242)，並用於本說明書中。在重鏈可變結構域中，框架1 (FRl)包含殘基1-30，框架2(FR2)包含殘基36-49，框架3 (FR3)包含殘基66-94，框架4 (FR4)包含殘基103-113。同樣在重鏈可變結構域中，互補性決定區(OTR)包含殘基30-35(⑶Rl)、殘基 50-65(CDR2)和 95-102(CDR3)。正常人B細胞含有染色體14上的單個重鏈基因座，通過重排從所述染色體上產生編碼重鏈的基因。在小鼠中，重鏈基因座位於染色體12上。正常重鏈基因座包含多個V基因區段、一些D基因區段和一些J基因區段。大部分VH結構域由V基因區段編碼，但各VH 結構域的C末端由D基因區段和J基因區段編碼。B細胞中VDJ重排接著親和力成熟，為各VH結構域提供其抗原結合特異性。正常四聚體抗體的序列分析證明，多樣性結果主要來自VDJ重排和體細胞高變的組合(Xu和Davies, (2000) Immunity, 13，37-45)。超過50個人V基因區段存在於人基因組中，其中僅39個是功能性的。在正常的二倍體產抗體B細胞中，各細胞自單套重鏈和輕鏈抗體基因座產生四聚體抗體。使用其它套基因座，但因稱作等位基因排斥的過程而是非生產性的(參見Singh等，Q003) J. Exp. Med.，197，743-750 禾口 Immunology 第 5 版，R. Goldsby, T. Kindt, B. Osborne, J. Kuby (2003)W. H. Freeman and Company NY, NY及其中參考文獻)。「記憶」遇到的病原體的能力是高等脊椎動物免疫系統的特色。B細胞對「記憶」的貢獻似乎是兩種獨特的B細胞群，長壽命的漿細胞和記憶B細胞的作用(綜述參見Tangye 和 Tarlinton Q009) Eur. J. Immunol.，(2009) 39，2065-2075)。它們由於幼稚 B 細胞最初的初次免疫應答(抗原攻擊)產生。一種群體由長壽命的漿細胞代表，其為在抗原被清除後長時間(幾個月)繼續分泌高水平中和抗體的B細胞。漿細胞為終末分化的，包含編碼高親和力的抗原特異性抗體的重排親和力成熟免疫球蛋白基因座。它們與僅幾天壽命的短壽命漿細胞形成對照，短壽命漿細胞因大量產生抗原特異性抗體引起的應激而死亡(參見 Radbruch 等 Q006)Nature Reviews Immunology，6，741-750)。與此相反，第二群抗原特異性記憶B細胞代表亦包含編碼高親和力的抗原特異性抗體的重排親和力成熟免疫球蛋白基因座的B細胞群，但其不高水平分泌抗體。記憶B細胞具有在再次發生暴露於初次免疫的抗原後迅速分裂並分化為分泌抗體的漿細胞的能力。這導致快速富集響應特定抗原攻擊可用的抗原特異性免疫球蛋白庫。天花接種的工作證明，記憶B細胞在免疫的個體中在50 年時間期間都有應答(Crotty 等 Q003)J. Immunology，171，4969-4973)。在人中，記憶B細胞在周圍淋巴器官中存活，包含重排的體細胞突變的免疫球蛋白基因，並在再次攻擊時介導再次免疫應答(參見Bernasconi等^00 kience，四8， 2199-220 。人脾臟尤其是記憶細胞的主要位點(綜述參見Tangye和TarlintonQ009) Eur.J. Immunol.，(2009)39，2065-2075)。長壽命的分泌抗體的漿細胞在周圍淋巴器官和骨髓中存活幾個月。例如，抗原選擇的分泌免疫球蛋白的細胞保持在人脾臟和骨髓中(Ellyard等Q004)Blood，103， 3805-3812)。在其它哺乳動物例如小鼠中，初次長期抗體應答似乎是長壽命漿細胞的功能。因而，在小鼠中，存在於骨髓和脾臟中的終末分化的長壽命漿細胞倖存並繼續分泌抗體超過一年的長期時間(參見 Slifka 等(1998) Immunity，8，363-372 ；Maruyama 等 Q000) Nature， 407,636-641)。雖然在不同哺乳動物中記憶細胞和終末分化的長壽命的漿細胞之間的準確關係有待得到確定地證實，但是兩類長壽命的B細胞存在於哺乳動物中，每種都包含編碼高親和力的抗原特異性抗體的重排親和力成熟的免疫球蛋白基因座。一種具有快速分裂的能力。另一種不分裂但保留長期分泌抗體的能力。患者產生的抗原特異性人四聚體抗體提供臨床及市售相關抗原特異性抗體的潛在來源。它們亦可直接源自EBV-轉化的人B細胞，優選源自EBV轉化的人記憶B細胞，任選在多克隆B細胞激活劑存在下轉化(PCT/IB04/01071)。到現在為止，尚未將記憶細胞和長壽命的漿細胞用作轉基因編碼的高親和力抗體的來源，高親和力抗體尤其是人抗體或包含人VH和VL結構域的雜合抗體。VH結構域工程和只有重鏈的抗體在20世紀60年代確定了缺失輕鏈只有重鏈的抗體結合抗原的能力(參見Jaton 等(1968) Biochemistry，7，4185-4195)。物理上與輕鏈分開的重鏈免疫球蛋白相對於四聚體抗體保留80%的抗原結合活性。此外，結合活性與重鏈氨基末端片段(Fd)有關。雖然這些實驗使用明確表徵的抗原特異性的兔多克隆抗體，但它們代表包含哺乳動物(包括人) 來源的四聚體抗體的任何多克隆群。重鏈二聚體保留CHl輕鏈結合結構域。在20世紀80年代，一些出版物闡述了體外操作重鏈基因以構建新型抗體。該項工作的大部分基於重排小鼠抗體μ基因(IgM)，其編碼針對明確表徵的抗原產生的抗體。該抗體的特徵是已經知道其抗原結合特異性位於VH結構域中，因為與不相關輕鏈裝配和分泌顯示保留抗原結合(參見Neuberger 和 WiIliams (1986) Phil. Trans. R. Soc. Lond.，A317， 425-432)。使用該系統，顯示可將小鼠抗原特異性VH結合結構域用於獲得新型抗體，該新型抗體包含與小鼠抗原特異性VH結構域融合的人ε恆定區。所得到的嵌合IgE保留抗原特異性，並顯示IgE的預期效應子活性(參見Neuberger等(198 Nature，314，268-270)。重鏈工程的其它文獻實例包括產生包含與人IgA或IgG恆定區融合的小鼠VH的嵌合小鼠-人抗體(參見 Morrison 等(1984) PNAS，81，6851-6855 ；Sun 等(1987) PNAS，84， 214-218)；和 Heinrich 等(1989) J. Immunol.，143，；3589_97)。因而，到 20 世紀 80 年代末期， 已明確確立了重鏈工程的觀念。可將任何表徵的VH結合結構域與任何抗體恆定區融合， 導致保留抗原特異性結合活性。通過所選擇的重鏈恆定區(例如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、 IgA、IgE等)確定效應子功能。在所有情況中最終表達的嵌合抗體包含四聚體抗體。為了工程改造完整人重鏈，需要明確了結合特異性的人VH結構域來源。該問題部分通過人VH結合結構域陣列文庫的發展解決，該文庫是使用幼稚種系人V、D和J區段的組合或從源自人淋巴細胞的四聚體抗體獲得的親和力成熟的VH結構域而獲得。然後可從獲自產生抗體的人外周血B細胞的mRNA的VH結合結構域展示文庫(參見Ward等(1989) Nature, 341，544-546)，或從獲自幼稚人種系DNA的隨機VDJ陣列(參見EP-A-0368684)，分離結合親和力在20nM-100nM範圍內的抗原特異性VH結構域。這些方法提供抗原特異性哺乳動物VH結構域的來源，特別是人VH結構域的來源。有人提出「分離的可變(VH)結構域可提供單克隆抗體的替代物，並作為構建高親和力人抗體的關鍵起作用」；「通過將可變區與輕鏈恆定區或合適的重鏈恆定區連接並在哺乳動物細胞中表達裝配的基因，可製備完整的抗體，並應該具有天然效應子功能，例如補體溶解(complement lysis) 」 ；和「該方法可證明對構建治療價值的人抗體有用」(參見Ward等(1989) Nature，341， 544-546 和 EP-A-0368684)。使用備選方法Sitia等((1990)Cell，60，781-790)證明，除去重排小鼠μ基因的 CHl結構域，導致培養物中的哺乳動物細胞合成並分泌缺失輕鏈只有重鏈的抗體。在這種情況下，分泌的重鏈包含VH結合結構域和由柔性鉸鏈結構域和IgM CH2、CH3和CH4恆定結構域組成、提供重鏈二聚化和效應子功能的恆定區。因而，到1990年，可獲得基本工具用於體外工程改造具有確定的VH結合特異性和選擇缺失CHl的重鏈效應子區的人只有重鏈的抗體同源二聚體(有時闡述為Dabs-Fc)。該方法的問題有兩個由陣列方法選擇的VH結構域具有相對低的(20-100nM)抗原結合親和力；和不存在輕鏈時VH結構域為「粘的」、不可溶，並傾向於聚集，因此不適合藥物應用。
分離的VH結構域聚集的傾向是由於不存在輕鏈。當輕鏈不存在時，正常埋在重鏈 /輕鏈界面內的某些疏水側鏈暴露。而且，熱力學穩定性受到損害，因為VH結構域穩定性取決於在輕鏈界面處的接觸(參見 Worn 和 Pluckthun (1999) Biochemistry，38，8739-8750)。Hamers-Casterman描述除了正常的駱駝科(camelid)四聚體抗體外，在駱駝科中循環天然存在的缺失輕鏈的只有重鏈的IgG同源二聚體抗體(參見Hamers-Casterman等 (1993)Nature，363，446-448)，這提供對溶解性問題的洞悉。與由Sitia等((1990)Cell, 60，781-790)工程改造的分子一致，由於可變剪接位點從加工的抗體重鏈mRNA除去CH1，故在只有重鏈的駱駝科抗體中不存在CHl結構域的功能性。通過抗原攻擊獲得的只有重鏈的駱駝科抗體VH結構域(下文中按照通常用法稱為VHH結構域)，在B細胞中體內親和力成熟，具有低納摩爾範圍的結合親和力，可溶，且不傾向於聚集(參見Ewert等(2002) Biochemistry，41，3628-3636)。相對於由展示方法分離的種系來源的VH結構域，駱駝科VHH結構域通常亦顯示提高熱穩定性，且某些在變性劑例如去汙劑及漂白劑存在下並在熱處理後保留結合活性(參見Dumoulin等Q002) Protein Science,11,500-511 禾口 Dolk 等(2005)Applied Environmental Microbiology, 71,442-450)。可通過標準克隆技術或通過噬菌體展示或其它展示技術，從駱駝科B細胞mRNA 重新獲得只有重鏈的抗原特異性抗體(參見Riechmann和Muyldermans (1999) J. Immunol. Methods, 231, 25-38)。源自駱駝科的只有重鏈的抗體具有高親和力。編碼只有重鏈的抗體的mRNA的序列分析證明，多樣性主要是由於VHHDJ重排和體細胞高變的組合，其如在產生正常四聚體抗體中亦觀察到的。然而，仍然有待確定的是，與四聚體抗體相對比，駱駝科產生只有重鏈的抗體是否是通過正常B細胞。實際上，幾乎不知道駱駝科中的前B細胞發育 (參見 W02004/049794 和 hu 等 ^00 J. Immunology, 175，3769-3779)。而且，仍然有待確定的是，只有重鏈的駱駝科抗體是否與包含重鏈和輕鏈的免疫球蛋白一樣，經由記憶細胞或長壽命的漿細胞參與長期抗體應答。只有重鏈的駱駝科抗體的特定特徵是，在正常VH結構域中與VL結構域作用相互作用的某些胺基酸殘基在VHH結構域中發生突變。因而，在98%人和鼠VH序列中存在於 45位的亮氨酸已突變。已有人提出，在種系中保守的這些駱駝科突變，與不存在輕鏈時保持 VHH溶解性一致。亦闡述了與正常VH結構域相比的駱駝科VHH結構域中的其它特徵胺基酸突變。其中最為常見和重要的變化發生在第二框架區的4個位置(VHH四聯體)，並起降低以前輕鏈界面的疏水性的作用。通常在正常VH結構域中存在的親水性較弱的Gly-44和 Leu-45的位置發現Glu-44和Arg-45，同時通過用較小的殘基取代Trp提高了 47位的親水性。第四個變化需要由Phe或Tyr取代Val-37。結構分析顯示，這形成了通常包含Tyr_91、 Trp-103、Arg-45和存在於VHH結構域⑶R3環中的疏水殘基的小疏水核心。這些改變通過用更親水的側鏈直接取代，或通過由CDR3和框架殘基之間的相互作用將疏水側鏈與溶劑隔絕來增加以前輕鏈界面的親水性(參見Bond等(2003) J. Mol. Biol.，332，643-655)。相對於駱駝科四聚體抗體和來自人及小鼠的其它明確特徵的四聚體抗體上存在的CDR3環，VHH結構域中的CDR3環擴大(參見Riechmann和Muyldermans (1999) J. Immunol. Methods，231，25-38)。存在於 VHH CDR3 環(例如大羊馬它(llama) VHH 結構域中) 的關鍵疏水殘基的作用，證明了 CDR3在VHH結構域的穩定性和溶解性中的結構作用(參見Bond等Q003)J.Mol.Biol.，332，643-655)。關於VHH結構域的結構研究全體證明，這些結構域的穩定性和溶解性除了取決於框架氨基外，還取決於CDR3，並且相對於VH結構域，對關鍵疏水殘基的要求對與VHH結構域的有利生物物理學特徵適合的CDR3環類型提出顯著限制(參見 Barthelemy 等(2008) J. Biol. Chem.，283，3639-3654)。然而，儘管在駱駝科和人之間序列高度保守，但駱駝科VHH結構域仍然為駱駝科來源，因此在人中潛在具有抗原性。體外人源化可減少這種風險，但由於所涉及的體外工程改造而以潛在降低親和力和溶解性為代價。人VH結合結構域和溶解件問題從種系序列或從相對於駱駝科VHH結構域為正常的四聚體抗體獲得的人和其它哺乳動物VH結構域的差生物物理學特性，尤其是聚集的傾向，目前限制了其作為試劑、診斷試劑及作為藥物的效用(參見 Rosenberg(2006) The AAPS Journal, 8 (3), Article 59 E501-E507 和 Fahrner 等 Q001) Biotechnol. Gen. Eng. Rev.，18，301-327)。解決溶解性問題的最初嘗試依賴於將駱駝源化胺基酸序列在VH/VL界面引入所選擇的人VH結合區。已證明該方法令人失望，因為通過僅VH/VL界面的45位「駱駝源化」不能解決穩定性和溶解性(參見Domantis 2007年5月18日及2007年6月5日的反對EP-B-0656946的提交意見)。事實上，引入靶向的「駱駝源化」突變不足以解決分離人 VH 結構域中的「粘性」問題(參見 Riechmann 和 Muyldermans (19^)J. Immunol. Methods, 231，25-38)。引入駱駝源化突變導致框架摺疊變形，這可能是造成這些實驗結果觀察的蛋白質穩定性降低的原因(參見Riechmann (1996) J. Mol. Biol.，259，957-969)。此外， 包含關鍵疏水殘基的CDR3在維持不存在輕鏈的VHH結構域的結構穩定性和溶解性中的作用增加了複雜性，這可能將⑶R3多樣性限制於與駱駝科框架適合的那些⑶R3序列(參見 Barthelemy 等(2008)J. Biol. Chem.，283，3639-3654)。因而，在缺失輕鏈時，從親和力成熟的天然四聚體抗體或從幼稚種系VDJ區段的陣列獲得的哺乳動物VH結構域(包括來自人的)相對不可溶，並傾向於聚集。這樣的VH 結構域缺少適合用作藥物的可溶的VH結構域必需的生物物理學特性。通過轉基因體內產生的只有重鏈的抗體和可溶的人VH結構域對於藥物應用，可溶的VH結合結構域應優選人來源，在生理條件下不存在聚集時具有例如高抗原結合親和力和溶解性等特徵。亦可將這樣的可溶的VH結合結構域用作診斷試劑和試劑，並在工業和農業中有廣泛應用。用於產生抗原特異的只有重鏈的抗體的備選方法是，利用包含缺少CHl功能性的重鏈基因座的轉基因小鼠(參見Janssens等Q006) PNAS，103 :15130-5和W002/085944)。開始時，不知道正常鼠B細胞是否被激活和由於抗原攻擊而分泌只有重鏈的抗體，或這樣的抗體是否將證實是可溶的。而且，不知道是否如同在駱駝科中需要IgM，是否表達限於Ig Y 2和Ig γ 3類抗體，或甚至不知道潛在不溶的VH結構域是否能由正常鼠B細胞分泌。Janssens等G2006)PNAS，103 :15130-5)闡述了包含以下的嵌合重鏈基因基因座兩種大羊駝VHH基因區段、全部人D和J基因區段和編碼人C μ和C γ 2和C γ 3恆定區的基因區段的組合，它們全部缺少CHl功能性。選擇大羊駝VHH基因區段確保了，維持在駱駝科中的VH/VL界面處的種系框架突變亦存在於表達的駱駝源化人基因座中，以便提高得到的「駱駝源化"VH結構域可保留由駱駝科VHH表現的溶解性和穩定性特性的可能性，從而提高甚至是在源自駱駝科的CDR3環不存在時對抗原攻擊的功能響應的可能性。結果證明，只有重鏈的抗體轉基因以B細胞特異性方式表達，發生B細胞擴增，且不存在CHl功能性時，存在任何功能輕鏈基因是不相關的。只有重鏈的轉基因響應抗原攻擊而經歷VDJ重排，接著B細胞激活和親和力成熟。只有重鏈的IgM和IgG之間亦發生類轉換，如同Cy同種型轉換。在基因座不存在Cy時，同等良好地使用CY。抗體的特異性主要由VDJ(⑶舊)重排決定，而體細胞突變分析顯示，這些發生在整個VH區，且優選在表達的大羊駝VHH基因區段的CDRl和CDR2區。在所表徵的有限數量的駱駝源化的人只有重鏈的抗體中，全部證明為可溶，而不管其為通過VH結構域的噬菌體展示還是通過雜交瘤選擇從脾B細胞獲得，但是事實上完全從人序列獲得的CDR3環比在駱駝科VHH結構域中發現的小。該有限系列的最佳大羊駝/人雜合只有重鏈的抗體具有1-3ηΜ範圍的親和力。 小鼠亦將轉基因作為另一重鏈基因座，因為在即使輕鏈重排不存在時B細胞擴增和脾構造也基本上正常(參見Janssens等(2006)PNAS，103 :15130-5)。此外，等位基因排斥機制決定是內源小鼠重鏈基因座還是缺少CHl功能性的重鏈轉基因生產性表達(參見 W02007/09677)。Janssens等((2006)PNAS，103 =15130-5)的觀察結果令人驚訝地證明，即使在包含駱駝科序列的CDR3環不存在時可使用駱駝科框架獲得穩定可溶的駱駝源化的只有重鏈的抗體。作為這些實驗的延伸(參見W02006/008M8)，構建了另外的轉基因小鼠品系，其包含完整的人只有重鏈的基因座，因此缺少編碼駱駝科VHH框架的序列，並另外包含自非駱駝科序列獲得的⑶R3環。在該方法中，引進了四種天然人種系VH基因區段(V4天然基因座)，因此完全依賴通過用於產生所得到的可溶的人VH結構域的抗原特異性和結構穩定性的親和力成熟進行的天然選擇。兩種基因座都包含所有人D和J基因區段、人C γ 2和C γ 3恆定區基因區段 (各缺少CHl)、人免疫球蛋白增強子調節元件和優選抗體重鏈LCR。人V4基因座是功能性的，而人只有重鏈的抗體在未受攻擊的動物的血漿中循環。在抗原攻擊後，用常規Elisa測定檢測到抗原特異性人抗體。包含工程改造的V基因區段(V17基因座)(亦參見W02008/035216)的人基因座亦是功能性的(亦參見The Antibody Engineering and Antibody Therapeutics Meeting (抗體工禾呈禾口抗體治療會議)· F. Grosveld 陳述，San Diego Antibody Meeting (聖地牙哥抗體會議)，2007 年 I2 月 3-4 日)。而且，令人驚訝地，包含V4基因座的轉基因小鼠的抗原攻擊，使得在不存在駱駝科種系特徵框架突變和駱駝科VHH結構域特有的駱駝科樣CDR3環時，能夠分離並表徵可溶的抗原特異的高親和力人VH結構域。此外，從抗原特異性人只有重鏈的抗體獲得的VH結構域為可溶的(參見W02006/008M8)。在抗原攻擊、VDJ重排和隨後的B細胞擴增之後， 在包含人V4基因座的小鼠中的脾構造與響應抗原攻擊的野生型小鼠的免疫球蛋白基本類似。光學顯微鏡檢查顯示，由含有濾泡的富含B細胞區域和存在於白髓外邊界處的邊緣區包圍的微動脈周圍淋巴細胞鞘(PALS)中的T細胞聚集的分離。在T細胞依賴性抗體應答期間，在可與野生型小鼠比較的周圍淋巴組織的B細胞濾泡中亦存在與生發中心相似的結構。鑑定和工程改造合成人VH結構域的備選展示方法(其不依賴對天然駱駝科VHH 結構域序列的預測性分析)亦證明，用與在駱駝科中發現的不同的非天然突變，可獲得具有超出天然框架範圍的結構特性的自主VH結構域(參見Barthelemy等Q008) J.Biol. Chem.，283，3639-36 和美國專利申請號11/102,502)。然而，該資料未顯示這樣的VH結構域在生理條件下不存在聚集時是否保留溶解性的生物物理學特性連同低納摩爾範圍的結合親和力。用於通過展示鑑定和工程改造合成人VH結構域的方法雖然精緻，但是費力，並將範圍限制於人VH結構域和駱駝科VHH三維結構信息的可用性。微小的差異視VDJ組合而定將變得明顯，這將限制對合成的具不受結構需求約束的CDR3多樣性的基於陣列的VH文庫的開發，所述VH文庫保留高親和力抗原結合。雖然結果證明，與駱駝科VHH結構域形成對比，人VH結構域的可溶穩定構象不取決於CDR3環和在以前輕鏈界面處的駱駝科特徵胺基酸取代之間的相互作用，但是該數據限於生物物理學特性。例如，尚未顧及在這些變化情景中高親和力抗原結合的維持。本發明本發明闡述非常適合用作藥物的新的可溶的高親和力的只有重鏈的抗體和結構上與源自正常四聚體抗體或種系陣列的VH結構域不同的可溶的VH結構域，以及用於從抗原攻擊後的轉基因動物分離所述新的只有重鏈的抗體和可溶的VH結構域的優選途徑。因此，本發明第一方面提供新的高親和力的抗原特異性的可溶的只有重鏈的抗體，所述抗體缺少特徵駱駝科相關胺基酸取代並具有未在正常四聚體抗體中發現的FR2取代；顯示CDRl內的淨疏水性提高和CDR3中存在的荷電胺基酸數目增加；和包含導致FRl內的淨疏水性提高和FR3中存在的荷電胺基酸數目增加的框架β 摺疊內的一個或多個胺基酸取代。只有重鏈的抗體優選為人抗體。人只有重鏈的抗體缺少特徵駱駝科相關胺基酸取代並具有未在正常人四聚體抗體中發現的FR2取代。只有重鏈的抗體優選具有IOnM或更好的結合親和力，並在生理緩衝條件下作為凝膠過濾時的可溶性單體。本發明亦提供高親和力的抗原特異性的可溶的VH結構域，所述VH結構域缺少特徵駱駝科相關胺基酸取代和具有未在正常四聚體抗體中發現的FR2取代；顯示CDRl內的淨疏水性提高和CDR3中存在的荷電胺基酸數目增加；和包含導致提高FRl內的疏水性並增加FR3中存在的荷電胺基酸數目的框架β摺疊內的一個或多個胺基酸取代。可溶的VH結構域優選為人來源。可溶性人VH結構域缺少特徵駱駝科相關胺基酸取代並具有未在正常人四聚體抗體中發現的FR2取代。可溶的VH結構域優選具有IOnM或更好的結合親和力，並在生理緩衝條件下作為凝膠過濾時的可溶性單體。本發明進一步提供V基因區段，當與D基因區段和J基因區段重組並隨後經歷親和力成熟時，所述V基因區段編碼本發明的可溶的VH結構域。任選地，可相對於V基因區段的天然種系序列，通過至少一個取代、插入或缺失或其組合對V基因區段序列進行工程改造，使得其包含編碼胺基酸殘基或胺基酸序列的密碼子，所述胺基酸殘基或胺基酸序列不同於宿主動物種系序列，不是特徵駱駝科相關胺基酸取代，並可以為通常未在正常四聚體抗體中發現的FR2取代。所述變化可包含V基因區段的CDRl和/或CDR2區內的取代、插入或缺失或其組合，以便相對於種系序列增加可供抗原結合利用的胺基酸的多樣性。本發明進一步提供D基因區段，當與本發明的V基因區段和J基因區段重組時，所述D基因區段編碼本發明的VH結構域。任選地，可相對於D基因區段的天然種系序列，通過至少一個取代、插入或缺失或其組合對D基因區段序列進行工程改造。所述取代、插入或缺失或其組合，使得D基因區段可包含編碼胺基酸殘基的密碼子，所述胺基酸殘基業已確定有助於維持可溶的VH結構域 (包含由D基因區段編碼的序列)的溶解性和穩定性，或備選地可相對於種系序列在任何得到的CDR3環中提高D基因區段的多樣性。本發明還進一步提供J基因區段，當與本發明的V基因區段和D基因區段重組時， 所述J基因區段編碼本發明的可溶的VH結構域。任選地，可相對於J基因區段的天然種系序列，通過至少一個取代、插入或缺失或其組合對J基因區段序列進行工程改造。所述取代、插入或缺失或其組合，使得J基因區段可包含編碼胺基酸殘基的密碼子，所述胺基酸殘基業已確定有助於維持VH結構域(包含由J基因區段編碼的序列)的溶解性和穩定性，或備選地可相對於種系序列在任何得到的 CDR3環中提高J基因區段的多樣性。本發明優選提供異源只有重鏈的基因座，所述基因座包含一個或多個本發明的V 基因區段、一個或多個本發明D基因區段、一個或多個本發明J基因區段和各自編碼缺少 CHl功能性的抗體恆定效應子區的一個或多個恆定效應子區基因區段，其中排列所述基因區段，使得V、D和J基因區段和恆定區基因區段可重組，以產生編碼本發明的高親和力的抗原特異性的可溶的只有重鏈的抗體的重排基因。只有重鏈的基因座具有脊椎動物重鏈恆定效應子區，其優選為哺乳動物來源，更優選源自人、小鼠、大鼠或駱駝科。優選地，排列重鏈基因座，以產生包含可溶的人VH結構域和哺乳動物來源的恆定效應子區的只有重鏈的抗體。本發明還進一步提供包含本發明異源重鏈基因座的轉基因非人哺乳動物。優選哺乳動物為齧齒動物，最優選小鼠或大鼠。優選轉基因非人哺乳動物的內源重鏈基因座的功能已通過本領域已知的任何方法損害，或通過缺失沉默(參見US 5, 591,669 ；US 6, 162, 963 ；US5, 877, 397 ；Kitamura 和 Rajewsky(1992)Nature,3 月 12 日；356(6365) 154-6) 0備選地，可除去(ablate)表達與轉基因相對比的內源免疫球蛋白基因的B細胞。 內源κ和λ輕鏈基因可保留功能性，或任選可在功能上沉默或缺失(ΕΡ139959)。不太優選地，在缺失內源重鏈或輕鏈基因功能性的宿主背景中，轉基因可為包含CHl功能性的正常重鏈抗體基因座(參見 ΕΡ139959 和 hu 等 J. Exp. Med.，204，3271-3283)。只有重鏈的免疫球蛋白轉基因亦可包含內源重鏈免疫球蛋白基因座，該內源重鏈免疫球蛋白基因座業已經工程改造以消除CHl功能性，並任選進一步經工程改造以引入或替代一個或多個具有備選V、D和J基因區段的內源V、D和J基因區段(優選為人來源)。在另一方面，本發明提供用於生產高親和力的抗原特異性的可溶的只有重鏈的抗體的方法，所述方法包括用抗原攻擊本發明的轉基因非人哺乳動物。優選可溶的只有重鏈的抗體為人抗體。優選所述方法包括使來自哺乳動物的產抗體細胞無限增殖化的步驟。可通過與骨髓瘤細胞融合來使細胞無限增殖化，或可通過用病毒例如EBV轉化來使細胞無限增殖化。優選所述方法進一步包括從產生所需抗原特異性的只有重鏈的抗體的B細胞或無限增殖化細胞系分離可溶的VH結構域或編碼可溶的VH結構域的核酸的步驟。備選地，所述方法可進一步包括步驟從哺乳動物產生的產生只有重鏈的抗體的細胞，或從哺乳動物產生的通過展示方法產生只有重鏈的抗體的無限增殖化細胞，分離可溶的VH結構域或編碼可溶的VH結構域的核酸。本發明亦提供通過本發明方法獲得的可溶的VH結構域或編碼可溶的VH結構域的核酸，在製備只有重鏈的抗體、VH胞內抗體、VH多蛋白、VH結構域複合體或VH融合體中的用途。本發明進一步提供包含至少一種本發明的可溶的VH結構域的只有重鏈的抗體、 VH胞內抗體、VH多蛋白、VH結構域複合體或VH融合體。本發明還進一步提供用於治療的包含至少一種本發明的可溶的VH結構域的只有重鏈的抗體、VH胞內抗體、VH多蛋白、VH結構域複合體或VH融合體。本發明亦提供包含至少一種本發明的可溶的VH結構域的只有重鏈的抗體、VH胞內抗體、VH多蛋白、VH結構域複合體或VH融合體，在製備用於治療包括但不限於以下疾病或病症及用於免疫治療的藥物中的用途傷口癒合；細胞增殖病，包括瘤、黑色素瘤、肺瘤、 結直腸瘤、骨肉瘤、直腸瘤、卵巢瘤、肉瘤、子宮頸瘤、食管瘤、乳腺瘤、胰腺瘤、膀胱瘤、頭頸瘤和其它實體瘤；骨髓增殖病，例如白血病、非霍奇金氏淋巴瘤、白細胞減少症、血小板減少症、血管發生疾病、卡波西肉瘤；自身免疫性/炎性疾病，包括變態反應、炎性腸病、關節炎、 牛皮癬和呼吸道炎症、哮喘、免疫病和器官移植排斥；心血管病和血管病，包括高血壓、水腫、咽峽炎、動脈粥樣硬化、血栓症、膿毒、休克、再灌注損傷和缺血；神經學疾病，包括中樞神經系統病、阿爾茨海默病、腦損傷、肌萎縮性側索硬化和疼痛；發育病；代謝病，包括糖尿病、骨質疏鬆症和肥胖、AIDS和腎病；感染，包括病毒感染、細菌感染、真菌感染和寄生蟲感染、與胎盤有關的病理學病症和其它病理學病症。本發明再進一步提供用於製備本發明的可溶的VH結構域的盒，所述盒包含編碼 FRU FR2和FR3的基因序列，其中編碼FRl和FR2和FR2和FR3的基因序列由使能夠引入合適的CDRl-編碼序列和CDR2-編碼序列的序列隔開，且在編碼FR3的序列的3』端存在使能夠引入編碼合適CDR3-編碼序列的序列的序列。本發明利用非人轉基因哺乳動物(優選小鼠或大鼠)中的天然哺乳動物B細胞機制來響應抗原攻擊產生新的高親和力的可溶的只有重鏈的抗體。本發明可溶的只有重鏈的抗體具有IOnmol或更好的結合親和力。自抗原特異性的高親和力的缺失輕鏈的人只有重鏈的抗體獲得的可溶的人VH結合結構域的序列分析意想不到地顯示，不存在駱駝科VHH結構域特有的所有胺基酸特徵共有序列。事實上，天然選擇不由於親和力成熟而通過選擇駱駝科樣特徵序列來補償。因此， 當種系中不存在駱駝科特徵序列時，補償不存在輕鏈的不同機制起作用，以便維持人VH結構域的結構穩定性和溶解性。最意想不到的特徵是，不僅抗原特異性的高親和力的人缺失輕鏈只有重鏈的抗體可溶，而且抗原結合區(CDR)除了抗原結合外，還應該在結構穩定性和溶解性方面起作用， 以及在以前輕鏈界面處補償不存在輕鏈的特徵駱駝科VHH種系編碼的框架共有胺基酸取代，不僅在轉基因的只有重鏈的基因座中不存在，而且在天然選擇加工期間不因親和力成熟而被插入來補償溶解性。在轉基因編碼的可溶的人VH結構域中，備選胺基酸取代可在親和力成熟後發生在所有三個框架區內。框架突變主要但排它地位於以前輕鏈界面處的β 摺疊內，從而補償不存在輕鏈。在存在和不存在輕鏈時獲得的人抗原結合VH結構域的框架區和CDR區的淨電荷和疏水性的比較分析揭示不存在輕鏈時的顯著變化。在不存在輕鏈時，提高了存在於CDRl 中的胺基酸的淨疏水性，並增加了存在於CDR3中的荷電胺基酸。框架β摺疊內的胺基酸取代導致降低總體疏水性，並增加框架3中存在的荷電胺基酸。框架1中的荷電胺基酸數和疏水性有提高，而框架2中的疏水性有小的降低。這是與駱駝科例如大羊駝的VHH結構域形成某種程度的對比，其中比較分析顯示特徵與不存在輕鏈的人VH結構域共同，但亦有差別。在駱駝科例如大羊駝中，框架2的淨疏水性顯著降低，這與通過在以前輕鏈界面處的特徵胺基酸取代引入提高的親水性一致，以及CDR3中的淨電荷增加。因而，抗原攻擊後，即使是當種系中不存在必需胺基酸取代時，B細胞也補償輕鏈的不存在，如在駱駝科科動物例如大羊駝和相關物種中所發現。在不存在補償不存在的輕鏈的種系序列時，體內存在不同的解決方法，所有方法都導致在不存在輕鏈時產生高親和力的穩定可溶的只有重鏈的抗體和可溶的VH結構域。這些觀察結果與抗原結合區(OTR)除抗原結合外在穩定VH結構域中的主要作用一致。這通過隨後框架內尤其是在β摺疊內以前輕鏈界面處的罕見或新的胺基酸取代來補充。在通過轉基因方法體內獲得的非駱駝科來源的可溶的VH結構域中，不存在對VHH溶解性和穩定性重要的特徵駱駝科胺基酸取代。包含這些特徵的非駱駝科抗原特異性的只有重鏈的抗體為可溶的，並在正常生理條件下不聚集。此外，自這些抗體分離的可溶的VH結構域保留VH結構域穩定性和溶解性的有利特徵。這些只有重鏈的抗體和自其獲得的可溶的VH結構域在抗原攻擊後以B細胞特異性方式通過天然選擇機制演變。自相同的VDJ重排獲得的高親和力抗體(IOnrn或更好)， 通常包含比在較低親和力的只有重鏈的抗體中觀察到的更多的框架取代。因而，抗原結合結構域(CDR)和β -摺疊框架，有助於這些缺失輕鏈只有重鏈的抗體或自其獲得的可溶的VH結構域的總體穩定性、溶解性和結合親和力。穩定的高親和力的抗原特異性的可溶的VH結合結構域的序列分析確定抗原結合區(CDR)內的選擇和親和力成熟與總體增加的疏水性和電荷一致，這產生抗原結合的特異性和親和力及結構穩定性；存在於以前的輕鏈界面周圍的框架2和3中的突變與改進的VH結構域溶解性和穩定以及因此改進的抗原結合親和力一致；框架1和3中的突變與提高VH結構域的總體穩定性的補償性結構突變一致。
因而，在不存在抗體輕鏈時，哺乳動物B細胞可通過親和力成熟和選擇重鏈VH結合結構域固有的不穩定性及不可溶性同時保留抗原結合親和力來補償。我們的分析顯示，天然機制似乎與所用的V基因區段無關地起作用。因而，在不存在輕鏈時在人V4轉基因小鼠脾中產生的人VH結構域的大量序列分析使得能夠進行突變頻率的可比較分析。在CDRl和CDR2內觀察到最大的突變負荷。然而，在框架1、框架2和大部分框架3內可辨明突變負荷熱點。出現的總體圖式似乎對所用的特定V基因區段並不罕見，因為在該系列實驗中，已用具有突變負荷出現相似圖式的V3-23、V3-11和V1-46獲得高親和力抗體。類似地，在CDR3中，J4佔優勢，但並未排它使用。似乎B細胞親和力成熟機制在不存在輕鏈時加工和分泌可溶的VH結構域中具有多種作用。CDR內的高變主要反映抗原結合親和力，但似乎亦在結構穩定性中發揮作用。框架區內的高變補償輕鏈的不存在，但似乎亦提高VH結構域的穩定性並因此提高VH結構域的溶解性，並通過這點，還使抗原結合親和力最大化。我們推定缺少輕鏈只有重鏈的抗體的溶解性和穩定性是細胞內有效運輸到細胞表面、呈遞及隨後B細胞擴增的必要條件。亦可將有利的框架突變構建到包含工程改造的人V區段的新的種系只有重鏈的抗體基因座中，所述V區段各包含優選胺基酸取代。同樣地，可將優選的胺基酸取代工程改造到J和D基因區段中，以進一步提高VDJ 重排後的VH結構域的溶解性和穩定性。因而，提供高親和力的可溶的人只有重鏈的抗體，所述人抗體缺少特徵駱駝科相關胺基酸取代，並相對於正常四聚體人抗體中發現的VH結構域，顯示提高CDRl內的疏水性及增加CDR3內的荷電胺基酸。高親和力的可溶的人只有重鏈的抗體亦包含一個或多個框架β摺疊內的胺基酸取代，這導致相對於正常四聚體人抗體，提高框架1的總體疏水性，降低框架3的疏水性，和增加框架3中存在的荷電胺基酸。所述方法使能夠天然選擇新的只有重鏈的抗體。從所述抗體獲得的可溶的VH結構域包含在天然四聚體抗體中罕見或不存在的突變，在天然四聚體抗體中，VH溶解性取決於與免疫球蛋白κ或λ輕鏈的VL結構域的相互作用。在不存在輕鏈時，所觀察到的胺基酸取代賦予所得到的抗原特異的只有重鏈的抗體和可溶的VH結構域優選的生物物理學屬性。具體而言，通過該方法獲得的只有重鏈的抗體和可溶的VH結構域，缺少源自種系陣列或天然四聚體抗體的天然VH結構域的「粘的」、相對不可溶的及易於聚集的傾向。本發明這些只有重鏈的抗體和可溶的VH結構域具有高親和力(IOnM或更好)，在不存在聚集時是可溶的，並特別適合用作藥物。將在高親和力的人可溶的VH抗原結合結構域中發現的胺基酸取代重疊到存在於正常四聚體抗體中的人VH結構域的已知3D結構上，提供對明確的胺基酸取代的位置及功能影響的理解。例如從13-15位胺基酸觀察到框架1取代，其中13位更普遍，這導致疏水性整體提高。 13位變化位於導致局部提高親水性的小環中；框架2取代可發生在集中於35和50位周圍的β摺疊內以前輕鏈界面處；和框架3取代顯示在框架/⑶R界面處普遍，例如在⑶R2末端(56和57位)和在 CDR3起始處(93位)。本發明任選提供優選的新的框架胺基酸插入或取代，其被工程改造到天然V基因區段中，用於優化轉基因的只有重鏈的抗體基因座，以得到具有優選生物物理學特性(包括不存在聚集時的溶解性)的高親和力的只有重鏈的抗體和VH結構域。因而，提供所選擇的可溶性人VH結構域，其具有優選的生物物理學特性，例如在不存在聚集時的溶解性。它們提供天然重鏈框架區的來源，當與一個或多個CDR組合時，所述天然重鏈框架區提供進一步產生VH結合蛋白的文庫、新的抗原結合蛋白的來源(參見美國專利申請號 11/102, 502 和 11/745,644)。本發明人亦意想不到地顯示，轉基因編碼的只有重鏈的抗體亦由鼠長壽命的漿細胞或記憶B細胞表達，並從抗原攻擊的包含只有重鏈的基因座的轉基因動物的周圍淋巴腺、骨髓和脾中純化。而且，業已開發了更高效的方法，所述方法無需雜交瘤或經典展示方法來重新獲得抗原特異性的只有重鏈的抗體或可溶的VH結構域。有利地克隆的編碼源自抗原攻擊的轉基因動物的純化的漿細胞或記憶細胞群的只有重鏈的抗體或可溶的VH結構域的cDNA，可用所選擇的能夠表達、累積、分泌或呈遞VH 結構域融合蛋白或只有重鏈的抗體到細胞表面上的任何細胞系來表達。優選的選擇為適合製備臨床級材料的微生物細胞系或哺乳動物細胞系。因而，按照本發明第二方面，本發明第一方面的只有重鏈的抗體和可溶的VH結構域從宿主記憶B細胞或長壽命的漿細胞得到。本發明第二方面提供製備特異性結合抗原的只有重鏈的抗體的方法，所述方法包括(a)用抗原來免疫非人轉基因哺乳動物，其中哺乳動物在轉錄和加工的重鏈mRNA 中表達缺少CHl功能性的只有重鏈的抗體；(b)從免疫的哺乳動物分離長壽命的漿細胞或記憶B細胞；(c)從源自步驟(b)的細胞分離mRNA群；(dl)將源自步驟(c)中分離的mRNA的cDNA群克隆到表達載體中，並在所選擇的細胞系中表達所述cDNA;(el)選擇至少一種產生特異性結合抗原的只有重鏈的抗體的細胞系；或(d2)將源自步驟(c)中分離的mRNA的包含VH結構域的cDNA群克隆到所選擇的表達載體中，使得可包含重鏈效應子區的VH融合蛋白在所選擇的細胞系中表達；(e2)選擇至少一種產生特異性結合抗原的VH融合蛋白的細胞系。選擇的細胞系優選為哺乳動物來源，但可源自能夠累積或分泌只有重鏈的抗體和 VH結構域融合蛋白或呈遞所述只有重鏈的抗體和VH結構域融合蛋白到細胞表面上的酵母或任何生物體。該方法適合用於分離只有重鏈的抗體，而不管所述只有重鏈的抗體是在宿主生物體(例如大羊駝)中天然產生還是由於在非人宿主生物體中表達的轉基因座產生。優選地，所選擇的哺乳動物細胞系適合製備臨床級材料，例如CHO細胞。所述方法簡單、高效且很適合自動化，因為只有重鏈的抗體為同源二聚體，而不是複雜的四聚體。不必搜尋同族(cognate)輕鏈，搜尋同源輕鏈這個問題大大增加了從記憶細胞和漿細胞群獲得抗原特異性四聚體抗體的複雜性(參見Meijer等Q009) Therapeutic Antibodies :Methods and Protocols,525,261-277)。
可通過本領域非常確實的一些技術從宿主生物體分離在長壽命的漿細胞或記憶細胞中富含的B細胞群。優選的宿主生物體為小鼠。在小鼠中，充分表徵了 B細胞群，可使用細胞表面標記來區分不同亞群。例如，小鼠漿細胞在細胞表面上表達⑶138 (Syndecan-1)。 B細胞系的細胞上的⑶138表達將發育階段、定位及粘附相關聯(參見Sanderson等(1989) Cell Regulation, 1，27-35 ；Kim 等(1994)Mol. Biol. Cell.，5，797-805)。主要在脾、淋巴結和骨髓中發現CD 138+漿細胞。可進一步將漿細胞與鼠幼稚B細胞、記憶B細胞和非B細胞群區分開，因為它們是CD138+、CD45R(B220)低/陰性和CD19低/陰性的。識別細胞表面標記的抗體的可用性使得能夠通過螢光激活的細胞分選或在試劑盒中廣泛可用的非常確實的細胞分離技術將漿細胞與其它B細胞群分開，所述試劑盒基於例如用使得能結合一個細胞群而不是另一細胞群的與固體底物綴合的抗體進行的磁分離、 柱分離或離心分離步驟。因而，例如，包含抗⑶45R(有時稱為B220)的磁珠將從混合B細胞群中除去大部分非漿細胞。隨後與包含抗CD138的磁珠孵育將捕獲高度富集的漿細胞群 (參見Miltenyi Biotec用於小鼠⑶138+漿細胞分離的磁分選試劑盒)。亦可將其它細胞表面標記用於分離這些細胞(例如Anderson等(2007) J. Exp. Med.，204，2103-14)。同樣， 可自淋巴結和/或派伊爾斑(Peyer』 s patch)獲得初始細胞群。當不能獲得區分特定宿主B細胞系的抗體混合物時，那麼從骨髓和淋巴結分離B 細胞後用針對泛B細胞表面標記的抗體純化B細胞的組合將同樣提供高度富集的漿細胞群。這對於細胞表面標記例如CD138可能不可用的物種尤其相關，所述物種例如母牛 (cow)、兔、綿羊等，甚至人。可獲得選擇其它物種的特定B細胞群的標記(例如httD:// www, miltenyibiotec. com/en/PG 91 625 CD138 Plasma Cell Isol ation Kit.aspx ； Klein 等，Human immunoglobulin(Ig)M+IgD+peripheral blood B-cells expressing the CD27 cell surface antigen carry somatically mutated variable region genes :CD27 as a general marker for somatically mutated (memory) B cells (表達 CD27 細胞表面抗體的人免疫球蛋白(Ig)M+IgD+外周血B細胞原攜帶體細胞突變可變區基因CD27作為體細胞突變(記憶)B 細胞的通用標記)，(1998) J. Exp. Med. ,188, (9), 1679-89 ；Denham 等，Monoclonal antibodies putatively identifying porcine B cells (單克隆抗體推定鑑定豬 B 細胞)，(1998) Vet Immunol Immunopathol. 30 ；60 (3-4) :317-28 ;Boersma 等， Summary of workshop findings for porcine B-cell markers (豬 B 細胞標記石if究會結果概述)，(2001)Vet. ImmunolImmunopathol.，80，(1-2),63-78 ；Naessens，Surface Ig on B lymphocytes from cattle and sheep (來自牛和綿羊的B淋巴細胞上的表面Ig)， (1991)Int. Immunol.，9，(3)，349-54 ；Sehgal 等，Distinct clonal Ig diversification patterns in young appendix compared to antigen-specific splenic clones (與抗原特異性脾克隆比較年幼闌尾中的獨特的克隆Ig的多樣化圖式)，(2002) J. Immunol. ,168, (11),5424-33)。在從分離的漿細胞或記憶細胞群分離mRNA後，將cDNA (代表HCAb或單獨的VH結構域)克隆到所選擇的表達載體中，並將載體轉染到靶標細胞群中用於表達只有重鏈的抗體或VH融合蛋白。可例如通過96孔格式板或微陣列格式板的標準Elisa或螢光激活細胞分選術(FACS)選擇表達抗原特異性的只有重鏈的抗體的細胞以得到細胞系。
為了使該過程的效率最大化，優選將表達載體首先轉染到細菌中，將含有表達載體中的克隆的cDNA的菌落挑選到96孔(或其它可高通量可自動化的)格式板中，在96孔格式板中培養，並在相同格式板中分離DNA。隨後在相同格式板中將質粒DNA轉染到表達細胞(例如HEK細胞或酵母等)中，讓轉化體在相同96孔格式板中生長。隨後在相同格式板(或用較少的抗原的另一種，優選更高密度格式板，例如微陣列)中檢測細胞上清液的抗原結合。然後可進一步擴增抗原陽性HCAb-表達細胞，可從原始96孔格式板立即獲得陽性 cDNA，在96孔格式板中製備DNA用於進一步表徵，例如用於序列分析，或可將相關VH結構域立即克隆到不同主鏈中，例如來自相同物種或不同物種的不同恆定區。亦可立即將DNA 轉染到其它細胞類型中以建立其它細胞系。然後可擴增表達高親和力抗體的細胞系，建立細胞庫，並用作只有重鏈的靶抗體的來源，用於研究目的或可能的臨床前或臨床研究。因而，所述方法進一步包括維持所選擇的細胞系的步驟，所述細胞系產生特異性結合靶抗原的只有重鏈的抗體或VH融合蛋白。這種直接克隆方法對於正常轉基因獲得的四聚體抗體亦有利，其中每孔使用單個 CD138+細胞。用鏈特異性引物單獨PCR擴增編碼重鏈和輕鏈的(高豐度)mRNA，然後將每一種克隆到表達載體中。二者共轉染將導致四聚體抗體表達，可用所述用於只有重鏈的抗體的同樣方法來鑑定所述四聚體抗體。所選擇的表達載體為本領域技術人員所熟悉，應設計為有效驅動只有重鏈的抗體或VH融合蛋白在所選擇的細胞類型中表達。如果預期分泌，那麼載體應在氨基末端摻入信號肽。如果預期細胞表面表達，那麼在羧基末端也應存在疏水肽序列。優選但非必需地，所述氨基和羧基肽可源自哺乳動物的重鏈免疫球蛋白。應將載體設計為盒式，以便從抗原特異性的只有重鏈的抗體克隆的可溶的VH結構域可作為融合蛋白產生。得到的融合蛋白可為只有重鏈的抗體，並將包含可溶的VH結構域和所選擇的重鏈效應子結構域。若可溶的VH 結構域和所選效應子結構域為人來源，那麼得到的融合蛋白應為由選擇的效應子區(例如 IgM, IgG, IgA, IgE或IgD)規定的類型(及亞類)的人只有重鏈的抗體。在任何只有重鏈的抗體中，可溶的VH結構域和恆定效應子區將通過鉸鏈區連接。優選但不是必需地，這應為從合適類或亞類獲得的天然重鏈免疫球蛋白鉸鏈區。以上方法優於其它方法(例如噬菌體展示或用源自全脾的材料的雜交瘤)的優點為，所述方法在至今未知的體內選擇過程之後選擇在漿細胞或記憶細胞中產生的高親和力的只有重鏈的抗體(IOnmol或更好)。所述B細胞群產生只有重鏈的抗體(HCAb)，所述HCAb 可溶並且不在胞內小室中累積(否則所述累積導致細胞凋亡)。可用標準表達系統尤其是在已建立的哺乳動物細胞系例如HEK或CHO中有效表達所述HCAb。然後可用已確定的技術通常為可自動化的微孔格式板(例如96孔)將轉染細胞形成陣列。然後可選擇以下細胞用於進一步分析表達高親和力HCAb抗原結合劑的細胞，或備選的表達以明確親和力範圍結合抗原的HCAb的細胞。備選地，可通過FACS分析來選擇高親和力結合劑。從一種或多種抗原攻擊的轉基因非人動物例如小鼠(其作為HCAb mRNA來源表達抗原特異性HCAb)獲得的記憶細胞或漿細胞的使用，提供用於HCAb選擇的異常有效的途徑，這使得能夠選擇可能百萬計的產生HCAb的細胞用於隨後分析。然後可在培養物中擴增所選擇的表達高親和力HCAb抗原結合劑的細胞，這在不存在另外克隆步驟的情況下提供產HCAb細胞的來源。任選可將分離的長壽命的漿細胞或記憶B細胞在抗原特異性的只有重鏈的抗體或VH結構域的mRNA分離和克隆之前無限增殖化。本發明亦提供轉基因非人哺乳動物，其具有包含顯性選擇標記基因的轉基因重鏈基因座或只有重鏈的基因座(缺少CHl功能性)。同樣預期包含多於一個的選擇標記，各標記與不同基因座或基因座組連接，使得能夠優先選擇表達與能夠表達只有重鏈的抗體的一個基因座或基因座組形成對比的另一個基因座或基因座組的雜交瘤。不同基因座上的多種選擇標記的使用依賴以下發現如果轉基因非人哺乳動物具有多個只有重鏈的基因座，那麼這些基因座遭受等位基因排斥(PCT/IB2007/001491)。因此，抗原攻擊後，只有一個基因座被隨機選擇並成功地重組，導致產生只有重鏈的抗體。因此，可在相同轉基因非人哺乳動物中使用多個只有重鏈的VH基因座，以使從該哺乳動物獲得的抗體庫和多樣性最大化。當用抗原攻擊時，轉基因非人哺乳動物的基因座相繼地進行隨機重組，不優選任何特定基因座，直到重組之一為「生產性的」，即導致產生抗體。停止進一步重組，藉此「排除」其它等位基因(基因座)。將優選擴增產生高親和力抗體的細胞。通常顯性選擇標記基因為原核來源，且選自賦予對毒性藥物例如嘌羅黴素、潮黴素和G418抗性的基因，或這樣的基因其消除某些營養需求，使得其表達將毒性物質轉化為必需胺基酸，例如將吲哚轉化為色氨酸或將組氨醇轉化為組氨酸。必需的要求是，若使用顯性選擇標記，則其與所需的只有重鏈的免疫球蛋白等位基因共表達，由此確保不依賴B 細胞表達和整合位點的轉基因基因座表達。備選地，可用同源重組與ES細胞或核轉移方法組合，將藥物抗性基因插入內源或外源(轉基因)免疫球蛋白基因座中。因此，提供用於製備單克隆抗體的方法，所述方法需要選擇優選從表達確定的免疫球蛋白的只有重鏈的基因座的記憶細胞或漿細胞得到的雜交瘤或轉化B細胞系，所述雜交瘤或轉化B細胞系包含存在於非人轉基因哺乳動物中的多個只有重鏈的基因基因座之一，所述基因座包含插入到所述基因座中的共表達的顯性選擇標記基因。優選基因座為包含顯性選擇標記基因的只有重鏈的基因座，所述基因座表達只有重鏈的抗體。優選地，從經工程改造為缺少CHl功能性的內源只有重鏈的基因座或從引入的缺少CHl功能性的重鏈轉基因產生只有重鏈的抗體，任選在不存在免疫球蛋白輕鏈基因表達的情況下。所述基因座亦可在不存在輕鏈基因座的情況下包含顯性選擇標記和重鏈基因座，當表達時，所述重鏈基因自發產生缺少CHl功能性的mRNA轉錄物，這導致以B細胞依賴方式表達只有重鏈的抗體。根據本發明第三方面，當預期將雜交瘤或B細胞轉化方法用於使漿細胞或記憶細胞無限增殖化時，那麼在各重鏈基因座中包含功能顯性選擇標記基因，使得能夠隨後選擇並穩定維持在抗原攻擊後表達目標基因座的雜交瘤或轉化B細胞系，同時丟失不表達該目標基因座的所有雜交瘤細胞或轉化B細胞。為本發明目的，可使用任何顯性選擇標記基因， 前提是該基因的表達在存在選擇性(例如毒性)攻擊時賦予雜交瘤選擇性益處(參見Vara 等(1986)NAR, 14,4617-4624 ；Santerre 等(1984)Gene, 30,147-156 ；CoIbere-Garapin ^ (1981) 150，1-14 ；Hartmann 和 Mulligan(1988)PNAS，85，8047-8051)。異源只有重鏈的基因座在本發明上下文中，術語『異源』意即本文所述的核苷酸序列或基因座相對其處於其中的哺乳動物不是內源的，或者已通過取代或除去內源序列修改的內源基因座。本發明上下文中「只有重鏈的基因座」涉及編碼VH結構域的基因座，其包含一個或多個V基因區段、一個或多個D基因區段和一個或多個J基因區段，任選與一個或多個重鏈效應子區(每個都缺少CHl結構域功能性)連接。可通過增加存在於基因座中的V基因區段數目，或通過用各包含不同V基因區段的不同基因座，來增加V基因區段複雜性。優選只有重鏈的基因座包含源自任何脊椎動物物種的5-20個不同的V基因區段。優選V基因區段為人來源，任選針對改進的溶解性選擇或工程改造。優選只有重鏈的基因座包含2-4(K2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、30 或 40)或更多個D基因區段。D基因區段可源自任何脊椎動物物種，但最優選D基因區段為人 D基因區段(正常25個功能性D基因區段)。優選只有重鏈的基因座包含2-2(^2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18或20)或更多個J基因區段。J基因區段可源自任何脊椎動物物種，但最優選J基因區段為人J基因區段(通常6個J基因區段)。優選只有重鏈的基因座包含2個以上的V基因區段、25個功能性人D基因區段和 6個人J基因區段。術語『V基因區段』涵蓋天然存在的V基因區段，其源自脊椎動物，包括駱駝科和人，並任選針對改進特性例如溶解性經選擇、突變或工程改造。亦在其它脊椎動物物種例如鯊魚中發現V基因區段(參見Kokubu等(1988) EMBO J.，7，3413-3422)，或V基因區段例如在抗體輕鏈VL庫或T細胞受體VH庫的進化過程中業已進化產生例示性結合蛋白的多樣化 VH-樣家族。當核酸表達時，V基因區段必須能夠與本發明D基因區段、J基因區段和重鏈恆定 (效應子)區(其可包含若干外顯子但不包含CHl外顯子)重組，產生只有重鏈的抗體。本發明的V基因區段在其範圍內亦包含編碼同源物、衍生物或蛋白片段的任何基因序列，所述V基因區段能夠與本發明D基因區段、J基因區段和重鏈恆定效應子區(包含一個或多個外顯子但不包含功能CHl外顯子)重組，產生如本文所定義的只有重鏈的抗體。 重鏈恆定效應子區可在以下情況下包含CHl結構域其中免疫球蛋白重鏈基因座在缺少免疫球蛋白輕鏈基因表達的宿主動物背景中表達。因而，VH編碼序列可源自天然存在的來源，或可用本領域技術人員熟悉的方法工程改造或合成它們。本發明上下文中的「可溶的VH結構域」指V基因區段當與上文定義的D基因區段和J基因區段重組時的表達產物。在天然選擇和親和力成熟母體HCAb後，本文所用的可溶的VH結構域在表達和分離後在不存在聚集的情況下仍留在溶液中，在生理介質中不需任何其它維持溶解性的因子即具有活性。亦可單獨用多種不同的蛋白質結構域對可溶的VH 結構域進行工程改造，以產生用於靶向治療及診斷目的的融合蛋白，例如可用毒素、酶和顯像劑或者用血液蛋白例如白蛋白，以便體內操縱可溶的VH結構域藥代動力學及組織分布 (參見 US5, 843，440 和 Smith 等 Q001) Bioconjugate Chem.，12，750-756)。在本發明上下文中，術語『D基因區段』和『J基因區段』包含天然存在的D和J基因區段序列。優選D和J基因區段源自與V基因區段所源自的相同脊椎動物。例如，若V 基因區段源自人，那麼可溶的或工程改造的D和J基因區段優選亦源自人。備選地，V基因區段可源自例如大鼠或小鼠，而D和J基因區段源自駱駝(camel)或人。
術語D基因區段和J基因區段在其範圍內亦包含其衍生物、同源物及片段，只要所得到的區段可與本文所述的重鏈抗體基因座的其餘組分重組產生本文所述的只有重鏈的抗體即可。D和J基因區段可源自天然存在的來源，或它們可用本領域技術人員所熟悉和本文所述的方法來合成。為了增加CDR3多樣性，D和J基因區段可摻入確定的另外的胺基酸殘基或確定的胺基酸取代或缺失。V、D和J基因區段能夠重組並優選經歷體細胞突變。V、D和J基因區段優選源自單個脊椎動物物種。其可為任何脊椎動物物種，但優選為人。特徵序列為存在於駱駝科VHH結構域但不存在於可溶的VH結構域中的四個充分明確的種系編碼的胺基酸序列取代(VHH四聯體)。它們全部存在於第二框架區中，並起降低以前輕鏈界面的疏水性的作用。發現Glu-44和Arg-45取代存在於VH結構域中的親水性較差的Gly-44和Leu-45，同時通過用較小的殘基取代Trp提高47位的親水性。第四個變化需要用Phe或Tyr取代Val_37。重鏈恆定區在操作上，在B細胞中通過能夠與V基因區段、D基因區段和J基因區段重組的天然存在的或工程改造的基因區段編碼重鏈恆定區。優選重鏈恆定區源自抗體基因座。每個重鏈恆定區基本上包含至少一個重鏈恆定區基因，其在沒有功能CHl結構域的情況下表達，從而可產生只有重鏈的抗體。在內源免疫球蛋白輕鏈時基因表達不存在時， 那麼重鏈恆定區可包含在重鏈基因表達期間以低頻率自發缺失的CHl功能性。每個重鏈恆定區亦可包含一個或多個另外的重鏈恆定區外顯子，所述外顯子選自CS、C γ 1_4、Cμ ,C ε 和Ca 1-2。視所需的優選抗體類別或抗體類別混合物來選擇重鏈恆定區基因區段。任選異源重鏈基因座缺失Cy和C δ。例如，缺少CHl的所有或部分異源重鏈Cy基因座的表達，將產生任選某些或全部 IgG同工型，其視異源IgG基因座中存在的IgGl、IgG2、IgG3和IgG4同工型而定。備選地，可獲得所選擇的抗體混合物。例如，當重鏈恆定區包含Ca和Cy基因時可獲得IgA和IgM。存在於轉基因基因座中的重鏈恆定區可為人來源，但可與宿主哺乳動物的重鏈恆定區相同或緊密相關，以體內最大化抗原應答。因而，對於用於人治療應用的只有重鏈的抗體或可溶的VH結構域的來源而言，存在於基因座中的VDJ基因將源自任選經修飾的人種系序列，如果宿主動物為齧齒動物例如小鼠，那麼恆定區可為齧齒動物來源。然後可克隆所選擇的包含可溶的人VH結合結構域和齧齒動物恆定效應子區的只有重鏈的抗體，齧齒動物效應子區可用以下取代所選擇的人恆定效應子區或用於獲得備選VH融合蛋白、VH結構域抗體複合體等的可溶的VH結構域。如果將只有重鏈的抗體用於獸醫或備選目的時，那麼V、D和J基因區段優選源自最符合預期目的的脊椎動物或哺乳動物。例如，V基因區段及D和J基因區段可源自其它哺乳動物(例如小鼠、大鼠、豬、母牛、山羊、綿羊、駱駝等)，其視預期用途而定，所述計劃用途例如獸醫應用、工業應用、農業應用、診斷應用或試劑應用。本文所定義的『重鏈恆定區外顯子』 (『CH外顯子』)包含天然存在的脊椎動物(但尤其包含哺乳動物)CH外顯子的序列。其以經典的特定方式變化。例如，IgG和IgA為天然缺失CH4結構域。術語『CH外顯子』在其範圍內亦包含其衍生物、同源物和片段，只要當其為重鏈恆定區組分時，CH外顯子能夠形成本文所定義的功能的只有重鏈的抗體。哺乳動物本發明方法中使用的轉基因哺乳動物不是人。轉基因哺乳動物優選為齧齒動物， 例如兔、豚鼠、大鼠或小鼠。特別優選小鼠和大鼠。亦可採用備選哺乳動物，例如山羊、豬、 牛、綿羊、貓、狗或其它動物。優選用以下技術產生包含整合到種系中的異源的只有重鏈的抗體基因座的轉基因動物已建立的卵母細胞注射技術、在已建立時用ES細胞技術、iPS細胞技術或核轉移 (克隆)技術。備選地，可將基因座引入到以上細胞中，或用以下技術直接引入到受精卵中 鋅指核酸酶(Remy等(2009) Transgenic Res. , 2009年9月沈日.[印刷前的電子版]， Kandavelou 等(2009) Biochem. Biophys. Res. Commun.，；388，(1)，56-61)或重組酶技術(例如Sakurai等(2010)Nucleic Acids Res.，1月13日[印刷前的電子版]及其中參考文獻)例如ere等。亦可使用ES細胞中的標準同源重組，以從內源重鏈基因消除CHl功能性，並取代內源V基因區段或D和J基因區段內的元件或序列，導致從內源重鏈基因座產生只有重鏈的抗體。有利地，當對於哺乳動物而言為內源的抗體重鏈基因座被缺失或沉默或降低產生內源抗體的能力時，增強異源的只有重鏈的基因座轉基因表達。當內源宿主重鏈基因座被工程改造以消除CHl功能性，且VDJ和任選恆定效應子區被來自其它物種(優選人)的序列取代時，那麼不必加入另外的轉基因重鏈基因座。如上所述產生只有重鏈的抗體和可溶的VH結構域的這種方法，可特別用於產生用於人治療用途的無聚集的可溶的抗體和抗體複合體。因此，在另一方面，本發明提供響應抗原攻擊而表達本發明異源重鏈基因座的轉基因哺乳動物。產抗體細胞可源自本發明轉基因動物，並用於例如優選的實施方案以重新獲得記憶細胞或長壽命的漿細胞，但亦用於從雜交瘤或通過本文所定義的排列方法產生只有重鏈的抗體。另外或備選地，可用本領域技術人員熟悉的重組DNA技術，在抗原攻擊後從本發明轉基因哺乳動物的B細胞(尤其記憶細胞或長壽命的漿細胞)分離編碼只有重鏈的抗體和 /或可溶的VH結構域的核酸序列，並將其用於產生可溶的VH結構域、只有重鏈的抗體、可溶的雙特異性/雙功能的VH結構域複合體或可溶的VH結構域多蛋白(參見WO 99/23221)。備選地或另外，可通過使本發明轉基因動物免疫來產生多克隆抗原特異性的只有重鏈的抗體。因而，在另一方面，本發明提供用於通過用抗原免疫本發明轉基因哺乳動物來產生高親和力的只有重鏈的抗體的方法。在本發明該方面的優選實施方案中，哺乳動物為齧齒動物，優選小鼠或大鼠。R有重鏈的抗體禾Π可溶的VH結構域融合g白的泡丨備用於只有重鏈的抗體和可溶的VH結構域融合蛋白的製備系統包括適合大量飼育技術的哺乳動物細胞培養物(例如CHO細胞)、植物(例如玉米)、轉基因山羊、兔、牛、綿羊、雞和昆蟲幼蟲。包括病毒感染(例如昆蟲幼蟲和細胞系中的杆狀病毒)在內的其它製備系統為細胞培養和種系方法的備選。其它製備方法亦應為本領域技術人員所熟悉。當需要裝配只有重鏈的IgA或IgM時，共表達「J鏈」可是有益的。用於製備只有重鏈的抗體或單獨的可溶的VH結合結構域或VH結合結構域複合體的合適方法為本領域已知。例如，已在細菌系統中產生VH結合結構域和VH結合結構域複合體，且已在雜交瘤和轉染的哺乳動物細胞中產生只有重鏈的同源二聚體(參見Reichmann和Muyldermans，(1999) J. Immunol. Methods,231,25-38)。用於表達用噬菌體展示技術獲得的工程改造的人VH結合結構域的方法亦是非常確定的(Tanha 等(2001) J. Biol. Chem.，276，M774-M789 及其中的參考文獻)。本發明亦提供由異源重鏈基因座組成的多核苷酸序列、分離的編碼本發明只有重鏈的抗體的多核苷酸，和包含異源重鏈基因座或其片段或分離的編碼本發明的只有重鏈的抗體的多核苷酸的載體。本發明亦提供編碼可溶的VH結構域和VH結構域融合蛋白的多核苷酸序列和包含所述序列的載體。本發明亦提供一種宿主細胞，其用本發明的異源的只有重鏈的基因座或其片段， 或分離的編碼只有重鏈的抗體、可溶的VH結構域或VH結構域融合蛋白的多核苷酸轉化。摘_偏本、VH辦編口 VH紐始船口絲_ 用塗本發明的可溶的高親和力的只有重鏈的抗體、VH結構域融合蛋白、VH結構域多肽複合體和可溶的VH結構域尤其適合用作胃腸外和非胃腸外藥物。在本發明上下文中，優選這些全部為人來源，但任選卻不太優選地，可包含來自其它物種的V、D或J基因區段。除治療之外，本發明提高溶解性的包含可溶的VH結構域的只有重鏈的抗體、分離的可溶的VH結構域和可溶的VH結構域結合複合體和多蛋白還尤其適合用作試劑和診斷。全部都適合用於人的藥物用途，因此本發明提供一種藥物組合物，其包含含可溶的VH結構域的只有重鏈的抗體、分離的可溶的VH結構域、可溶的VH結構域結合複合體或可溶的VH結構域多蛋白。本發明亦提供本發明包含可溶的VH結構域的只有重鏈的抗體、 分離的可溶的VH結構域、可溶的VH結構域結合複合體或可溶的VH結構域多蛋白在製備用於預防和/或治療疾病的藥物中的用途。藥物組合物和藥物通常在給予患者之前配製。例如，包含可溶的VH結構域的只有重鏈的抗體、分離的可溶的VH結構域、可溶的 VH結構域結合複合體或可溶的VH結構域多蛋白可與穩定劑混合，尤其是如果要將其凍幹。 加入糖(例如甘露醇、蔗糖或海藻糖)通常提供凍幹期間的穩定性，優選的穩定劑為甘露醇。人血清白蛋白(優選重組的)亦可作為穩定劑加入。亦可使用糖混合物，例如蔗糖和甘露醇、海藻糖和甘露醇等。可將緩衝液加入到組合物中，例如Tris緩衝液、組氨酸緩衝液、甘氨酸緩衝液或優選磷酸鹽緩衝液(例如含有磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉)。優選加入緩衝液獲得7. 2和7. 8 之間的ΡΗ，特別是約7.5的ρΗ。為了在凍幹後復溶，可使用注射用無菌水。亦可用包含人血清白蛋白(優選重組的)的水性組合物復溶凍幹餅。通常，包含可溶的VH結構域的只有重鏈的抗體、分離的可溶的VH結構域、可溶的 VH結構域結合複合體或可溶的VH結構域多蛋白以純化形式與藥理學上合適的載體一起使用。
因而，本發明提供用於治療患者的方法，所述方法包括將本發明藥物組合物給予患者。患者優選為人，可為小孩(例如幼兒或嬰兒)、青少年或成年人，但通常為成年人。本發明亦提供用作藥物的本發明包含可溶的VH結構域的只有重鏈的抗體、分離的可溶的VH結構域、可溶的VH結構域結合複合體和可溶的VH結構域多蛋白。本發明亦提供本發明的包含可溶的VH結構域的只有重鏈的抗體、分離的可溶的 VH結構域、可溶的VH結構域結合複合體和可溶的VH結構域多蛋白在製備用於治療患者的藥物中的用途。 這些用途、方法和藥物優選用於治療包括但不限於以下疾病或病症及用於免疫治療傷口癒合；細胞增殖病，包括瘤、黑色素瘤、肺瘤、結直腸瘤、骨肉瘤、直腸瘤、卵巢瘤、肉瘤、子宮頸瘤、食管瘤、乳腺瘤、胰腺瘤、膀胱瘤、頭頸瘤和其它實體瘤；骨髓增殖病，例如白血病、非霍奇金氏淋巴瘤、白細胞減少症、血小板減少症、血管發生疾病、卡波西肉瘤；自身免疫性/炎性疾病，包含變態反應、炎性腸病、關節炎、牛皮癬和呼吸道炎症、哮喘、免疫病和器官移植排斥；心血管病和血管病，包括高血壓、水腫、咽峽炎、動脈粥樣硬化、血栓症、膿毒、休克、再灌注損傷和缺血；神經學疾病，包括中樞神經系統病、阿爾茨海默病、腦損傷、肌萎縮性側索硬化和疼痛；發育病；代謝病，包括糖尿病、骨質疏鬆症和肥胖、AIDS和腎病；感染，包括病毒感染、細菌感染、真菌感染和寄生蟲感染、與胎盤有關的病理學病症和其它病理學病症。在再一方面，本發明提供本發明包含可溶的VH結構域的只有重鏈的抗體、分離的可溶的VH結構域、可溶的VH結構域結合複合體或可溶的VH結構域多蛋白單獨或與合適效應子劑聯合作為診斷、預後或治療顯像劑的用途。本發明提供本文所述的包含可溶的VH結構域的只有重鏈的抗體、分離的可溶的 VH結構域、可溶的VH結構域結合複合體或可溶的VH結構域多蛋白作為細胞內結合試劑或抗體酶的用途。優選抗原特異性的可溶的VH結合結構域、可溶的VH結構域結合複合體和可溶的VH結構域多蛋白。本發明亦提供本發明抗原特異性的只有重鏈的抗體或可溶的VH結合結構域作為酶抑制劑或受體阻斷劑的用途。優選的只有重鏈的抗體片段為抗原特異性的可溶的VH結合結構域。本發明亦提供與效應子分子融合的一個或多個可溶的VH結構域用作治療、成像齊IJ、診斷、抗體酶或試劑的用途。現在在參考以下附圖的以下詳述中僅舉例闡述本發明。MM

圖1.兩個人只有重鏈的免疫球蛋白基因座，一個攜帶4個VH基因區段，另一個攜帶18個VH基因區段。包含18個VH基因區段的基因座包含小鼠恆定效應子區(-CH1)，覆蓋正常人四價抗體中使用的多於90%的VH基因區段。圖2.通過噬菌體展示的人VH結構域或通過標準雜交瘤技術的人只有重鏈的抗體的免疫和分離方案。圖3. Luk-sPV免疫的血清(V4相比wt正常小鼠)的Elisa(頂部)和蛋白質印跡 (底部)，以及使用Luk-sPV蛋白凝膠電泳、點印跡並用來自噬菌體展示篩選的不同陽性克隆檢測單獨分離的VH結構域的蛋白質印跡。
圖4.用Luks-PV免疫後的兩個VH結構域序列實例，其顯示產生IgG2和IgG3 二者(類轉換)和同樣的VDJ重排導致不同突變。圖5.在用人CRl免疫後用V3-23基因區段獲得的VH結構域序列，其顯示產生IgG2 和IgG3 二者(類轉換)，和當與頂部所示的V3-23區段的種系序列比較時，同樣的VDJ重排導致不同突變。經由雜交瘤獲得部分的序列，其餘經由展示文庫獲得。圖6.在用人CRl免疫後用V3-11基因區段獲得的VH結構域序列，其顯示產生IgG2 和IgG3 二者(類轉換)，和當與頂部所示的V3-11區段的種系序列比較時，同樣的VDJ重排導致不同突變。經由雜交瘤(箭頭)獲得部分的序列，其餘經由展示文庫獲得。圖7.在SUMO雜合蛋白系統(InVitrogen)中純化和表達後的VH結構域(α CRl) 的凝膠電泳(左)實例。該實例顯示三個不同長度的正確分子量的VH結構域。標記泳道在左邊。中間圖顯示在kphadex 75Smart系統上VH結構域的洗脫曲線。右圖為同樣的曲線，但為完整的只有重鏈的化6在kphadex 200上的曲線。下圖顯示濃縮至> %ig/ml的兩個其它VH結構域的洗脫曲線。圖8. L光散射圖和B. VH結構域的熱穩定性。圖9. 一些α CRl只有重鏈的抗體(左)的親和力測量，以及抗體之一在Octet系統上用以獲得結合親和力的結合和解離曲線。圖10. —些抗CRlVH結構域的溶解性。圖11.大量平行測序以確定優選突變。圖12.與來自駱駝、大羊駝和來自正常四聚體重鏈/輕鏈抗體的人重鏈的相同區比較的人只有重鏈的抗體(HCAb)的框架I(FRl)和⑶Rl區的盒圖分析。通過 Henderson-Hasselbach 方程在 pH = 7. 4 時測定淨電荷；通過 Cowan-Whittaker 指數在 pH =7. 5時測定淨疏水性。不同抗體下方的數字是唯一的輸入序列序號。圖13.與來自駱駝、大羊駝和來自正常四聚體重鏈/輕鏈抗體的人重鏈的相同區比較的人只有重鏈的抗體(HCAb)的框架2(FR2)和⑶R2區的盒圖分析。通過 Henderson-Hasselbach 方程在 pH = 7. 4 時測定淨電荷；通過 Cowan-Whittaker 指數在 pH =7. 5時測定淨疏水性。不同抗體下方的數字是唯一的輸入序列序號。圖14.與來自駱駝、大羊駝和來自正常四聚體重鏈/輕鏈抗體的人重鏈的相同區比較的人只有重鏈的抗體(HCAb)的框架3(FR3)和⑶R3區的盒圖分析。通過 Henderson-Hasselbach 方程在 pH = 7. 4 時測定淨電荷；通過 Cowan-Whittaker 指數在 pH =7. 5時測定淨疏水性。不同抗體下方的數字是唯一的輸入序列序號。圖15.與人CRl或金黃色葡萄球菌(staph A) Luk-sPV結合的VH結構域的3D結構。抗原結合位點在頂部右邊位置，以前的VL相互作用結構域面對讀者。在3D結構中由顏色標出胺基酸變化。圖16. VH結構域(除⑶R3外)各位置處的平均疏水性差異，表明在只有重鏈的抗體中，尤其是在VH結構域的N末端，變化趨向更疏水。與平均人四聚體VH比較，就疏水性差異而言的一些熱點顯然在49、62和72位。圖17.通過分選⑶138陽性細胞並直接表達克隆到HEK細胞中的人HCAb的免疫和分離方案。圖18.用於哺乳動物細胞表達HCAb的載體。載體具有標準pUC主鏈(未顯示)，與氨苄青黴素抗性基因和哺乳動物抗性基因(潮黴素)。相關部分含有標準CMV增強子和雞β -肌動蛋白啟動子anVitrogen)，接著是Kozak核糖體結合位點，接著是VH3-23的信號序列。由IgG2或IgG3恆定區組成的盒的後端以鉸鏈結構域和CH2結構域開始。用箭頭所指的引物擴增後在這兩個區之間克隆VH cDNA。圖19.將HCAb直接表達克隆到HEK細胞中的實例及概述。左邊上圖顯示測定陽性地響應HA抗原免疫的免疫小鼠的標準ELISA (紅色小鼠用於HEK細胞表達克隆)。右邊上圖顯示在96孔格式板中對轉染的HEK細胞進行的ELISA的兩個實例。圖20.源自3-1IVH種系序列的ELISA-陽性HCAb的序列分析。圖21.源自3-23VH種系序列的ELISA-陽性HCAb的序列分析。圖22.完整的只有重鏈的IgG在kphadex 200Smart柱上的洗脫曲線。圖23.在Octet上的兩個抗HA HCAb的親和力測量。圖24.與在人抗CRlHCAb (參見以上)、人四聚體HCAb和大羊駝HCAb中觀察到的相比的跨越抗HA HCAb的VH區的胺基酸。圖25.在單細胞分選並直接表達克隆到HEK細胞中後人HCAb的免疫和分離方案。圖26.在單細胞分選並直接表達克隆到HEK細胞中後正常四聚體人重鏈和輕鏈抗體的免疫和分離方案。實施例1抗Luk-sFV抗體的產牛用來自金黃色葡萄球菌的Luks-PV蛋白在含有完整人重鏈抗體基因座的轉基因小鼠中進行免疫，其如W02006/008548中所述。這些小鼠攜帶4個人VH區段、全部人重鏈 D區、全部人JH區和人Cy2禾口 CY3區(圖1)。業已從人C γ恆定區缺失CHl結構域，使得能夠如所述製備人只有重鏈的抗體 (Janssens等(2006) PNAS，103，15130-15135)。用標準方案免疫小鼠，並如圖2概略所示地分離抗體。通過標準方案免疫小鼠4次，並通過標準ELISA檢驗血清的陽性反應(圖3)。免疫後，收集脾細胞，並用VH結構域特異性引物通過標準方法將mRNA逆轉錄並擴增為cDNA(參見例如Janssens等(2006)PNAS, 103，15130-15135)。將得到的VH片段克隆到噬菌體展示載體中。通過標準展示方案篩選並淘選3輪後，將VH結構域(VH-D-J)克隆到細菌表達載體中。通過蛋白質印跡證實陽性克隆，隨後通過標準方法對克隆的DNA測序， 得到示於圖4的VH結構域區的胺基酸序列定義。備選地，可通過標準雜交瘤技術獲得抗體。可通過標準克隆方法將由噬菌體展示技術獲得的VH結構域工程改造回到所選擇的重鏈恆定效應子區(缺少CHl功能性)上，以產生所選擇的就恆定區而言完整的只有重鏈的抗體(例如為C α而不是CY)。同樣地，可通過標準cDNA和PCR技術克隆由雜交瘤技術獲得的只有重鏈的抗體。這使得能夠分離單獨的VH結構域。因而，兩種方法均可用來獲得抗原特異性的VH結構域或抗原特異性的只有重鏈的抗體。實施例2抗人CRl抗體的製備實施例2與實施例1極為相似，除了用CRl作為抗原免疫外，CRl為通常在人紅細胞表面表達的蛋白。亦通過注射在其細胞表面表達人CRl的鼠紅細胞來免疫。不同免疫的結果非常相似。在含有完整人重鏈抗體基因座的轉基因小鼠中進行免疫，其如WO 2006/008548中所述。這些小鼠攜帶4個人VH區段、全部人重鏈D區、全部JH區和人C γ 2 禾口 C γ 3區(圖1)。業已從人CY恆定區缺失CHl區，以使得能夠如所述製備人只有重鏈的抗體 (Janssens等(2006) PNAS，103，15130-15135)。用標準方案免疫小鼠，並如圖2概略所示地分離抗體。免疫後，收集脾細胞，並用VH結構域特異性引物通過標準方法將mRNA逆轉錄並擴增為cDNA(例如Janssens等(2006)PNAS, 103，15130-15135)。將得到的VH片段克隆到噬菌體展示載體中。通過標準展示方案篩選並淘選3輪後，將VH結構域(VH-D-J)克隆到細菌表達載體中。隨後通過標準方法對克隆的序列測序，得到示於圖5和6中的VH結構域區。 備選地，可通過標準雜交瘤技術獲得抗體(圖5和6)。可通過標準克隆方法將由噬菌體展示技術獲得的VH結構域工程改造回到所選擇的恆定效應子區(缺少CHl功能性)上，以產生完整的只有重鏈的抗體(例如為C α而不是Cy)。同樣地，可通過標準cDNA和PCR技術克隆由雜交瘤技術獲得的只有重鏈的抗體，這使得能夠分離其單獨的VH結構域。因而，兩種方法均可用來獲得抗原特異性的VH結構域或抗原特異性的只有重鏈的抗體。_仿丨丨3VH辦編口 R摘本白腫汰、十牛可在細菌表達系統中表達實施例1和2的VH結構域，以獲得大量純化的VH結構域。例如，可在細菌中用SUMO雜合表達系統(InVitrogen)將VH結構域作為雜合蛋白表達。 當純化時，將這些作為單一片段在變性凝膠電泳凝膠上泳動(圖7)。當在非變性條件下在 Smart kphadex色譜系統中流動時，這些VH結構域主要作為正確分子量的單主峰流動(圖 7)，且幾乎沒有可溶的聚集體的跡象。源自雜交瘤上清液的只有重鏈的抗體亦主要作為單主峰流動，且在該峰的前緣有小百分比的抗體二聚體的跡象。VH結構域的單峰表明它們為可溶單體，這通過運行散點圖證實(圖8A)，因為光散射峰與蛋白吸收峰在運行期間一致。最後，當加熱時，VH結構域在至高55°C時穩定，其如標準圓二色性分析所測量(圖8B)。最後，用BiaCore和Octet系統測試可溶的VH結構域和HCAb的結合親和力。獲得的親和力在低納摩爾範圍或更好(圖9)。還通過真空離心濃縮源自HCAb的一些VH結構域，並通過高速離心除掉膠體物質。 這獲得為最小估計值的溶解性數字，因為少量樣本阻礙了進一步濃縮。測試的所有VH結構域顯示溶解性超過細g/ml (圖10)。實施例4.大量測序以確定突變圖式從收集自抗體結合Luk-sPV、CRl和其它抗原的所有序列的檢查來看，顯然源自在鼠B細胞中表達的HCAb轉基因的可溶的人VH結構域的VDJ重組和成熟(高變)，與在駱駝和大羊駝VHH結構域或源自正常四聚體重鏈和輕鏈抗體的人VH結構域中觀察到的極為不同。因此進行大量平行測序(Roche 4 測序)來跟蹤從重組到高變的過程。使用該測序來驗證過程確實不同，並理解在最初選擇特定VDJ重組後抗體的哪些參數及部分對於產生高親和力的可溶的人只有重鏈的抗體是重要的。結果提供了該過程如何發生的概觀(圖 11)。
該分析顯示，小鼠能夠引入大量胺基酸取代跨越表達的轉基因的VH結構域。大部分在⑶Rl和⑶R2的位置。然而，取代亦在FRl和FR2內顯然，並分布跨越FR3。⑶R/FR相互作用區似乎為取代的熱點。從該分析看，就位置及胺基酸取代而言，明顯的是突變過程與在駱駝科VHH結構域和存在於正常四聚體人抗體中的VH結構域中所觀察到的極為不同。t施例5.存在幹可溶的VH結構域、VHH結構域和源自四聚體杭體的VH結構域中的單獨框架區和CDR區的比較分析將可溶的人抗原結合VH結構域的所有突變列表，並與來自駱駝科只有重鏈的抗體、大羊駝只有重鏈的抗體的VHH結構域和從正常四聚體人抗體獲得的人VH結構域進行比較，分析不同區(FRl、CDRl、FR2、CDR2、FR3、CDR3)。該比較包含10個已知的駱駝VHH結構域序列、58個已知的大羊駝VHH結構域序列和超過4000個源自正常四聚體抗體的已知的人VH結構域序列，所有的都從文獻及公共抗
體資料庫獲得。可溶的人VH結構域的FRl區(圖12)顯示，當與駱駝和大羊駝比較時淨電荷增加， 當與駱駝、大羊駝和源自正常人四聚體抗體的VH結構域比較時疏水性提高，同時荷電胺基酸數目增加。CDRl區(圖12)在淨電荷方面具有極小的變化(與大羊駝比較少許減少)，相對於等價的來自人四聚體抗體的VH結構域，大羊駝和駱駝VHH結構域疏水性提高。荷電胺基酸數顯示幾乎無顯著差異。可溶的人VH結構域的FR2區(圖13)顯示，與駱駝和大羊駝VHH結構域比較淨電荷沒有差異，與駱駝和大羊駝VHH結構域比較疏水性顯著提高，同時與駱駝和大羊駝VHH 結構域比較荷電胺基酸數目減少。其在兩個方面都與源自四聚體抗體的人VH結構域相似。 CDR2區(圖1 具有與大羊駝相似的淨電荷，該淨電荷比駱駝和人四聚體抗體高，並具有與其它的極為相似的疏水性，同時荷電胺基酸數目與源自四聚體抗體的人VH結構域相似，但比其它的稍低。可溶的人VH結構域的FR3區(圖14)顯示，當與源自四聚體抗體的人VH結構域比較時淨電荷增加，當與源自四聚體抗體的人VH結構域比較時疏水性降低，同時與源自四聚體抗體的人VH結構域比較荷電胺基酸數目增加。在所有方面，其都與駱駝和大羊駝VHH 結構域相似。可溶的人VH結構域的CDR3區(圖14)相對於大羊駝和駱駝科VHH結構域和源自四聚體抗體的人VH結構域具有減少的淨電荷，同時與所有其它的比較荷電胺基酸數目增加。可溶的人VH結構域的CDR3區具有與大羊駝VHH極為相似的疏水性，但比在存在於正常人四聚體抗體和正常駱駝四價抗體中的VH結構域中所觀察到的低。結果顯示，在初始VDJ重組中，當與人四聚體(⑶R3)抗體比較時，選擇有較高荷電胺基酸數目的重組事件。接著在⑶Rl和⑶R2區和在所有三個框架區(FRl、FR2、FR3)中親和力成熟。這產生具有可溶的VH結構域的人只有重鏈的抗體，其與源自人四聚體抗體的 VH結構域比較，疏水性在FRl中提高但在FR3中降低。在FR2或CDRl和CDR2區中存在極小的差異。因此，總體圖式顯示，相對於可溶性較差且具有聚集傾向的源自四聚體抗體的VH 結構域，疏水性跨越可溶的VH結構域不同分布(移向FRl並離開FR3和CDR3)。該分析未顯示是否在VH結構域的特定位置或區中進行特定突變(參見實施例6)，但存在與跨越可溶的人VH結構域的電荷分布和疏水性有關的特徵，電荷分布和疏水性將它們與大羊駝和駱駝科VHH結構域和源自四聚體抗體的人VH結構域區分開。實施例6. 3D結構實施例4的分析表明，當放置在源自四聚體抗體的人VH結構域的三維結構上時， 初始VDJ重排後可溶的人VH結構域的框架區(FR1、FR2、FR3)中的變化主要集中於特定位置(圖15)。在可溶的人VH結構域中，從13-18位胺基酸觀察到FRl突變，其中普遍的變化在 13位，這導致提高疏水性，即使荷電胺基酸數目增加，但淨電荷未增加。重要的是，13位周圍的變化位於提高親水性(推測增加溶解性)的小環中。在可溶的人VH結構域的FR2中，在35位周圍存在明確中心，且一個在50位周圍， 當與源自人四聚體抗體的VH結構域比較時，總體疏水性沒有變化。相對於源自人四聚體抗體的VH結構域，可溶的VH結構域中FR3的變化與CDR2區末端和FR3的極末端(緊鄰CDR!3)周圍的區域一致。當將在源自HCAb的可溶的人VH結構域中觀察的這些變化疊加在VH結構域的3D 結構上時，立即明顯的是FR2突變發生在β摺疊中，β摺疊通常在四聚體抗體中構成VH與 VL結構域的相互作用表面。在FRl中，變化亦產生更疏水的結構域。結果表明，VH結構域的N-末端半部分具有提高的疏水性，以提高VH結構域的穩定性/溶解性，並補償輕鏈的不存在。相比之下，C末端半部分疏水性較弱。最重要的變化是疏水性圖式的「重新分布」(N 末端更疏水，C末端疏水性較弱，圖16)和影響以前輕鏈界面的框架突變。通過小鼠免疫系統進行的疏水性的總體移動和特定模體的變化使得能夠產生高親和力的可溶的只有重鏈的抗體和可溶的VH結構域，可溶的VH結構域具有將其與源自人四聚體抗體的傾向於聚集的VH結構域區分開的特徵。實施例7.人抗HA抗體的產生和表達克隆實施例7所用的免疫步驟如在實施例1和2中所述，除了用流感HA (Η3Ν2)作為抗原來進行免疫之外。通過將蛋白注射到包含完整人重鏈抗體基因座的轉基因小鼠中來進行免疫，其如在Janssens等(2006) PNAS，103，15130-15135中所述。這些小鼠攜帶4個人VH 區段、全部人重鏈D區、全部JH區和人C γ 2和C γ 3區(圖1)。業已從人Cy恆定區缺失CHl區，使得能夠如所述製備人只有重鏈的抗體 (Janssens等(2006)PNAS，103，15130-15135)。用標準方案免疫小鼠，並如圖17概略所示地分離抗體。免疫後，收集漿細胞，並通過標準方法針對存在CD138抗原和不存在譜系標記分選(FACS)(參見 Sanderson 等(1989) Cell Regulation 1，27-35 ；Kim 等(1994)Mol. Biol. Cell，5，797-805和參見Miltenyi Biotec用於小鼠CD138+漿細胞分離的磁分選試劑盒 (magnetic sorting Kit))。收集細胞，並用VH結構域特異性引物通過標準方法將mRNA逆轉錄並擴增為cDNA(例如Janssens等(2006)PNAS, 103，15130-15135)。所用引物在5，端， 且被設計為引入PvuII位點用於克隆目的(圖18)。3』端引物來自IgG2或IgG3CH2鉸鏈區，且被設計為具有BstEII位點。當這不可能時，用於IgG3的引物含有McI位點用於克隆目的(圖18)。將所得到的VH片段克隆到兩個哺乳動物表達載體中，載體含有CMV增強子和雞β-肌動蛋白啟動子，接著是Kozak和在VH區段本身(proper)的PvuII位點結束的VH3-23的信號序列。在第一載體(圖18)中，這接著是在CH2的鉸鏈區(從BstEII位點)開始的人IgG2，與CH2、CH3、終止密碼子和聚腺苷酸序列。在第二載體中，所有IgG2序列被等價的人IgG3序列取代。後者使得能夠用作為備選的Mel位點克隆不含有BstEII位點的HCAb。質粒的其餘部分具有標準哺乳動物細胞選擇標記，例如基於pUC的質粒中的潮黴素抗性盒。顯然，人IgG2或3可被來自人或任何其它物種的任何其它缺少CHl的恆定區取代。同樣很顯然，對於載體的VH部分一樣也是這樣。然後在PvuII和BstEII (或PvuII 和McI)位點之間克隆cDNA，並通過標準技術將載體轉染到大腸桿菌(E.coli)中。將菌落挑到含有細菌生長培養基的96 (或384)孔微量滴定板中。孵育板(通常> 10個)以使細菌生長和在各孔中製備DNA。隨後將來自各孔(即各完整板)的DNA加到含有哺乳動物 HEK細胞(或用於表達目的的其它細胞)的新的96孔板中，用於通過標準轉染試劑和方法轉化。轉化的細胞在基於表達質粒上存在的選擇標記(例如潮黴素)的選擇下生長。隨後通過標準ELISA測定對含有表達的抗體的培養基分析抗原特異性HCAb的存在情況。這可在相同96孔格式板中進行，但亦可在其它格式板例如通過微陣列進行，以節省待使用抗原的量。陽性孔立即鑑定含有編碼抗原特異性HCAb的人HCAb的質粒。圖19顯示來自免疫的小鼠血清的ELISA及96孔格式板中轉染的HEK細胞的ELISA實例。還總結HA克隆實驗， 在總計用960孔的實驗中，使用的cDNA不到一百萬。通過序列分析，這產生28種不同的抗原特異性抗體，落入13個組，源自VH區VH3-11(圖21)和VH3-23 (圖22)中的兩個。使用 IgG2(SSERKCCVE)和IgG3 (SSELKTPLG) 二者，VH區經歷高變，且與人相似，J4區使用頻率最高，但亦使用其它區。分泌的HCAb為可溶的且為單體，如通過它們在標準SMART柱上的洗脫曲線(圖23)所測定。抗體的親和力介於納摩爾到亞納摩爾親和力範圍，如通過Octet (圖 24)或BiaCore分析的標準結合和解離曲線所測定。突變和與其它免疫球蛋白序列比較的分析(圖25)產生如圖11-13所示的不同區的相同特性。如上所述，可將源自漿細胞的可溶的HCAb與可溶的VH結構域分離。實施例8來自單細胞的人HCAb的產生和表達克隆通過直接克隆到HEK細胞的以上所述方案的變體，將用於分選⑶138+譜系陰性細胞和獲得能直接克隆到HEK或其它哺乳動物細胞中的來自單細胞的cDNA(圖26)。這些將通過與上述極為相似的方法分析。實施例9來自單細胞的正常人重鏈和輕鏈(四聚體)抗體的產生和表達克隆通過表達克隆到HEK或其它哺乳動物細胞中，亦可將實施例8所示的方法變體用於直接克隆轉基因表達的正常四聚體抗體。在變體中，通過分選再次分離單細胞。RNA分離自單細胞，VH和VL結構域二者都經由PCR擴增克隆到與上述類似的重鏈和輕鍊表達載體中。將克隆的重鏈和輕鍊表達質粒的單獨組合一起轉染到HEK或其它哺乳動物細胞中。格式板、篩選和分析與上文對於HCAb 96孔格式板(實施例8和9)所述的完全類似。
權利要求
1.一種高親和力的抗原特異性的可溶的只有重鏈的抗體，其缺少特徵駱駝科相關胺基酸取代和具有未在包含重鏈和輕鏈的抗體中發現的FR2取代；顯示CDRl內的淨疏水性提高和CDR3中存在的荷電胺基酸數目增加；和包含導致FRl內的淨疏水性提高和FR3中存在的荷電胺基酸數目增加的框架β摺疊內的一個或多個胺基酸取代。
2.權利要求1的只有重鏈的抗體，其為人抗體。
3.權利要求2的只有重鏈的抗體，其缺少特徵駱駝科相關胺基酸取代和具有未在包含重鏈和輕鏈的人抗體中發現的FR2取代。
4.權利要求1-3中任一項的只有重鏈的抗體，其具有IOnM或更好的結合親和力。
5.一種高親和力的抗原特異性的可溶的VH結構域，其缺少特徵駱駝科相關胺基酸取代和具有未在包含重鏈和輕鏈的抗體中發現的FR2取代；顯示CDRl內的淨疏水性提高和CDR3中存在的荷電胺基酸數目增加；和包含導致FRl內的疏水性提高和FR3中存在的荷電胺基酸數目增加的框架β摺疊內的一個或多個胺基酸取代。
6.權利要求5的VH結構域，其為可溶的人VH結構域。
7.權利要求6的可溶的VH結構域，其缺少特徵駱駝科相關胺基酸取代和具有未在包含重鏈和輕鏈的人抗體中發現的FR2取代。
8.權利要求5-7中任一項的可溶的VH結構域，其具有IOnM或更好的結合親和力。
9.一種V基因區段，當與D基因區段和J基因區段重組並親和力成熟後，其編碼權利要求5-8中任一項的可溶的VH結構域。
10.權利要求9的V基因區段，其中相對於所述V基因區段的天然種系序列，通過至少一個取代、插入或缺失或其組合對所述V基因區段的序列進行工程改造，使得其包含編碼已顯示有助於VH結構域的溶解性和穩定性的胺基酸殘基或胺基酸序列的密碼子。
11.一種D基因區段，當與權利要求9或10的V基因區段和J基因區段重組並親和力成熟後，其編碼權利要求5-8中任一項的可溶的VH結構域。
12.權利要求11的D基因區段，其中相對於所述D基因區段的天然種系序列，通過至少一個取代、插入或缺失或其組合對所述D基因區段的序列進行工程改造，使得其包含編碼已確定有助於維持可溶的VH結構域的溶解性和穩定性的胺基酸殘基的密碼子，所述可溶的VH結構域包含由所述D基因區段編碼的序列。
13.一種J基因區段，當與權利要求9或10的V基因區段和D基因區段重組並親和力成熟後，其編碼編碼權利要求5-8中任一項的可溶的VH結構域。
14.權利要求13的J基因區段，其中相對於所述J基因區段的天然種系序列，通過至少一個取代、插入或缺失或其組合對所述J基因區段的序列進行工程改造，使得其包含編碼已確定有助於維持可溶的VH結構域的溶解性和穩定性的胺基酸殘基的密碼子，所述可溶的VH結構域包含由所述J基因區段編碼的序列。
15.一種異源只有重鏈的基因座，其包含一個或多個權利要求9或10的V基因區段、 一個或多個權利要求11或12的D基因區段、一個或多個權利要求13或14的J基因區段和一個或多個各編碼缺少CHl功能性的抗體恆定效應子區的恆定效應子區基因區段，其中排列所述基因區段，使得V、D和J基因區段和恆定區基因區段可重組，以產生編碼權利要求 1-4中任一項的高親和力的抗原特異性的可溶的只有重鏈的抗體的重排的親和力成熟的只有重鏈的基因座。
16.權利要求15的只有重鏈的基因座，排列所述只有重鏈的基因座以產生人只有重鏈的抗體或包含可溶的人VH結構域和來自另一物種的恆定區基因區段的雜合抗體。
17.權利要求15或16的只有重鏈的基因座，其中所述恆定區基因區段為齧齒動物來源，優選小鼠來源。
18.一種轉基因非人哺乳動物，其包含權利要求15-17中任一項的異源只有重鏈的基因座。
19.一種轉基因非人哺乳動物，其不表達任何功能性免疫球蛋白輕鏈基因，並包含異源只有重鏈的基因座，所述基因座包含一個或多個權利要求9或10的V基因區段、一個或多個權利要求11或12的D基因區段、一個或多個權利要求13或14的J基因區段和一個或多個各編碼包含CHl功能性的抗體恆定效應子區的恆定效應子區基因區段，其中排列所述基因區段，使得V、D和J基因區段和恆定區基因區段可重組，以產生編碼高親和力的抗原特異性的可溶的只有重鏈的抗體的重排的親和力成熟的只有重鏈的基因座。
20.權利要求19的轉基因非人哺乳動物，其中排列所述只有重鏈的基因座以產生人只有重鏈的抗體或包含可溶的人VH結構域和來自另一物種的恆定區基因區段的雜合抗體。
21.權利要求19或20的轉基因非人哺乳動物，其中所述恆定區基因區段為齧齒動物來源，優選小鼠來源。
22.權利要求18-21中任一項的轉基因非人哺乳動物，其為小鼠。
23.一種用於製備高親和力的抗原特異性的可溶的只有重鏈的抗體的方法，其包括用抗原攻擊權利要求18-22中任一項的轉基因非人哺乳動物。
24.權利要求23的方法，其中所述只有重鏈的抗體的可溶的VH結構域為人的。
25.一種用於獲得編碼只有重鏈的抗體鏈或可溶的VH結構域的核酸的方法，其包括 從包含只有重鏈的基因座的轉基因哺乳動物獲得長壽命的漿細胞或記憶B細胞，所述哺乳動物已被抗原攻擊；和從所述長壽命的漿細胞或記憶B細胞分離編碼對抗原特異的只有重鏈的抗體鏈或可溶的VH結構域的核酸。
26.權利要求25的方法，其中從抗原攻擊的非人轉基因哺乳動物的周圍淋巴腺、骨髓或脾純化所述長壽命的漿細胞或記憶B細胞。
27.權利要求25或沈的方法，其中用細胞的細胞表面標記純化所述長壽命的漿細胞或記憶B細胞。
28.權利要求27的方法，其中所述細胞表面標記為⑶138標記。
29.權利要求M-26中任一項的方法，其中從所述細胞分離mRNA群，並從所述mRNA群產生編碼只有重鏈的抗體或可溶的VH結構域的cDNA群。
30.權利要求四的方法，其中將所述cDNA群克隆到表達載體中；任選將克隆到cDNA表達載體中的序列轉染到所選擇的細菌中，擴增並挑取菌落，和純化重組載體DNA ；用所述表達載體轉化能夠表達、累積、分泌或呈遞由所述表達載體編碼的蛋白質的細胞系；和選擇表達、累積、分泌或呈遞識別所述抗原的只有重鏈的抗體鏈的細胞系。
31.權利要求25-27中任一項的方法，其中從所述細胞分離mRNA群，並從所述mRNA群產生編碼由所述細胞產生的任何抗體的VH結構域的cDNA群。
32.權利要求31的方法，其中將編碼由所述細胞產生的任何抗體的VH結構域的cDNA群克隆到表達載體中；用所述表達載體轉化能夠表達、累積、分泌或呈遞由所述表達載體編碼的蛋白質的細胞系；和選擇表達、累積、分泌或呈遞識別所述抗原的VH結構域的細胞系。
33.權利要求30或32的方法，其中所述細胞係為微生物細胞系或哺乳動物細胞系。
34.一種製備與抗原特異性結合的只有重鏈的抗體的方法，其包括(a)用所述抗原免疫非人轉基因哺乳動物，其中所述哺乳動物表達在轉錄和加工的重鏈mRNA中缺少CHl功能性的只有重鏈的抗體；(b)從所述免疫的哺乳動物分離長壽命的漿細胞或記憶B細胞；(c)從源自步驟(b)的細胞分離mRNA群；(dl)將源自步驟(c)的mRNA的cDNA群克隆到表達載體中，並在細胞系中表達所述 cDNA ；(el)選擇至少一個產生與所述抗原特異性結合的只有重鏈的抗體的細胞系；或(d2)將包含編碼源自步驟(c)的mRNA的VH結構域的cDNA的cDNA群克隆到表達載體中，以便在所述細胞系中表達可包含重鏈效應子區的VH融合蛋白；(e2)選擇至少一個產生與所述抗原特異性結合的VH融合蛋白的細胞系。
35.權利要求25-34中任一項的方法，其中在mRNA分離之前使分離的長壽命的漿細胞或記憶B細胞無限增殖化。
36.權利要求25-35中任一項的方法，其中任何只有重鏈的抗體基因座包含至少一個顯性選擇標記基因。
37.權利要求23或M的方法，其包括使來自所述哺乳動物的產生抗體的細胞無限增殖化的步驟。
38.權利要求35或37的方法，其中通過與骨髓瘤細胞融合使所述細胞無限增殖化。
39.權利要求35或37的方法，其中通過用病毒例如EBV轉化使所述細胞無限增殖化。
40.權利要求25-39中任一項的方法，其還包括步驟從產生所需抗原特異性的只有重鏈的抗體的B細胞或無限增殖化細胞系，分離所述可溶的VH結構域或編碼所述可溶的VH 結構域的核酸。
41.權利要求23-40中任一項的方法，其還包括步驟從由所述哺乳動物產生的產生只有重鏈的抗體的細胞，或從通過展示方法由所述哺乳動物產生的無限增殖化的產生只有重鏈的抗體的細胞，分離可溶的VH結構域或編碼可溶的VH結構域的核酸。
42.通過權利要求23-40中任一項的方法獲得的可溶的VH結構域或編碼可溶的VH結構域的核酸，在製備只有重鏈的抗體、VH胞內抗體、VH多蛋白、VH結構域複合體或VH融合體中的用途。
43.一種只有重鏈的抗體、VH胞內抗體、VH多蛋白、VH結構域複合體或VH融合體，其包含至少一個權利要求5-8中任一項的VH結構域。
44.一種只有重鏈的抗體、VH胞內抗體、VH多蛋白、VH結構域複合體或VH融合體，其包含至少一個權利要求5-8中任一項的VH結構域，並用於治療。
45.包含至少一個權利要求5-8中任一項的VH結構域的只有重鏈的抗體、VH胞內抗體、VH多蛋白、VH結構域複合體或VH融合體在製備藥物中的用途。
46.一種用於製備權利要求5-8中任一項的VH結構域的盒，其包含編碼FR1、FR2和 FR3的基因序列，其中所述編碼FRl和FR2及FR2和FR3的基因序列由使得能夠引入合適的 CDRl編碼序列和CDR2編碼序列的序列隔開，且在編碼FR3的序列的3』端存在使得能夠引入編碼CDR3編碼序列的序列的序列。
全文摘要
本發明提供一種高親和力的抗原特異性的可溶的只有重鏈的抗體，其缺少特徵駱駝科相關胺基酸取代和具有未在包含重鏈和輕鏈的抗體中發現的FR2取代；顯示CDR1內的淨疏水性提高和CDR3中存在的荷電胺基酸數目增加；和包含導致FR1內的淨疏水性提高和FR3中存在的荷電胺基酸數目增加的框架β摺疊內的一個或多個胺基酸取代。本發明亦提供具有同樣性質的VH結構域、用於其製備的基因區段、用於其製備的方法、轉基因動物和VH結構域的抗體在治療中的用途。
文檔編號C07K16/28GK102482342SQ201080023562
公開日2012年5月30日 申請日期2010年3月19日 優先權日2009年3月24日
發明者D·德拉貝克, E·德博爾, F·G·格羅斯維德, R·W·詹森斯, 羅傑·金登·克雷格, 陳韜 申請人:伊拉茲馬斯大學鹿特丹醫學中心, 羅傑·金登·克雷格