L-胺基酸氧化酶的製作方法

2023-07-25 23:26:01 2

專利名稱：L-胺基酸氧化酶的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種新的L—胺基酸氧化酶，其具有廣範圍的底物專一性，並可從Trichoderma harzianum獲得。本發明的酶可用於各種情況的過氧化氫的原位(in situ)產生，並可以很好地與底物一起摻入洗滌劑組合物中，該組合物還含有過氧化物酶系，用於抑制洗滌過程中染料從一種染色織物傳遞到其它織物。
洗滌程序中漂白劑的應用以及其用作洗滌劑組合物的成份在本領域已眾所周知。因此，漂白劑被摻入許多商品洗滌劑組合物中或被作為單獨的製劑出售，洗滌時將其加入洗滌劑中。
混合入洗滌劑組合物的漂白劑大多常為過氧化氫的前體。過硼酸鹽和過碳酸鹽是最重要的用作漂白劑的化合物的例子。
向洗滌劑中加入漂白劑的最初目的是為了獲得並保持衣料大體上潔白，更準確地說，是為了漂白上面的汙跡，如茶、咖啡、果汁、紅酒等。
後來要求含有過氧化氫或過氧化氫衍生的漂白體系能夠減少染料的轉移，即防止由於從染色織物上脫掉多餘的染料而造成的褪色及染料在其它織物上的附著。但最近含有過氧化氫源和過氧化物酶的體系已公開，參見如國際專利申請WO 91/05839。該專利申請所報導的一個過氧化氫源的可能性是氧化酶體系，即氧化酶與其底物在一起的體系。當然，這種氧化酶必須能與洗滌基質共存，尤其是與過氧化物酶體系。
GB 2015532中報導了來自綠色木黴(trichoderma viride)、對L—賴氨酸具有高度底物專一性的L—胺基酸氧化酶。
現已發現，具有廣範圍的底物專一性的新的L—胺基酸氧化酶可由Trichoderma harzianum獲得。該新型酶具有原位產生過氧化氫的優良性質。
因此，本發明提供一種L—胺基酸氧化酶(E.C.1.4.3.2)，其在15pH範圍內的最適pH值為8.5至9.5(L—精氨酸存在時20°C下保溫20分鐘後測定)，pH9.5時相對於初始活力pH穩定性為80％或更高(在沒有底物存在時40℃下保溫1小時後測定)，並且對L—精氨酸、L—賴氨酸、L—蛋氨酸、L—天冬醯胺、L—苯丙氨酸及L—亮氨酸均具活性。
另一方面，本發明提供了一種製備本發明L—胺基酸氧化酶的方法，該方法包括，在含有碳源、氮源及無機鹽的合適的培養基中培養L—胺基酸氧化酶的生產菌株Trichoderma harzianum，然後對所需要的酶進行回收。
再一方面，本發明提供一種含有本發明L—胺基酸氧化酶的洗滌劑添加劑，該添加劑以顆粒形式提供，優選無粉塵顆粒，以液體尤其是穩定化液體，漿或保護的酶的形式提供。
還有一方面，本發明提供一種含有本發明L—胺基酸氧化酶和該氧化酶底物的洗滌劑組合物。
根據用於專利程序目的的國際承認的微生物的保藏的布達佩斯條約，菌株Trichoderma harzianum，A611於1993年2月22日保藏於Centraal Bureau Voor Schimmelcultures(CBS)，Oosterstraat 1，3740 AG Baarn Netherlands，保藏號AccessionNo.CBS 223.93。
參考附圖對本發明作進一步的說明，其中

圖1表明本發明L—胺基酸氧化酶的pH—活力曲線(％活力)；圖2表明本發明L—胺基酸氧化酶的pH穩定性(％殘餘活力)；圖3表明本發明L—胺基酸氧化酶的溫度穩定性(％殘餘活力)；圖4A—4B表明與pHBS(促進劑)結合的過氧化物酶對本發明L—胺基酸氧化酶活力的影響(4A為無pHBS時情況；4B為50μM pHBS存在時情況)；圖5表明以灰蓋鬼傘過氧化物酶(cip)和過氧化氫或L—胺基酸氧化酶(AAO)在pH 8.5、35℃時對甲基橙(8μM)染料的漂白過程(時間持續以秒計，465nm下；110nM Cip，230μM H2O2；210nM Cip，1mM L—亮氨酸，16μg/ml AAO；310nM Cip，53μM pHBS，1mM L—亮氨酸，16μg/mlAAO；410hM Cip，53μM pHBS，230μM H2O2)；圖6表明以灰蓋鬼傘過氧化物酶(Cip)和過氧化氫或L—胺基酸氧化酶(AAO)在pH 8.5 35℃時對甲基橙(8μM)染料的漂白過程(時間延續以秒計，465nm下；116μg/ml AAO；1mM L—亮氨酸；232μg/ml AAO，1mM L—亮氨酸；3230μM H2O2)。
本發明提供可由下述性質來描述的新的L—胺基酸氧化酶(E.C.1.4.3.2)。物理—化學性質本說明書的實施例3描述了L—胺基酸氧化酶製劑的主要性質。
本發明L—胺基酸氧化酶在pH小於7至pH約為12的範圍內均顯示出活性。酶的最適pH值在pH8至10間，尤其是在pH8.5至9.5間，在pH9附近，這是在L—精氨酸存在時室溫下保溫20分鐘後所測定的結果。
本發明L—胺基酸氧化酶在pH7—9.5範圍內相對於初始活力的pH穩定性高於80％。在pH10下，本發明L—胺基酸氧化酶相對於初始活力的pH穩定性高於70％，優選高於80％，這是在40℃下、不存在底物、保溫1小時後測定的結果。
本發明L—胺基酸氧化酶在低於22℃至高於60℃的溫度範圍內是穩定的。在25℃至60℃範圍內該酶相對於初始活力的溫度穩定性高於80％。
本發明L—胺基酸氧化酶對L—精氨酸，L—賴氨酸，L—蛋氨酸，L—天冬醯胺，L—苯丙氨酸及L—亮氨酸均顯示活性。免疫化學性質本發明L—胺基酸氧化酶具有和來自菌株T.harzianumA611，CBS 223.93的那些L—胺基酸氧化酶完全相同或部分相同(即至少部分相同)的免疫化學性質。
免疫化學性質可用免疫學上的交叉反應一致性試驗來測定。通過眾所周知的Ouchterlong雙免疫擴散程序或根據Axelsen N.H.的tandem交叉免疫電泳(Handbook of Immunoprecipitation—In—Gel Techniques；Blackwell Scientific Publications(1983)，Chapters 5 and 14)進行一致性試驗。術語「抗原一改性」和「部分抗原一致性」描述於同一本書，第5、19和20章。
根據上述參考文獻通過用本發明的純化的L—胺基酸氧化酶對兔子進行免疫來產生單一特異性抗血清。免疫原與弗氏佐劑混合併每兩周給兔子皮下注射一次。8周整個免疫期後得到抗血清，由此製得的免疫球蛋白如前面Axelsen N.H.所述。酶的製備通過在含有碳源、氮源和無機鹽的合適的培養基中培養L—胺基酸氧化酶的生產菌株Trichoderma harzianum，然後回收所需要的酶來獲得本發明的L—胺基酸氧化酶。
在優選實例中，對菌株T.harzianum A611.CBS 223.93或其突變體或其變異體進行培養。
本發明的L—胺基酸氧化酶也可通過重組DNA技術來獲得。工些應用本發明的L—胺基酸氧化酶可以與其底物一起用於需原位產生過氧化氫的生產工藝中。
因此，在優選實例中，本發明的L—胺基酸氧化酶可很好地摻入洗滌劑組合物中，尤其是含有過氧化物酶系的洗滌劑組合物，如用於在洗滌過程中抑制染料的傳遞或改善衣物洗滌劑的漂白效果。
在其它優選實例中，本發明的L—胺基酸氧化酶可摻入牙膏中或用於化妝品的保存。
在另一實例中，本發明L—胺基酸氧化酶可用於廢水處理工藝中，用於造紙工業中紙漿的漂白，用於處理紙漿生產中的廢水以及用於木質素的改良，如用在刨花板生產中。POD體系在過氧化物酶系(POD體系)中需要使用本發明L—胺基酸，以形成過氧化氫。
本發明中，POD體系是一種包含一種具有過氧化物酶活性的酶、一種過氧化氫源和可選擇的一種過氧化物酶增強劑的體系。此過氧化物酶系已用來抑制染料的轉移，並已描述於例如國際專利申請WO 92/18687和WO 92/18683。
在這樣的過氧化物酶系中，具有過氧化物酶活性的酶可以是任一過氧化物酶，包含由酶分類為EC 1.11.1.7或任一其衍生而來的片斷，具有過氧化物酶活性(如卟啉環系或微過氧化物酶，參見如國際專利申請WO 91/05858和WO 92/16634)。已知這些酶來自微生物、植物和動物。
過氧化物酶可由植物生產(如辣根過氧化物酶)或由微生物如真菌或細菌生產。優選地，過氧化物酶來自鬼傘屬，如灰蓋鬼傘或長根鬼傘或來自芽孢桿菌屬，如短小芽孢桿菌，特別是國際專利申請WO 91/05858中的過氧化物酶。
過氧化物酶還可以是一種由重組DNA技術生產的酶。特別地，重組生產的過氧化物酶是源於鬼傘屬菌株，特別是國際專利申請WO 92/16634中的長根鬼傘或灰蓋鬼傘的過氧化物酶。
在過氧化物酶系中，過氧化氫源可以是過氧化氫或過氧化氫的前體，如過碳酸鹽或過硼酸鹽，或產生過氧化氫的酶系，如氧化酶及該氧化酶的底物。
在過氧化物酶系中，增強劑可以是可氧化的底物如金屬離子或酚化合物如7—羥基香豆素(7HCm)，香草醛(VAN)和對一羥基苯磺酸鹽(pHBS)，其描述於如國際專利申請WO 92/18683和WO 92/18687，和Kato M和Shimizu S，Plant Cell Physiol.198526(7)，pp.1291—1301(詳見表1)或Saunders B C等，Peroxidase，London，1964，P.141ff。洗滌劑組合物根據本發明，L—胺基酸氧化酶通常可作為洗滌劑組合物的成份。即它能以無粉塵顆粒、穩定的液體或已保護的酶的形式包括在洗滌劑組合物中。無粉塵顆粒可以按US4,106,991和4,661,452(兩者均為Novo Industri A/S)公開的方法生產，並可選擇地按本領域已知方法包覆。蠟質包覆材料的例子是平均摩爾量為1000至20000的聚環氧乙烷產品(聚乙二醇，PEG)；具有16至50個環氧乙烷單元的乙氧基壬基酚；乙氧基脂肪醇，其中醇含有12至20個碳原子，並有15至80個環氧乙烷單元；脂肪醇；脂肪酸；以及脂肪酸的單酸甘油酯、甘油二酯和甘油三酯。適於流化床技術的膜形成包覆材料的例子由專利GB 1483591給出。液體酶製劑可以按已知方法通過加入多羥基化合物來達到穩定，如丙二醇，糖或糖醇，乳酸或硼酸。其它酶穩定劑在本領域已熟知。可根據EP 238,216揭示的方法製備保護的酶。
本發明的洗滌劑組合物可以呈任一方便的形式如粉末狀、顆粒狀、糊狀或液體。液體洗滌劑可以是水溶液，一般含有上限至70％的水和0—30％的有機溶液，或是非水溶液。
洗滌劑組合物包含一種或多種表面活性劑，其可為陰離子、非離子、陽離子或兩性離子表面活性劑。洗滌劑通常含有0—50％的陰離子表面活性劑，如線型烷基苯磺酸鹽(LAS)，α—烯屬磺酸鹽(AOS)，烷基硫酸鹽(脂肪族醇硫酸鹽)(AS)，脂肪醇乙氧基硫酸鹽(AEOS或AES)，二級鏈烷磺酸鹽(SAS)，α—磺基脂肪酸甲酯，烷基—或烯基琥珀酸或皂。洗滌劑也可含有0—40％的非離子表面活性劑，如脂肪醇乙氧基化物(AEO或AE)，羧化的脂肪醇乙氧基化物，壬基酚乙氧基化物，烷基聚苷，烷基二甲基氧化胺，乙氧基脂肪酸單乙醇醯胺，脂肪酸單乙醇醯胺或多羥基烷基脂肪酸醯胺(如與WO 92/06154中所描述的一樣)。
另外，洗滌劑組合物還可包含一種或多種其它酶，如澱粉酶，脂肪酶，角質酶，蛋白酶，纖維素酶，過氧化物酶和其它氧化酶。
特別地，本發明提供一種洗滌劑的添加劑。通過分別加入一種或多種酶的各添加劑或加入含所有這些酶的組合添加劑，洗滌劑組合物中可包括這些酶。
在另一特別的實例中，本發明提供了一種洗滌劑添加劑和一種洗滌劑組合物，其還包含一種該L—胺基酸氧化酶的底物。
適宜的底物可以是L—精氨酸，L—賴氨酸，L—蛋氨酸，L—天冬醯胺，L—苯丙氨酸和L—亮氨酸中的一種或多種。
洗滌劑中可包含1—65％的洗滌助洗劑或配位劑，如沸石、二磷酸、三磷酸、膦酸，檸檬酸，次氮基三乙酸(NTA)，乙二胺四乙酸(EDTA)，二亞乙基三胺五乙酸(DTMPA)，烷基或烯基琥珀酸，可溶性矽酸鹽或多層式矽酸鹽(如得自Hoechst的SKS—6)。洗滌劑還可以是未復配洗滌劑，即基本不含洗滌助洗劑。
洗滌劑可包含一種或多種聚合物，例如羧甲基纖維素(CMC)，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，聚乙二醇(PEG)，聚乙烯醇(PVA)，聚羧酸酯如聚丙烯酸酯，馬來酸/丙烯酸共聚物以及月桂異丁烯酸/丙烯酸共聚物。
洗滌劑可包含一種漂白體系，該體系可包含一種H2O2源，如過硼酸鹽成過碳酸鹽，其可以與四乙醯乙二胺(TAED)或壬醯氧基苯磺酸鹽(NOBS)這樣的形成過酸類漂白的活化劑結合。可選擇地，漂白體系可以包含如醯胺、醯亞胺或碸形式的過氧酸。
本發明洗滌劑組合物的酶可以用常規穩定劑穩定，如多羥基化合物象丙二醇或甘油，糖或糖醇、乳酸、硼酸或硼酸衍生物如芳香硼酸酯，並且組合物可按WO 92/19709和WO 92/19708中所述方法配製。
洗滌劑還可包含其它常規洗滌劑成份，如織物調理劑，包括粘土、泡沫促進劑、抑泡劑、防蝕劑、汙垢懸浮劑、防塵再沉澱劑、染料、殺菌劑、螢光增白劑或香料。
pH(在水溶液中，使用濃度下測定)通常為中性或鹼性，如7—11。
本發明範圍內的洗滌劑組合物的特殊形式包括1)配製成堆積密度至少為600g/l的顆粒狀的洗滌劑組合物，其包含—線型烷基苯磺酸鹽(以酸計算)7—12％—脂肪醇乙氧基硫酸鹽(如C12-18醇，1—2EO)或烷基硫酸鹽(如C16-18) 1—4％—脂肪醇乙氧基化物(如C14-15醇，7EO)5—9％—碳酸鈉(Na2CO3) 14—20％
—可溶性矽酸鹽(Na2O，2SiO2) 2—6％—沸石(NaAlSiO4) 15—22％—硫酸鈉(Na2SO4) 0—6％—檸檬酸鈉/檸檬酸(C6H5Na3O7/C6H8O7) 0—15％—過硼酸鈉(NaBO3·H2O) 11—18％—TAED 2—6％—羧甲基纖維素 0—2％—聚合物(如馬來酸/丙烯酸共聚物，PVP，PEG) 0—3％—酶0—5％—小成份(如抑泡劑，香料，螢光增白劑，光漂白劑) 0—5％2)配製成堆積密度至少為600g/l的顆粒狀的洗滌劑組合物，其包含—線型烷基苯磺酸鹽(以酸計算) 6—11％—脂肪醇乙氧基硫酸鹽(如C12-18醇，1—2EO)或烷基硫酸鹽(如C16-18) 1—3％—脂肪醇乙氧基化物(如C14-15醇，7EO) 5—9％—碳酸鈉(Na2CO3)15—21％—可溶性矽酸鹽(Na2O，2SiO2) 1—4％
—沸石(NaAlSiO4) 24—34％—硫酸鈉(Na2SO4)4—10％—檸檬酸鈉/檸檬酸(C6H5Na3O7/C6H8O7) 0—15％—羧甲基纖維素0—2％—聚合物(如馬來酸/丙烯酸共聚物，PVP，PEG) 1—6％—酶 0—5％—小成份(如抑泡劑，香料) 0—5％3)配製成堆積密度至少為600g/l的顆粒狀的洗滌劑組合物，其包含—線型烷基苯磺酸鹽(以酸計算)5—9％—脂肪醇乙氧基化物(如C12-15醇，7EO) 7—14％—脂肪酸皂(如C16-22) 1—3％—碳酸鈉(Na2CO3)10—17％—可溶性矽酸鹽(Na2O，2SiO2) 3—9％—沸石(NaAlSiO4) 23—33％—硫酸鈉(Na2SO4)0—4％—過硼酸鈉(NaBO3·H2O) 8—16％—TAED2—8％—膦酸(如EDTMPA) 0—1％—羧甲基纖維素0—2％
—聚合物(如馬來酸/丙烯酸共聚物，PVP，PEG) 1—3％—酶 0—5％—小成份(如抑泡劑，香料，螢光增白劑) 0—5％4)配製成堆積密度至少為600g/l的顆粒狀的洗滌劑組合物，其包含—線型烷基苯磺酸鹽(以酸計算)8—12％—脂肪醇乙氧基化物(如C12-15醇，7EO) 10—25％—碳酸鈉(Na2CO3)14—22％—可溶性矽酸鹽(Na2O，2SiO2) 1—5％—沸石(NaAlSiO4) 25—35％—硫酸鈉(Na2SO4)0—10％—羧甲基纖維素0—2％—聚合物(如馬來酸/丙烯酸共聚物，PVP，PEG) 1—3％—酶 0—5％—小成份(如抑泡劑，香料) 0—5％5)含水的液體洗滌劑組合物，其包含—線型烷基苯磺酸鹽(以酸計算)15—21％—脂肪醇乙氧基化物
(如C12-15醇，7EO或C12-15醇，5EO) 12—18％—脂肪酸(如油酸)皂 3—13％—烯基琥珀酸(C12-14) 0—13％—氨基乙醇 8—18％—檸檬酸 2—8％—膦酸 0—3％—聚合物(如PVP，PEG) 0—3％—硼酸鹽(B4O7) 0—2％—乙醇 0—3％—丙二醇 8—14％—酶 0—5％—小成份(如分散劑，抑泡劑，香料，螢光增白劑) 0—5％6)含水的液體洗滌劑組合物，其包含—線型烷基苯磺酸鹽(以酸計算) 15—21％—脂肪醇乙氧基化物(如C12-15醇，7EO或C12-15醇，5EO) 3—9％—脂肪酸(如油酸)皂 3—10％—沸石(NaAlSiO4) 14—22％—檸檬酸鉀 9—18％—硼酸鹽(B4O7) 0—2％—羧甲基纖維素 0—2％—聚合物(如PEG，PVP) 0—3％
—結合聚合物-3％如月桂基異丁烯酸/丙烯酸共聚物；摩爾比為25∶1；MW 3800 0—3％—甘油 0—5％—酶0—5％—小成份(如分散劑，抑泡劑，香料，螢光增白劑) 0—5％7)配製成的堆積密度至少為600g/l的顆粒狀洗滌劑組合物，其包含—脂肪族醇的硫酸酯 5—10％—乙氧基脂肪酸單乙醇醯胺3—9％—脂肪酸皂 0—3％—碳酸鈉(Na2CO3) 5—10％—可溶性矽酸鹽(Na2O，2SiO2) 1—4％—沸石(NaAlSiO4) 20—40％—硫酸鈉(Na2SO4) 2—8％—過硼酸鈉(NaBO3·H2O)12—18％—TAED 2—7％—聚合物(如馬來酸/丙烯酸共聚物，PEG) 1—5％—酶 0—5％—小成份(如螢光增白劑，抑泡劑，香料) 0—5％8)配製成的顆粒狀洗滌劑組合物，其包含
—線型烷基苯磺酸鹽(以酸計算) 8—14％—乙氧基脂肪酸單乙醇醯胺 5—11％—脂肪酸皂 0—3％—碳酸鈉(Na2CO3) 4—10％—可溶性矽酸鹽(Na2O，2SiO2) 1—4％—沸石(NaAlSiO4) 30—50％—硫酸鈉(Na2SO4) 3—11％—檸檬酸鈉(C6H5Na3O7) 5—12％—聚合物(如PVP，馬來酸/丙烯酸共聚物，PEG) 1—5％—酶 0—5％—小成份(如抑泡劑，香料) 0—5％9)配製成的顆粒狀洗滌劑組合物，其包含—線型烷基苯磺酸鹽(以酸計算) 6—13％—非離子表面活性劑 1—4％—脂肪酸皂 2—6％—碳酸鈉(Na2CO3)14—22％—沸石(NaAlSiO4) 18—32％—硫酸鈉(Na2SO4)5—20％—檸檬酸鈉(C6H5Na3O7)3—8％—過硼酸鈉(NaBO3·H2O) 4—9％—漂白活化劑(如NOBS或TAED) 1—5％
—羧甲基纖維素 0—2％—聚合物(如聚羧酸酯或PEG) 1—5％—酶 0—5％—小成份(如螢光增白劑，香料) 0—5％10)含水的液體洗滌劑組合物，其包含—線型烷基苯磺酸鹽(以酸計算)15—23％—脂肪醇乙氧基硫酸鹽(如C12-15醇，2—3EO) 8—15％—脂肪酸乙氧基化物(如C12-15醇，7EO或C12-15醇，5EO) 3—9％—脂肪酸(如月桂酸)皂 0—3％—氨基乙醇1—5％—檸檬酸鈉5—10％—水溶助長劑(如甲苯磺酸鈉)2—6％—硼酸鹽(B4O7) 0—2％—羧甲基纖維素0—1％—乙醇1—3％—丙二醇 2—5％—酶 0—5％—小成份(如聚合物，分散劑，香料，螢光增白劑) 0—5％11)含水的液體洗滌劑組合物，其包含
—線型烷基苯磺酸鹽(以酸計算) 20—32％—脂肪醇乙氧基化物(如C12-15醇，7EO或C12-15醇，5EO)6—12％—氨基乙醇 2—6％—檸檬酸8—14％—硼酸鹽(B4O7)1—3％—聚合物(如馬來酸/丙烯酸共聚物，結合聚合物如月桂基異丁烯酸/丙烯酸共聚物和CMC)0—3％—甘油 3—8％—酶0—5％—小成份(如水溶助長劑，分散劑，香料，螢光增白劑) 0—5％12)配製成的堆積密度至少為600g/l的顆粒狀洗滌劑組合物，其包含—陰離子表面活性劑(線性烷基苯磺酸鹽，烷基硫酸鹽，α—烯屬磺酸鹽，α—磺基脂肪酸甲酯，鏈烷磺酸鹽，皂) 25—40％—非離子表面活性劑(如脂肪醇乙氧基化物) 1—10％—碳酸鈉(Na2CO3) 8—25％
—可溶性矽酸鹽(Na2O，2SiO2) 5—15％—硫酸鈉(Na2SO4) 0—5％—沸石(NaAlSiO4) 15—28％—過硼酸鈉(NaBO3·4H2O) 0—20％—漂白活化劑(TAED或NOBS)0—5％—酶0—5％—小成份(如香料，螢光增白劑)0—3％13)如1)—12)中所述洗滌劑配方，其中，用烷基硫酸鹽(C12—C18)代替線型烷基苯磺酸鹽—或其一部分。
14)如1)—13)中所述的洗滌劑配方，其包含一種被穩定的或被包封的過酸，來作為添加成份或作為已指定的漂白體系的替代物。
15)如3)，7)，9)和12)所述的洗滌劑組合物，其中的過硼酸鹽成份用過碳酸鹽替代。
16)配製成的非水溶液形式的液體洗滌劑組合物，其包含一種液體非離子表面活性劑，如線型烷氧基化伯醇，一種助洗劑體系(如磷酸)，酶和鹼。洗滌劑也可包含陰離子表面活性劑和/或漂白體系。
本發明L—胺基酸氧化酶能以常規濃度摻入洗滌劑。本發明的洗滌劑組合物中，L—胺基酸氧化酶加入量可為每升洗滌液相應的酶為0.001—100mg。
下列這實施例進一步說明本發明，在任何意義上其都不限制權利要求書中所要求保護的本發明範圍。
實施例1培養實施例該實施例說明了本發明製備L—胺基酸氧化酶產品的方法。
種子培養物在500ml折流式搖瓶中進行培養繁殖。搖瓶中盛有250ml培養基，其中含有2.4％玉米浸液，2.4％葡萄糖和0.4％CaCO3。培養基滅菌後，以來自瓊脂斜面培養基上的菌株T.harzianum A611，CBS 223.93的菌絲體進行接種。然後搖瓶於26℃搖床上保溫約70小時。
來自該種子培養物的接種物接種於2升的發酵罐，其具有滅菌空氣源和葉輪攪拌裝置。發酵罐中盛有1.2升培養基，其含有10％玉米浸液，0.5％葡萄糖，0.5％(NH4)SO4，0.07％KH2PO4，0.2％L—精氨酸和1.0％CaCO3。盛有培養基的發酵罐在120℃高壓滅菌60分鐘。
接種後，發酵過程中培養基溫度保持在28℃，通入空氣速率為0.8體積的空氣/體積培養基/分鐘。攪拌速率為900轉/分鐘。在起初的24小時內通過滴加25％葡萄糖和2.5％H3PO4溶液將發酵培養基的pH值保持在6.0。從24小時起，pH值變為5.8，並在發酵過程中保持於此值。發酵進行約96小時。這時獲得產量約為每升250mg酶蛋白。
實施例2純化實施例調節按實施例1得到的2.7升培養液的pH至5.0，過濾除去不溶性物質。以懸浮於1升50mM醋酸緩衝液(pH5.0)中的約270g固體Ca3(PO4)來吸附L—胺基酸氧化酶。室溫下攪拌2小時後，過濾漿液，用pH8.0約750ml的0.1M磷酸鈉洗脫吸附的蛋白。通過超濾，洗脫緩衝液變為pH7的20mM磷酸鈉。最後洗脫液濃縮至200ml。膜截留分子量為10,000Da。
將該樣品置於Q Sepharose Fast Flow柱子上，柱子先用20mM磷酸鈉(pH7.0)進行平衡。以2個柱體積的同一緩衝液清洗柱子並用0至1M NaCl的20mM磷酸鈉(pH 7.0)溶液進行梯度洗脫。收集具有L—胺基酸氧化酶活性的級份。收集的蛋白以SDS—PAGE確定純度。
純化的L—胺基酸氧化酶的比活力為16u/mg，其是在pH8.5的50mM磷酸緩衝液中20℃下以1mM L—精氨酸為底物時測定的。一個酶單位每分鐘形成1μmnol的過氧化氫。假設280nm下測定的光密度為1的L—胺基酸氧化酶溶液含有1mg蛋白/ml，由此來計算蛋白的量。L—胺基酸氧化酶的產量約為每升培養基中有50mg的純蛋白。
實施例3性質實施例使用微滴板來進行如前述實施例得到的L—胺基酸氧化酶的性質的測定。微滴板在下述的溫度和時間間隔下進行保溫。
過氧化物酶活力以過氧化物酶單位(PODU)表示，在標準條件下(即pH7.0，溫度30℃；反應時間3分鐘)每分鐘催化1μmol過氧化氫轉化所用的酶量確定為1個單位。使用基於ABTS(2，2』—連氮雙(3—乙基苯並三唑啉—6—磺酸鹽))為發色團的分析方法測定活力，產生的綠藍色在418nm下測定吸光度。
在下述性質實施例中，使用灰蓋鬼傘過氧化物酶(Cip)進行過氧化氫的檢測，過氧化物酶根據WO 92/16634而得。在4.5PODU/ml水平和0.4mM ABTS的pH7.0的磷酸緩衝液中檢測。過氧化氫濃度以相對於新製備的過氧化氫標準溶液來確定。最適pH測定分兩步進行。第一步，在不同pH條件下L—胺基酸氧化酶與1mM的L—精氨酸在100mM磷酸緩衝液中保溫20分鐘。第二步，產生的過氧化氫以上述方法進行檢測。
結果示於圖1。正如該試驗所測定的，本發明L—胺基酸氧化酶在pH低於7至PH約12的範圍內均顯示出活性。酶的最適pH範圍為pH8至10。pH穩定性L—胺基酸氧化酶在不同的pH下於40℃在50mM的磷酸緩衝液中保溫1小時。稀釋後，用上述的兩步法測定殘餘活力。
結果示於圖2。正如此試驗所測定的，本發明的L—胺基酸氧化酶在pH7—9.5範圍內，pH穩定性相對於初始活力而言高於80％。在pH10下本發明L—胺基酸氧化酶的pH穩定性相對於初始活力而言高於70％，優選高於80％。溫度穩定性在不同溫度下，L—胺基酸氧化酶在pH8.5的磷酸緩衝液中保溫1小時。稀釋後，使用上述兩步法測定殘餘活力。
結果示於圖3，正如本試驗所測定的，本發明L—胺基酸氧化酶在低於22℃至高於60℃的溫度範圍內是穩定的。在25℃至60°C間該酶顯示的溫度穩定性相對於初始活力而言高於80％。底物專一性以不同的L—胺基酸作底物來測定L—胺基酸氧化酶的活力。室溫下，L—胺基酸氧化酶與底物在pH8.5的磷酸鹽緩衝液中保溫20分鐘。產生的過氧化氫用上述的ABTS和Cip檢測。比活力由上述實施例2描述的方法測定。
通過1/V對1/S作圖(Lineweaver—Burk曲線)，確定不同底物的Km值。結果示於下列表1。
表1
從表1可見，精氨酸和賴氨酸顯示出最小的Km值，考慮到在低底物濃度時高的比活力，由此認為它們是優選底物，從表1中所列的比活力值也可證明這一點。
從這些實施例中可見，優選底物為L—精氨酸。
實施例4與POD促進體系的相容性為研究本發明L—胺基酸氧化酶與促進的過氧化物酶系(POD體系)的相容性，通過同時檢測過氧化氫，對pH8.5時的酶活力監測10分鐘。
根據實施例2得到的8μg/ml L—胺基酸氧化酶被加入POD體系中，該體系由WO 92/16634得到的酶量為5PODU/ml的灰蓋鬼傘過氧化物酶(Cip)和pH8.5磷酸緩衝液中的1.7mMABTS和作為促進劑的50μM對—羥基苯磺酸鹽(pHBS)組成，並含有1mM L—亮氨酸。
結果示於圖4A—4B，(4A是沒有pHBS的情況；4B是存在50μM pHBS的情況)，在周圍環境溫度下監測418nm處的吸光度。正如這些圖所表明的，本發明L—胺基酸氧化酶的活力不受pHBS加入的影響。
實施例5漂白實施例本實施例證明由實施例1—2得到的L—胺基酸氧化酶在漂白甲基橙染料(得自Merch)過程中的應用。
pH8.5、35℃下在磷酸緩衝液中進行甲基橙的漂白。漂白效果以465nm處的吸光度值來監測。為進行對比，實驗在起始加入H2O2以及L—胺基酸氧化酶和L—亮氨酸的情況進行。兩項實驗均在促進劑pHBS存在時和不存在時進行。
所有實驗均採用10nM的灰蓋鬼傘過氧化物酶(Cip)，其根據WO 92/16634獲得。
結果示於圖5—6。從這些圖可見，通過採用本發明的L—胺基酸氧化酶(及其底物)可獲得的漂白效果與加入230μM的過氧化氫獲得的效果相同。
權利要求
1.一種L—胺基酸氧化酶(E.C.1.4.3.2)，其特徵在於具有下列性質(A)最適PH值範圍為PH 8.5至9.5(L—精氨酸存在時，20℃下保溫20分鐘後測定的)；(B)相對於初始活力，PH 9.5下PH穩定性為80％或更高(在底物不存在時，40℃下保溫1小時後測定的)；以及(C)對L—精氨酸，L—賴氨酸，L—蛋氨酸，L—天冬醯胺，L—苯丙氨酸和L—亮氨酸均具活性。
2.根據權利要求1的L—胺基酸氧化酶，其具有的免疫化學性質與由菌株Trichoderma harzianum A611，CBS 223.93得到的L—胺基酸氧化酶的性質相同或部分相同。
3.根據權利要求1或2的L—胺基酸氧化酶，其可從菌株Trichoderma harzianum獲得。
4.根據權利要求3的L—胺基酸氧化酶，其可從菌株T.harzianum A611，CBS 223.93或其突變體或變異體中獲得。
5.一種製備權利要求1—4的L—胺基酸氧化酶的方法，該方法包括在含有碳源和氮源以及無機鹽的適合的培養基中培養L—胺基酸氧化酶的生產菌株Trichoderma harzianum，然後回收所需要的酶。
6.一種根據權利要求5的方法，其中對菌株T.harzianumA611，CBS 223.93或其突變體或其變異體進行培養。
7.根據權利要求1—4的L—胺基酸氧化酶用於過氧化氫的原位產生。
8.一種包含權利要求1—4的L—胺基酸氧化酶的洗滌劑添加劑，該洗滌劑添加劑以顆粒狀形式提供，優選無粉塵顆粒，以液體，尤其是穩定的液體，漿或已保護的酶形式提供。
9.根據權利要求8的一種洗滌劑添加劑，其進一步包含氧化酶的底物。
10.一種洗滌劑組合物，其包含根據權利要求1—4的L—胺基酸氧化酶，並包含該氧化酶的底物。
11.根據權利要求10的洗滌劑組合物，其進一步包含一種或多種其它酶，尤其是蛋白酶，脂肪酶，澱粉酶，纖維素酶，過氧化物酶和其它氧化酶。
12.一種根據權利要求11的洗滌劑組合物，其中過氧化物酶來自鬼傘屬，如灰蓋鬼傘或長根鬼傘，或來自芽孢桿菌屬，如短小芽孢桿菌，或者，其中的過氧化物酶來自植物，如辣根過氧化物酶。
13.一種(當在洗衣液體中一同洗滌和/或漂洗所述織物時)抑制紡織品染料從染色織物向另一織物傳遞的方法，該方法包括，向洗滌和/或漂洗所述織物的洗衣液中加入權利要求1—4的L—胺基酸氧化酶。
全文摘要
本發明涉及一種新的L-胺基酸氧化酶，其具有廣範圍的底物專一性，能從Trichoderma harzianum獲得。本發明的酶可很好地摻入洗滌劑組合物中，該組合物是用於抑制洗滌過程中染料從一種染色織物傳遞到另一織物上。
文檔編號C12S11/00GK1124979SQ9419227
公開日1996年6月19日 申請日期1994年4月27日 優先權日1993年4月30日
發明者P·施耐德, A·H·皮德森, S·A·哈森 申請人:諾沃挪第克公司