表面錨著載體及其用於外源蛋白質的系統的製作方法

2023-07-26 05:58:26 1

專利名稱：表面錨著載體及其用於外源蛋白質的系統的製作方法
技術領域：
本發明涉及含冰成核蛋白(INP)基因片段的表面錨著載體，它能將外源蛋白質表達到細胞表面。
且本發明涉及使用INP在細胞表面製備外源蛋白質的方法及以該表面表達系統製備的外源蛋白質的應用。
具體地說，本發明涉及表面錨著載體，在細胞表面製備外源蛋白質的方法及其應用，它使用細胞外膜蛋白，來自丁香假單胞菌，一種革蘭氏陰性菌的冰成核蛋白(INP)。
背景技術：
目前，在諸如噬菌體，細菌、酵母等的單細胞生物中研究了蛋白質的表面表達以產生新疫苗，進行各種抗原和抗體的篩選以及將有用的酶定位到細胞表面。
為了穩定地生產疫苗已嘗試蛋白質的表面表達首先在細胞表面表達抗原性肽。迄今，為了產生疫苗，將病原菌任意突變並進行篩選以選擇能穩定誘導免疫的安全細菌。然而，該篩選方法的缺陷是當疫苗經口服施用進入體和動物體時喪失抗原活性。因此，已進行了許多研究以克服這一缺陷。
首先，已進入的表面表達使用的方法是，採用革蘭氏陰性細菌中的細胞表面蛋白的基因片段，將它連接到抗原性多肽的基因上並用於轉化合適的細菌宿主以有效地生產融合蛋白質。由該方法製備的融合蛋白質可作為有效的抗原，因為它們穩定地伸出細胞表面。特別是在革蘭氏陰性細菌中，外膜脂多糖(LPS)增加了在細胞表面表達的蛋白質的抗原性。
為了在細胞表面表達蛋白質，分泌信號在蛋白質的一級序列內是必須的，它幫助細胞內產生的外源蛋白質穿過細胞膜。特別是在革蘭氏陰性細菌中，蛋白質應穿過細胞內膜和周質空間，穩定地定位於細胞外膜上並向外伸出。例如，表面蛋白質，特異性的酶和毒素蛋白質具有將蛋白質定位到細胞表面的分泌信號和靶向信號。實際上，經過使用該分泌信號，靶向信號等與合適的啟動子組合能成功地將外源蛋白質表達到細胞表面。
迄今，存在於革蘭氏陰性細菌的表面蛋白主要用於生產必需在細胞表面的外源多肽。有4類用於細胞表面表達的蛋白質，如細胞外膜蛋白，脂蛋白，分泌蛋白和細胞表面結構蛋白。作為細胞外膜蛋白，LamB，phoE，OmpA等已用於表面表達。然而，在這些情況下，表達到細胞表面的蛋白質的大小是有限的，因為蛋白質應插入從細胞表面伸出的環內。另外，還因為外源蛋白質的C-和N-端在三維結構上應互相靠近。因此，當兩個末端之間的距離較長時，應將C-和N-端連接。
實際上，如果LamB或PhoE用於插入包含超過50-60個胺基酸的外源多肽時，由於結構限制，不能穩定地生產膜蛋白[Charbit等，免疫學雜誌，1391658-1664(1987)；Agterberg等，疫苗，885-91(1990)]。為了克服結構限制，使用含有將外源蛋白質定位到細胞外膜的最小靶向序列的部分OmpA蛋白質，儘管完整的OmpA蛋白質也用於將外源蛋白質插入到伸出的環中。使用上面描述的方法，經過與OmpA蛋白質C端靶向序列融合將β-丙醯胺酶表達到細胞表面上。在這種情況下，OmpA片段輔助的蛋白質表達並結合到細胞表面上，與OmpA N末端融合的大腸桿菌脂蛋白LPP的信號序列幫助將該蛋白質定位到細胞外膜上[Francisco等，美國科學院學報(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，4892713-2717(1992)]。
因此，使用外膜蛋白的細胞表面表達應在細菌中進行，所使用的方法是將選定的外膜蛋白在基因水平與外源蛋白質融合，該方法用於誘導融合蛋白的生物合成，穩定地穿過內膜並維持外源蛋白質與外膜的結合。因此，上膜蛋白作為表面錨著基序必需滿足下述要求。外膜蛋白應當(i)具有分泌信號，融合蛋白能以其穿過細胞內膜，(ii)具有靶向信號，該蛋白質能以其結合於細胞外膜上，(iii)在細胞表面大量表達及(iv)不管蛋白質的大小如何均能穩定表達。然而，尚未形成滿足所有這些要求的任何細胞表面錨著基序且僅存在上面的缺陷。
脂蛋白作為一種表面蛋白也已用於表面表達。具體地說，大腸桿菌脂蛋白能因其N端的分泌信號通過細胞內膜且因未端L-半醯氨酸經共價結合能直接定位於外或內膜脂類上。另外，由於主要脂蛋白LPP在N端結合於細胞外膜且在C端結合於細胞層，肽葡聚糖上，與外膜OmpA片段連接的外源蛋白質能穩定地分泌到細胞外膜用於表面表達[Francisco，等，美國科學院學報4892713-2717(1992)]。經過使用脂蛋白的特徵，已採用另一脂蛋白TraT將諸如脊髓灰質炎病毒C3抗原決定基等的多肽表達到細胞表面上[Felici等，分子生物學雜誌，222301-310(1991)]。另外，尚未確切地了解其功能的肽葡聚糖相關性脂蛋白(PAL)也已用來在細胞表面表達重組抗體[Fuchs等，生物/技術，91369-1372(1991)]。在這種情況下，PAL在C端與肽葡聚糖相連，在N端與重組抗體相連以便在細胞表面表達融合蛋白。
分泌蛋白質，如穿過細胞外膜的表面蛋白質已用於表面表達。然而，在革蘭氏陰性細菌中，分泌蛋白質未被很好地開發，僅有一些分泌蛋白質經輔助特異性分泌過程的蛋白質參與穿透細胞外膜。例如，來自克雷白氏桿菌屬種類的支鏈澱粉酶在N端用脂成份取代，結合到細胞外膜上並分泌進細胞培養基中。Kornacker等試圖經過使用支鏈澱粉酶的N端片段在細胞表面表達β-內醯胺酶。不幸的是，支鏈澱粉酶-β內醯胺酶融合蛋白立即結合到細胞表面並分泌進細胞培養基。另外，以上述方法已嘗試使用了鹼性磷酸酶，周質空間蛋白。但鹼性磷酸酶不能穩定地表達到細胞表面，因為在分泌過程中必需14種以上的蛋白質[Kornacker等，分子微生物學，41101-1109(1990)]。
IgA蛋白酶來自病原微生物奈瑟氏球菌屬並具有獨特的分泌機制。IgA蛋白酶的C-末端β-片段具有一個信號，N端蛋白酶可以其定位到細胞外膜上。蛋白酶到達細胞外膜在細胞表面伸出後，伸出的蛋白酶經自發水解分泌進細胞培養基。經過使用IgA蛋白酶的β片段，Klauser等也穩定地將12kDa的霍亂毒素B亞基表達在細胞表面上[Klauser等，EMBO J.，91991-1999(1990)]。然而，融合蛋白的分泌受到抑制，因為在分泌過程中在周質空間誘導蛋白質摺疊。
另外，存在於細胞表面的其它細胞表面結構，如鞭毛，傘毛，菌毛等可用於表面表達。經過使用鞭毛蛋白，鞭毛的一種結構亞基，分別穩定地表達了霍亂毒素B亞基和來自B型肝炎病毒的其它肽，且這些肽分別與抗體強烈地結合[Newton等，科學，24470-72(1989)]。經過使用菌毛蛋白，一種在細胞表面象線一樣存在的菌毛的結構蛋白，也表達了外源蛋白質。結果，僅成功地表達了小肽[Hedegaard等，基因，85115-124(1989)]。
除了革蘭氏陰性細菌的表面蛋白質外，最近已嘗試用革蘭氏陽性細菌的表面蛋白質在細胞表面表達外源蛋白質[Samuelson等，細菌學雜誌，1771470-1476(1995)]。另外，穿過細胞內膜並結合到細胞膜上的表面錨著基序是必需的。實際上來自Straphylo coclushyicus的脂酶分泌信號和來自金黃色葡萄球菌的蛋白A膜結合基質用於將外源蛋白質表達到細胞表面。結果，包含80個胺基酸的瘧疾血液階段抗源和來自鏈球菌屬G蛋白的白蛋白結合蛋白質有效地在革蘭氏陽性細菌的細胞表面表達。
在對上面所述的革蘭氏陰性和革蘭氏陽性細菌的表面表達中，已形成了一些用於蛋白質表達的有用的系統。在最近3年中，這些系統已在美國歐洲、日本等國申請並作為專利權進行了登記，特別是登記了使用革蘭氏陰性細菌的細胞外膜5個申請。另外，使用菌毛，一種細胞表面結構的一個申請和使用一種細胞表面脂蛋白的一個申請已登記。
本發明人研究了冰成核蛋白質(INP)，一種來自丁香假單胞菌KCTC1832的表面蛋白質作為新表面錨著基序並建立了含INP並有效地在細胞表面表達外源蛋白質的新表面錨著載體，在細胞表面製備外源蛋白質的方法及其使用。
本發明概述本發明的目的是利用冰成核蛋白質(INP)的特徵提供用於表面表達的表面錨著載體。特別是本發明的載體含有INP在其一級序列中所具有的分泌信號和靶向信號。
而且本發明的目的是提供用於製備外源蛋白質的方法，它使用INP特徵的表面錨著載體並將外源蛋白質表達到細胞表面上。
更具體地說，本發明提供了製備外源蛋白質的方法，其中即使不破碎細胞或分離也能方便地利用蛋白質，因為該蛋白質表達到了表面。
另外，本發明可提供表達到細胞表面的外源蛋白質的應用，它包含有效地生產抗體和抗原及生產用於篩選抗原，結合或吸附蛋白質，生理學激活物等的文庫。例如表達到細胞表面的果聚糖蔗糖酶可用於有效地生產果聚糖。
所有的含有來自丁香假單胞菌KCTC1832的INP基因的表面錨著載體可在本發明的範圍內。
而且本發明的表面錨著載體可應用於所有的細菌宿主。優選該宿主可選自革蘭氏陰性細菌，更優選大腸桿菌，醋桿菌屬種類，假單胞菌屬種類，黃單胞菌屬種類，歐文氏桿菌屬種類和Xymomonas sp.。
所有使用這些細菌的製備方法可在本發明的範圍內。
在具體的實施方案中，構建了pANC3載體(保藏號KCTC0326BP)，其中含有來自丁香假單胞菌KCTC1832的中央重複區缺失的INP基因且由於插入了C-端限制性位點而易於克隆外源基因。
另外，可將所有或一些限制性位點插入INP的C端，且含這些限制性位點的所有表面錨著載體可在本發明的範圍內。
在具體實施方案中，構建了pANC3-CM2重組載體，其中含有中央重複區缺失的INP基因且在INP基因的C端連接CMCase基因的N端以融合蛋白的形式將CMCase產生到細胞表面上。
在具體實施方案中，構建了pGINP21M載體(保藏號KCTC0239BP)，其中含有INP基因且由於插入了C端限制性位點而易於克隆外源基因。
而且在具體實施方案中，構建了pASCM1重組載體(保藏號KCTC0237BP)，其中含有INP基因且在INP基因的C端連接羧甲基纖維素酶(CMCase)基因的N端以融合蛋白的形式將CMCase產生到細胞表面上。
另外在具體實施方案中，構建了pASLP1重組載體，其中也含有INP基因且在INP基因C端連接脂酶基因的N端代替CMCase基因以融合蛋白質的形成將脂酶產生到細胞表面。
且在具體實施方案中，構建了pASIg1重組載體，其中也含有INP基因且在INP基因的C-端連接單鏈Fv抗體基因的N端代替CMCase基因以融合蛋白的形成將單鏈Fv抗體產生到細胞表面上。
且在具體實施方案中，構建了pSSTS109重組載體，其中也含有INP基因且連接果聚糖蔗糖酶基因以融合蛋白質的形式將果聚糖蔗糖酶產生到細胞表面上。
附圖的簡要描述

圖1顯示了pGINP21M載體的限制性圖譜，它含有INP基因及在INP基因C端限制性位點。
圖2顯示了pASCM1重組載體的限制性圖譜，它含有CMCase基因且將CMCase表達到細胞表面上。
圖3圖示說明了從pASCM1重組載體的大腸桿菌轉化子表達到細胞表面的CMCase的活性，分別比較了在洗滌的細胞，培養基和破碎的細胞中的活性。
圖4以脂裂解程度說明了從pASALP1重組載體的大腸桿菌轉化子表達到細胞表面的脂酶的活性。
圖5說明了經過進行ELISA方法從pASIg1重組載體的大腸桿菌轉化子表達到細胞表面的單鏈Fv抗體與抗原的結合活性。
圖6顯示了含有重複區缺失的INP基因的pANC3載體的限制性圖譜。
圖7說明了從pANC3-CN2重組載體的大腸桿菌轉化子表達到細胞表面的CMCase的活性。
圖8顯示了從pANC3-CM2重組載體的大腸桿菌DH5α轉化子的免疫螢光染色。左側組(A和C)顯示了pZL8載體和pSSTS109重組載體的大腸桿菌轉化子的光學顯微照片，右側組(B和D)分別顯示了上述大腸桿菌轉化子的共焦點螢光顯微照片。
圖9顯示了在完整細胞系統中蔗糖向果聚糖的生物轉化，其中利用了pSSTS109重組載體的大腸桿菌DH5α轉化子。優選實施方案的詳細描述冰成核蛋白，一種細胞外膜蛋白在假單胞菌屬種類，歐文氏桿菌屬種類，黃單胞菌屬種類等中發現且具有在過冷的水中誘導冰形成的獨特功能。
考慮到來自各種類型的細菌的INP基因的序列，特別是有8個胺基酸單位在INP中央區域是重複的。預期該單位象冰顆粒一樣提供排列過冷的水的框架。且特異性胺基酸序列分別存在於INP的N-和C-端。預期該序列是分泌信號和靶向信號，INP可以其通過細胞內膜。特別是INP N端在結合到細胞外膜中發揮作用。
INP由超過1,200個胺基酸組成且其分子量是118kDa。一級胺基酸序列由N端特有的胺基酸(佔總蛋白質序列的4％)和中央重複區(佔總蛋白質序列的81％)組成。特別是8個胺基酸單位在中央INP區域內精確重複122次。
Green等經過使用在該蛋白質3個不同區域的INP基因突變體研究了INP的生理功能[Gren，等，分子普通遺傳學，215165-172(1988)]。結果，鑑定了INP的中央重複單位的長度影響冰成核活性。缺乏重複特徵減小或喪失冰成核活性且僅減小中央區域的長度保留冰成核活性。因此，如果不考慮蛋白質的分泌和靶向，預期重複區域將過冷的水分子排列到鄰近INP以形成冰顆粒結構。且預期INP的N端在結合到細胞外膜上發揮作用。即使當INP的N端完全裂解，仍保留冰成核活性。然而，預期INP的C端在將INP分泌並靶向到細胞外膜上起作用。由於C端的裂解而完全減小了冰成核活性。
作為表面表達基質，INP具有許多來自其一級胺基酸序列，其結構及其特徵的優勢。首先，INP大量表達到細胞表面上。其次，表達到細胞表面的INP在細胞生長的靜止期保持穩定。第三，INP位於細胞外膜上且暴露於外表面。第四，外源蛋白質和細胞表面間的距離便於調節，因為根據外源蛋白質的大小，INP中央重複單位的長度可變化。第五，由於INP在大範圍的革蘭氏陰性細菌中是一種穩定表達的酶，革蘭氏陰性細菌的各種宿主可用於表面表達。
為了構建含INP基因的表面錨著載體，使用含有所需基因的pGINP21(保藏號KCTC8608P)質粒。在INP C端，切下翻譯終止密碼子，以聚合酶鏈式反應(PCR)插入3個新限制性位點，如Bam HI，SmaI和EcoRI，它提供外源蛋白質基因的插入位點。結果，構建了pGINP21M載體(保藏號KCTC0239BP)(見圖1)，其中上面提到的任意限制性酶位點對於經基因操作構建釋譯密碼閱讀框來插入外源蛋白是可能的。
另外，可構建在INP C-端含全部或一些限制性位點的各種載體。
以上面的方法構建的表面錨著載體含有原始INPDNA序列且表達INP。且當外源蛋白質基因在框架中連接到INP C端時，可表達融合蛋白質且穩定地結合到細胞表面。
對於表面錨著載體的有效性，應鑑定外源蛋白質的合成，穿過細胞內膜並結合到細胞表面。因此，外源蛋白質基因在閱讀框中連接到INP基因上，轉化進細菌宿主以誘導表達且鑑定融合蛋白質表達到細胞表面上。
經過使用以上述方法構建的pGINP21M載體，構建了pASCM1重組載體(保藏號KCTC0237BP)以便將來自革蘭氏陰性細菌，芽孢桿菌屬種類的羧甲基纖維素酶(CMCase)表達到細胞表面。羧甲基纖維素酶基因的N-端390bp DNA從含該基因的pUC19載體獲得[ParK，等，酶微生物學技術，8(12)725-728(1986)]並插入pGINP21M載體中。然後從不同pUC19載體獲得CMCase的C-端DNA片段並插入上述製備的載體中以構建pASCM1重組載體(見圖2)。
為了將CMCase酶表達到細胞表面上，用pASCM1重組載體轉化大腸桿菌，培養並誘導表面表達。然後，使用羧甲基纖維素酶作底物檢測CMCase活性。結果，分別在洗滌的完整大腸桿菌細胞和破碎的大腸桿菌細胞中本發明的酶活性相似。因此，預期總酶活性僅出現在伸出細胞表面的CMCase中。由於羧甲基纖維素分子量太高難以穿透細胞外膜，因此將細胞表面表達的CMCase與溶於底物溶液的羧甲基纖維素接觸可出現酶活性。由於細胞培養基不顯示CMCase活性，表明CMCase很少從細胞表面分離且限制了酶活性(見圖3)。
已構建了含INP的pASLP1重組載體以便將來自革蘭氏陰性細菌，假單胞菌屬種類的脂酶表達到細胞表面。經過進行pCR從pJH92質粒(Jung Kook Hoon，生物科學部，Ph D Thesis，KIST，1990)獲得脂酶基因且與用Bam HI和Eco RI消化的pASCM1重組載體連接以構建產生INP與脂酶的融合蛋白的pASLP1重組載體。
為了將脂酶表達到細胞表面，用pASLP1重組載體轉化大腸桿菌，培養並誘導表面表達。然後，以醋酸銅方法測量脂酶活性。與缺乏脂酶的宿主細胞相比，在將脂酶表達到細胞表面的轉化大腸桿菌中出現更高的脂酶活性。因此，將脂酶表達到細胞表面的宿主細胞可直接用於雙相脂水解(見圖4)。
已構建含INP基因的pASIg1重組載體以表達單鏈Fv抗體。從能在大腸桿菌中以分泌蛋白生產抗體的pLUV2質粒獲得單鏈Fv抗體基因並以上述方法插入以構建pASIg1重組載體。
為了將單鏈Fv抗體表達到細胞表面，轉化大腸桿菌，培養並誘導表面表達。然後，以測量抗原與表面表達的抗體的結合程度的ELISA(酶聯免疫吸附)法鑑定單鏈Fv抗體的表面表達。
已構建了含INP基因的pSSTS109重組載體(保藏號KCTC0327 BP)以表達果聚糖蔗糖酶。用pZL8載體進行PCR獲得果聚糖蔗糖酶基因，亞克隆進pT7 Blue(R)載體，然後插入本發明的pGINP21M載體中。
為了將果聚糖蔗糖酶表達到細胞表面上，轉化大腸桿菌，培養並誘導表面表達。經過進行免疫螢光染色獲得果聚糖蔗糖酶的表面表達(見圖8)。
另外，表達到細胞表面的果聚糖蔗糖酶可用於從蔗糖方便且有效地生產果聚糖(見圖9)。
為了構建含重複區缺失的INP基因的表面錨著載體，已誘變了INP基因以缺失中央重複區。
將編碼INP N端特異性區域，前2個重複亞基，最後3個重複亞基和C端特異性區域的基因片段精確克隆到pKK223-3質粒載體tac啟動子下遊。結果，構建了pANC3載體(保藏號KCTC0326BP)(見圖6)。
經過使用以上述方法構建的pANC3載體，已構建了pANC3-CM2重組載體以表達CMCase到細胞表面上。以上述方法測量CMCase活性(見圖7)。
如上所述，本發明的表面表達系統有效地生產有用的酶和抗體。上面表達的外源蛋白質作為例子說明了使用INP的表面表達，但不是為了限制本發明。以本發明的細胞表面表達系統可將任何外源蛋白質表達到細胞表面上。
下面的實施例將進一步說明本發明，而不限制本發明。
實施例實施例1用於表面表達的pGINP21M載體的構建為了構建含INP基因的表面錨著載體，使用含克隆的INP基因的pGINP21質粒(7.1kb)(保藏機構韓國生物科學和生物技術研究所；保藏號KCTC86089，保藏日期1994年7月13日)。為了提供外源蛋白質基因的插入位點，經PCR反應插入3個新的限制性位點。結果，以PCR機器擴增了從Kpn位點到INP基因C末端的大約1.7kb的片段。
使用SEQ.ID.No.1和SEQ.ID.No.2引物。合成SEQ.ID.No.1引物以插入KpnI限制性位點，合成SEQ.ID.No.2引物以依次插入諸如Bam HI，Sma I和Eco RI的3個限制性位點。插入的限制性位點有利於基因擴增後亞克隆INP基因。以PCR機器擴增的基因片段用限制性酶Kpn I和Eco RI消化，並插入已用Kpn I和EcoRI消化的pGINP21載體中。結果，構建了pGINP21M載體(見圖1)，其中插入了新限制性位點代替INP基因的翻譯終止密碼子。pGINP21M載體的大小是7.1kb。用本發明的pGINP21M載體轉化大腸桿菌，轉化的大腸桿菌於1997年3月28日保藏於KRIBB，KIST(保藏號KCTC0239BP)。
實施例2pASCM1重組載體的構建構建pASCM1重組載體，它使用INP並可在細胞表面表達CMCase。
為了將CMCase基因插入pGINP21M載體用於表面表達，用BamHI和EcoRI消化該載體，也用BamHI和EcoRI消化含CMCaseN端390bp DNA的PVLC19通用克隆載體。上面製備的2個DNA片段與DNA連接酶連接以構建pGINP21CM1質粒。然後，經過用Eco RI消化從另一PVLC19載體的Eco RI位點獲得CMCase的C端DNA片段並插入含CMCase N-端的pGINP21CM1質粒的EcoR1位點。結果，將完整的CMCase基因連接到INP基因的C端。上面製備的pASCM1重組載體在圖2中顯示。用本發明的pASCM1重組載體轉化大腸桿菌，轉化的大腸桿菌於1997年3月22日保藏於KRIBB，KIST(保藏號KCTC0237BP)。
實施例3CMCase的表面表達用pASCM1重組載體經大腸桿菌，在含100ml LB培養基和抗生素，100mg/L氨苄青黴素的500ml燒瓶中培養並誘導表面表達。
然後，使用羧甲基纖維素作底物經DNS方法測量CMCase活性。具體地說，1％(W/V)羧甲基纖維素溶於50mM檸檬酸緩衝液中以製備底物溶液。加入0.5ml該底物溶液與0.5ml酶溶液充分混合併在雙層熱水貯槽中60℃加溫30分鐘進行反應。然後，加入3ml DNS溶液，它經過將7.5g 2，5-二硝基水楊酸，14.0g NaOH，216.1gRochel鹽，5，4g苯酚和5.9g Na2S2O5依次溶於1L純水中製備。底物溶液與DNS溶液在沸水中反應5分鐘，然後在冰水中冷卻。使用室溫的冷卻溶液測550nm的吸光率。經過與葡萄糖的標準曲線比較計算釋放的還原糖量。1單位的酶表示1分鐘釋放1μM葡萄糖的酶量。
結果，當洗滌後的完整大腸桿菌細胞和破碎的大腸桿菌細胞用作酶來源時，兩種情況的酶活性相似。
實施例4重組載體pASLP1的構建構建pASLP1重組載體，它使用INP並能在細胞表面表達脂酶。
用Bam HI和Eco RI消化實施例2中製備的PASCM1重組載體，去掉CMCase基團以製備表面的pJH92質粒並經PCR技術操作以插入Bam HI和Eco RI限制性位點。因此，經過用Bam HI和Eco RI消化該pJH92載體可獲得脂酶基因並連接進上面製備的表面錨著載體上。結果，構建了pASLP1重組載體，它能以融合蛋白質的形式表達INP和脂酶。
實施例5脂酶的表面表達以氯化鈣方法用pASLP1重組載體轉化大腸桿菌，以實施例3所述的相同方法培養並誘導表面表達。然後，以下面所述的醋酸銅方法測量表達到細胞表面上的脂酶活性。5ml大腸桿菌培養液與溶於5ml異辛烷的5％的橄欖油底物混合併在40℃反應1小時。然後，懸浮溶液和油相，用1ml醋酸銅試劑處理3ml懸浮溶液並劇烈搖動。然後，測量反應混合物在715nm下的吸光率。此時，預期吸光率越高，酶活性越高，因為降解了更多的油產生酸性酯。結果，測量的表達到細胞表面的脂酶活性在圖4中表示。
實施例6pASIg1重組載體的構建構建pASIg1重組載體，它使用了INP並能將人類化的單鍵Fv抗體表達到細胞表面。為了製備脂酶基因，用Sal I和Eco RI消化含單鏈Fv抗體基因且能作為分泌蛋白產生該抗體的pLUV2質粒並連接到一個合成寡核苷酸上以加入一個新的Bg1 II限制性位點代替Sal I位點。用Eco RI和Bam HI消化實施例2製備的pASCM1重組載體以去掉用於表面表達的CMCase基因並連接到用Bgl II和Eco RI消化的單鏈抗體基因上。結果，構建了pASIG1重組載體，它能以融合蛋白的形式表達INP和單鏈Fv抗體。
實施例7單鏈Fv抗體的表面表達。
用pASIg1重組載體轉化大腸桿菌並以實施例3所述的相同方法誘導表面表達。然後，以測量抗原與表面表達的抗體的結合程度的ELLSA方法鑑定表達到細胞表面的單鏈Fv抗體的活性。在表達抗體的細胞和僅含表達載體的細胞中分別比較了抗原結合的程度。
調節各細胞使具有相同的濃度，收穫，用PBS緩衝液洗滌(pH7.4)並用1.4ml相同的緩衝液重懸。將這些懸浮溶液分成25，50，100，200和250μl的批次，然後與能結合抗體(H69k)的臨界濃度的pre-S2抗原混合併在室溫下反應2小時。然後在室溫下離心結合的溶液2分鐘並將所得的上清液加入ELISA板上覆蓋過夜。此時，加入計算量的抗體H69k並以如下的ELISA方法測量覆蓋的抗體量。
經過使用含2％牛血清白蛋白的TBS-T緩衝液
封閉覆蓋過夜的平板2小時並用TBS-T緩衝液洗滌。然後，加入10ng第一抗體H69k，反應2小時並用相同的緩衝液洗滌以去掉未結合的抗體。用1000倍的緩衝液稀釋與辣根過氧化物酶結合的第二抗體並反應。加入H2O2作過氧化物酶的底物且OPD作顯色劑以誘導顯色且經過使用硫酸終止該反應。然後，測量在492nm下的吸光率並轉換成對不含細胞的空白的100％吸光率的百分數。結果，與對照細胞的抗原結合進行比較，結果如圖5所示。
實施例8含果聚糖蔗糖酶基因的pSSTS109重組載體的構建構建pSSTS109重組載體，它使用INP並能將果聚糖蔗糖酶表達到細胞表面。
將果聚糖蔗糖酶基因插入本發明的pGINP21M載體中。使用pZL8載體[Song和Rhee，生物技術通訊，161305-1310(1994)]作模板進行PCR以擴增果聚糖蔗糖酶。此時分別與開架閱讀框(ORF)上遊和下遊序列互補且含有新的限制性酶位點，即ORF起點為Bam HI位點，終點為Sma I和Eco RI位點的寡核苷酸SEQ.ID.No.3和SEQ.ID.No.4用作引物。將PCR產物有效地亞克隆進pTT Blue(R)載體(Novagen Co.，USA)。用Bam HI-Eco RI消化亞克隆的果聚糖蔗糖酶基因並插入用相同酶消化的pGINP21M載體中。
結果，製備pSSTS109重組載體，轉化大腸桿菌DH5α，且轉化的大腸桿菌於1997年3月27日保藏於KRIBB，KIST(保藏號KCTC 0327 BP)。
實施例9果聚糖蔗糖酶的表面表達用pSSTS109重組載體轉化大腸桿菌並以實施例3所述的相同方法誘導表面表達。
表面錨著的果聚糖蔗糖酶的物理觀察在圖8中提供。用果聚糖蔗糖酶反應抗體和FITC抗記的第二抗體的免疫螢光染色該果聚糖蔗糖酶。有效染色的陽性反應細胞如圖8(D)所示，而陰性反應細胞末染色(見圖8(B))。這是INP能指導外源蛋白質表達到細胞外膜且作為表面錨著基序有用的直接證據。
實施例10經過使用表面表達系統將蔗糖生物轉變為果聚糖已報導了經過使用果聚糖蔗糖酶使蔗糖經酶轉變為果聚糖[Song和Rhee，生物技術通訊，161305-1310(1994)]。生物轉化的最適溫度為10℃，在10％蔗糖溶液中的最高產率為46％。洗滌經過使用INP錨著基序在其表面表達果聚糖蔗糖酶的完整細胞，然後用於以最大產量直接形成果聚糖，如果將它們重懸於10℃的乙酸緩衝溶液(pH5.5)中無需分離酶或製備細胞溶胞產物(見圖9)。
起始細胞濃度較低，如1.3 OD600nm。由於果聚糖蔗糖酶的比活足夠高，該細胞密度適用於生物轉化。在12天反應期間精確水解77％的所加入的蔗糖並聚合成果聚糖(51.1g/l)。此時從上述蔗糖溶液釋放並積累未聚合的葡萄糖(77g/l)。與這些陽性細胞的結果相比，在胞質空間含果聚糖蔗糖酶的陰性細胞在反應期間不能將蔗糖轉變為果聚糖。結果，僅檢測到少量的葡萄糖，如2.13g/l，無可測量的果聚糖量。因此證實了用洗滌的完整細胞形成的果聚糖由表面暴露的果聚糖蔗糖酶的反應引起。
實施例11含重複區缺失的INP的pANC3載體的構建為了構建含重複區缺失的INP基因的表面錨定載體，已誘變了INP基因使缺失中央重複區。
將編碼INP N端特異性區域(175個胺基酸殘基)，前2個重複亞基(32個胺基酸殘基)，後3個重複亞基(48個胺基酸殘基)和INP的C端特異性區域(49個胺基酸殘基)的重組DNA精確放在pKK223-3質粒載體tac啟動子下遊(Pharmacia.Co.，Sweden)，產生表面錨定載體，pANC3(見圖6)。
用本發明的pANC3載體轉化大腸桿菌，轉化的大腸桿菌於1997年3月27日保藏於KRIBB，KIST(保藏號KCTC 0326 BP)。
實施例12pANC3-CM2重組載體的構建構建pANC3-CM3重組載體，它使用重複區缺失的INP且能在細胞表面表達CMCase。
經過進行實施例2的相同程序將CMCase基因也亞克隆進pANC3載體以製備表面錨著載體pANC3-CM2。
實施例13用重複區缺失的INP表面表達CMCaseINP是具有內部重複區的大型多肽，該重複區對於運輸到細胞外膜可能是不必要的。按實施例12所述也將CMCase基因亞克隆進pANC3錨著載體，製備pANC3-CM2重組載體。用pANC3-CM2重組載體轉化大腸桿菌JM109菌株。經過進行實施例3相同的程序測定轉化的大腸桿菌JM109細胞表面的總CMCase活性。
洗滌細胞後經測量完整細胞CMCase活性來證實(見圖7)。在42℃生長的細胞顯示出比在37℃生長的細胞具有更高水平的CMCase活性。在生長的早期靜止期其活性達到最大點，然後其活性在幾小時內下降。
結果證實INP的N端和/或C端區在其本身一級序列上具有分泌和靶向信號，因為缺乏INP中央重複區的INP也引導CMCase到細胞表面。
在本發明中製備的pGINP21M載體和pANC3載體有效地表達CMCase脂酶，人類化的單鏈Fv抗體，果聚糖蔗糖酶等到大腸桿菌的細胞表面。該載體具有如下所述的極大的優勢。表達的蛋白質不被稀釋，因為該蛋白質濃度位於細胞表面。僅經過洗滌細胞就能容易地鑑定該表達，因為細胞破碎或蛋白質分離或純化不是必需的。
使用INP特性的本發明的載體對於克隆外源蛋白基因是有用的，因為在INP的一級序列中除了分泌信號和靶向信號外，INP的中央重複區的長度可根據需要發生變化。因此，該載體所具有的顯著優勢是外源蛋白質和細胞表面間的距離可便於調節。
本發明的製品的方法使用了INP的特性且能不管細胞周期而穩定表達外源蛋白質。它能應用於各類細菌宿主。另外，表面表達因為大量表達到細胞表面而有利於外源蛋白質的鑑定。
本發明的表面表達系統可用於有效地生產重組外源蛋白質，它包括各種抗原，抗體，酶，結合或吸附蛋白，用於篩選生理學激活劑的肽文庫等。由於該系統具有廣泛的應用，所以它可用於生產新疫苗，抗肽抗體，用於分離微生物的吸附劑，位於細胞表面的酶等。
尤其是表達到細胞表面的果聚糖蔗糖酶對於從蔗糖生產果聚糖是非常有用的，日本發明的該方法可有效地用於生物轉化。
序列描述(1)一般信息(iii)序列數4個(2)SEQ ID No.1的信息(i)序列特徵(A)長度25個鹼基對，(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線型(ii)分子類型寡核苷酸(iii)序列描述SEQ ID No.1AAGTA CAGGT ACCGCAGGTC ACGAG(2)SEQ ID No.2的信息(i)序列特徵(A)長度34個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線型(ii)分子類型寡核苷酸(iii)序列描述SEQ ID No.2GGAGTGCTTG AATTCCCCGG GATCCTTTAC CTCT(2)SEQ ID No.3的信息(i)序列特徵(A)長度25個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線型(ii)分子類型寡核苷酸(iii)序列描述SEQ ID No.3GGATCCGATG TTGAATAAAG CAGGC(2)SEQ ID No.4的信息(i)序列特徵(A)長度28個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線型(ii)分子類型寡核苷酸(iii)序列描述SEQ ID No.4GATTCCGGGA ATCAGAAACG AAACGTCA
權利要求
1.一種表面錨著載體，它含有冰成核蛋白質(INP)的基因片段。
2.根據權利要求1的表面錨著載體，其中INP來自丁香假單胞菌KCTC1832。
3.根據權利要求2的表面錨著載體，它含有包括N端分泌信號和C端靶向信號的INP的基因片段。
4.根據權利要求3的表面錨著載體，其中INP基因的長度在INP的中央重複區中是可變的。
5.根據權利要求2的表面錨著載體，它含有用於插入外源基因的在INP基因C端的限制性位點。
6.根據權利要求4或權利要求5的表面錨著載體，它是pANC3克隆載體。
7.經過用權利要求6的pANC3克隆載體轉化大腸桿菌製備的轉化子(保藏號KCTC0326BP)。
8.根據權利要求5的表面錨著載體，它是pGINP21M克隆載體。
9.經過用權利要求7的pGINP21M克隆載體轉化大腸桿菌製備的轉化子(保藏號KCTC0239BP)。
10.用於表面表達的重組載體，其中外源蛋白質的基因插入權利要求6的表面錨著載體。
11.根據權利要求10的pANC3-CM2重組載體，其中外源蛋白質包括用於表面表達的CMCase。
12.用於表面表達的重組載體，其中的外源蛋白質基因插入權利要求8的表面錨著載體中。
13.根據權利要求12的pASCM1重組載體，其中外源蛋白質包括用於表面表達的CMCase。
14.根據權利要求12的pASLP1重組載體，其中外源蛋白質包括用於表面表達的脂酶。
15.根據權利要求12的pASIG1重組載體，其中外源蛋白質包括用於表面表達的人類化的單鏈Fv抗體。
16.根據權利要求12的pSSTS109重組載體，其中的外源蛋白質包括用於表面表達的果聚糖蔗糖酶。
17.經過用權利要求10或權利要求12的重組載體轉化宿主細胞製備的轉化子。
18.根據權利要求17的轉化子，其中的宿主細胞包括大腸桿菌，醋桿菌屬種類，假單胞菌屬種類，黃單胞菌屬種類，歐文氏桿菌屬和Xymomonas sp.。
19.根據權利要求17的轉化子，它經過用權利要求11的pANC3-CM2重組載體轉化大腸桿菌JM109獲得。
20.根據權利要求17的轉化子，它經過用權利要求13的pASCM1重組載體轉化大腸桿菌JM109獲得(保藏號KCTC0237BP)。
21.根據權利要求17的轉化子，它經過用權利要求14的pASLP1重組載體轉化大腸桿菌JM109獲得。
22.根據權利要求17的轉化子，它經過用權利要求15的pASIG1組載體轉化大腸桿菌JM109獲得。
23.根據權利要求17的轉化子，它經過用權利要求16的pSSTS109重組載體轉化大腸桿菌DH5α獲得(保藏號KCTC0327BP)。
24.一種製備外源蛋白質的方法，包括如下步驟a)培養權利要求17的轉化子。b)以融合蛋白的形式將外源蛋白質與INP表達到細胞表面。
25.根據權利要求24的用於製備外源蛋白質的方法，其中的外源蛋白質是果聚糖蔗糖酶。
26.根據權利要求17的製備外源蛋白質的方法，其中外源蛋白質的大小可經過調節INP中央重複區的INP基因長度而變化。
27.以權利要求24的方法製備的外源蛋白質的應用，包括抗體，酶，抗原，結合蛋白質，吸附蛋白質和肽文庫。
28.根據權利要求27的外源蛋白質的應用，其中的外源蛋白質是果聚糖蔗糖酶，它可用於使用權利要求23的轉化子來製備果聚糖。
全文摘要
本發明涉及表面錨著載體,用於製備外源蛋白質到細胞表面的方法及其應用,它使用了來自革蘭氏陰性細菌,丁香假單胞菌的細胞外膜蛋白,冰成核蛋白(INP)。
文檔編號C12N9/42GK1185809SQ97190288
公開日1998年6月24日 申請日期1997年4月2日 優先權日1996年4月2日
發明者潘在龜, 鄭興採, 樸勝煥, 韓文熙, 樸英薰 申請人:韓國科學技術研究院