N取代α胺基酸的酶催化拆分方法

2023-07-25 23:47:56

專利名稱：N取代α胺基酸的酶催化拆分方法
技術領域：
本發明涉及一種外消旋光學異構體生物化學拆分方法，特別涉及一種N取代α胺基酸外消旋光學異構體的酶催化拆分方法。
背景技術：
非蛋白胺基酸具有獨特的生物學功能和藥用價值，使其成為研究和開發的新方向和熱點之一。N取代α胺基酸是非蛋白胺基酸衍生物中的一類化合物，是合成藥物，農藥，液晶材料的重要原料。它通常具有兩個異構體，由單一構型的N取代α胺基酸出發，可以為藥物分子引入手性，如(S)-2-[(2-甲基-6-乙基)苯基氨基]丙酸是手性除草劑異丙甲草胺的關鍵中間體。
目前製備單一構型N取代α胺基酸通常採用化學拆分方法(5002606；United States Patent；Magden H.M.，Binnigen C.V.；1991)，然而，化學方法需要消耗較多的有機溶劑、汙染環境、反應後處理也比較複雜。另外反應所需要的高溫有可能導致產物的外消旋化、降解等副反應的發生，從而影響N取代α胺基酸的光學純度。利用酶進行高選擇性和高效的有機合成是當今合成化學的熱點之一，其中以酶催化製備單一手性化合物備受矚目，研究相當活躍。採用酶法對N取代α胺基酸進行拆分同化學方法相比，具有底物專一性好，立體選擇性強，反應條件溫和，產品易分離等化學方法所不能比擬的優點。

發明內容
本發明提供了一種在溫和條件下，酶催化拆分N取代α胺基酸外消旋光學異構體，製備高光學純和高化學純的N取代α胺基酸的方法。
本發明提供的脂肪酶催化拆分N取代α胺基酸外消旋光學異構體方法，按如下步驟進行(a)使結構式為 的外消旋N-取代α胺基酸酯、緩衝溶液和脂肪酶，在恆溫攪拌或振蕩下反應，達到最高轉化率後，終止反應，反應混合物含有一種構型N取代α胺基酸和未反應的另一種構型N取代α胺基酸酯；(b)該混合物用乙醚萃取除去未反應的另一種構型N取代α胺基酸酯；(c)水層酸化到PH5.5，用乙醚萃取；(d)乙醚層用無水硫酸鈉乾燥後，旋轉蒸發，得到一種構型N取代α胺基酸；(e)含未反應的另一種構型N取代α胺基酸酯的乙醚層經旋轉蒸發，進一步酶催化水解，加入緩衝液和另行選擇的脂肪酶，在恆溫攪拌或振蕩下反應，達到最高轉化率後，終止反應；(f)水層酸化到PH5.5，用乙醚萃取；(g)乙醚層用無水硫酸鈉乾燥後，旋轉蒸發，得到另一種構型N取代α胺基酸。
上述(a)的反應可用以下反應式表示
本發明所拆分的結構式為 的N-取代α胺基酸酯式中R1和R2分別可以是直鏈烷烴、支鏈烷烴、烷烴衍生物、芳香烴及芳香烴衍生物；R3可以是直鏈烷烴，優選C1-C5的直鏈烷烴。
本發明所選用的脂肪酶可以是動物、微生物等各種來源的脂肪酶。
本發明所用的脂肪酶可以是游離酶也可以是固定化酶。
本發明所使用的游離脂肪酶與底物的質量比可以是1∶20-1∶1、固定化脂肪酶與底物的質量比可以是3∶1-9∶1。
本發明所使用的緩衝溶液可以是pH7.0-8.5範圍的任何類型緩衝溶液。
本發明酶催化反應時間為4-96小時。
本發明恆溫溫度可選擇範圍為20-45℃。
本發明酸化劑可用鹽酸、硫酸、磷酸、醋酸的溶液。
本發明所用的反應裝置可因反應量多少設計，如果在實驗室，可以把反應體系設在0.5mL到1000mL之間，用單頸三角燒瓶、圓底燒瓶，磁力攪拌，熱電耦控溫，或放到恆溫搖床中振蕩；如果在反應釜中大量生產，可用機械攪拌，水浴恆溫。
本發明還提供一種測定N取代α胺基酸轉化率和對映體過量值的方法轉化率的檢測通過高效毛細管電泳，以三乙胺/乙酸緩衝液作為背景電解質溶液，反向電場強度340V/cm，電泳溫度20℃，樣品濃度50mg/L，紫外檢測器200nm。
對映體過量值檢測通過高效毛細管電泳，以三乙胺/乙酸緩衝液作為背景電解質溶液，採用環糊精作為手性選擇劑，不需要處理毛細管柱，反向電場強度340V/cm，電泳溫度20℃，樣品濃度50mg/L，紫外檢測器200nm，就可以使N取代α胺基酸對映體得到較好分離。
本發明利用脂肪酶催化拆分製備N取代α胺基酸方法具有以下優點(1)酶催化拆分反應條件溫和，基本沒有副產物生成，可以得到高化學純和光學純的目標化合物N取代α胺基酸。
(2)拆分反應效率高，經過兩步酶法拆分過程可以得到高化學純和光學純的另一構型的N取代α胺基酸，這樣可以降低成本。
(3)實驗操作簡單，不需要減壓蒸餾、柱層析等複雜的純化過程，僅需要簡單的萃取操作過程，就可以得到高化學純和光學純的N取代α胺基酸。而且萃取所需要的有機溶劑—乙醚經低溫旋轉蒸發後可重複使用；(4)反應完全在純緩衝溶液體系中進行，避免了化學方法中的大量有機溶劑的使用，減少了環境汙染。
以下實施例旨在說明本發明實施例一100mL反應瓶中，分別加入外消旋2-[(2-甲基-6-乙基)苯基氨基]丙酸苄基酯(5mmol)，磷酸緩衝液(pH7.0)，枯草桿菌脂肪酶(100mg)，37℃恆溫搖床中開始反應。反應48小時後結束反應，用乙醚萃取除去未反應的(S)-2-[(2-甲基-6-乙基)苯基氨基]丙酸苄基酯，水層用0.1mol/L HCL酸化到pH5.5，然後用乙醚進行萃取，乙醚層經無水硫酸鈉乾燥後，旋轉蒸發，得到高化學純和光學純的(R)-2-[(2-甲基-6-乙基)苯基氨基]丙酸產品，產量0.48g，化學純度94％，旋光純度90％e.e.p。
未反應的(S)-2-[(2-甲基-6-乙基)苯基氨基]丙酸苄基酯(0.5g)加入到含有南極假絲酵母脂肪酶(0.1g)的磷酸緩衝液(pH8.0)中，25℃恆溫搖床中開始反應，反應4小時後，結束反應，用0.1mol/LHCL酸化到pH5.5，然後用乙醚進行萃取，乙醚層經無水硫酸鈉乾燥後旋轉蒸發，得到高化學純和光學純的(S)-2-[(2-甲基-6-乙基)苯基氨基]丙酸產品，產量0.46g，化學純度96％，旋光純度92％e.e.p。
以下證明(S)-2-[(2-甲基-6-乙基)苯基氨基]丙酸的絕對構型通過旋光儀測定拆分後得到的2-[(2-甲基-6-乙基)苯基氨基]丙酸的比旋光度同專利(5002606；United States Patent；Magden H.M.，Binnigen C.V.；1991)所報告的(S)-2-[(2-甲基-6-乙基)苯基氨基]丙酸的比旋光度相比較，可以判定拆分得到的酸的絕對構型。
以下方法測定(S)-2-[(2-甲基-6-乙基)苯基氨基]丙酸的轉化率和對映體過量值轉化率的檢測通過高效毛細管電泳，以三乙胺/乙酸緩衝液作為背景電解質溶液(100mmol/L，pH＝5.5)，反向電場強度340V/cm，電泳溫度20℃，樣品濃度50mg/L，紫外檢測器200nm。
對映體過量值檢測通過高效毛細管電泳，以三乙胺/乙酸緩衝液作為背景電解質溶液(100mmol/L pH＝5.5)，採用2，6-O-二甲基-β-環糊精(40mmol/L)作為手性選擇劑，不需要處理毛細管柱，反向電場強度340V/cm，電泳溫度20℃，樣品濃度50mg/L，紫外檢測器200nm，就可以使2-[(2-甲基-6-乙基)苯基氨基]丙酸對映體得到較好分離。
實施例二100mL反應瓶中，分別加入外消旋2-[(2-甲基-6-乙基)苯基氨基]丙酸叔丁酯(5mmol)，碳酸鈉緩衝液(pH8.5)，豬胰脂肪酶(0.4g)，37℃恆溫搖床中開始反應，96小時後結束反應，用乙醚進行萃取除去未反應的(S)-2-[(2-甲基-6-乙基)苯基氨基]丙酸叔丁酯，水層用0.1mol/L H2SO4酸化到pH5.5，然後用乙醚進行萃取，乙醚層經無水硫酸鈉乾燥後旋轉蒸發，得到高化學純和光學純的(R)-2-[(2-甲基-6-乙基)苯基氨基]丙酸產品，產量0.50g，化學純度98％，旋光純度94％e.e.p。
未反應的(S)-2-[(2-甲基-6-乙基)苯基氨基]丙酸叔丁酯(0.6g)加入南極假絲酵母脂肪酶(0.1g)，磷酸緩衝液(pH8.0)，25℃恆溫搖床中開始反應。反應4小時後，結束反應，用0.1mol/L H2SO4酸化到pH5.5，然後用乙醚進行萃取，乙醚層經無水硫酸鈉乾燥後旋轉蒸發，得到高化學純和光學純的(S)-2-[(2-甲基-6-乙基)苯基氨基]丙酸產品，產量0.40g，化學純度96％，旋光純度92％e.e.p。
拆分得到的酸的絕對構型的證明、轉化率和對映體過量值測定同實施例三100mL反應瓶中，分別加入外消旋2-[(2-甲基-6-乙基)苯基氨基]丙酸甲酯(5mmol)，磷酸緩衝液(pH7.5)，柱狀假絲酵母脂肪酶(0.3g)，40℃恆溫搖床中開始反應，反應70小時後結束反應，用乙醚萃取除去未反應的(R)-2-[(2-甲基-6-乙基)苯基氨基]丙酸甲酯，水層用0.1mol/L醋酸酸化到pH5.5，然後用乙醚萃取，乙醚層經無水硫酸鈉乾燥後旋轉蒸發，得到(S)-2-[(2-甲基-6-乙基)苯基氨基]丙酸產品，產量0.5g，化學純度99％，旋光純度99％e.e.p。
未反應的(R)-2-[(2-甲基-6-乙基)苯基氨基]丙酸甲酯(0.5g)加入假單胞菌脂肪酶(0.2g)，磷酸緩衝液(pH8.0)，45℃恆溫搖床中開始反應。反應60小時後結束反應，用0.1mol/L醋酸酸化到pH5.5，然後用乙醚進行萃取，乙醚層經無水硫酸鈉乾燥後旋轉蒸發，得到高化學純和光學純的(R)-2-[(2-甲基-6-乙基)苯基氨基]丙酸產品，產量0.4g，化學純度96％，旋光純度92％e.e.p。
拆分得到的酸的絕對構型的證明、轉化率和對映體過量值的測定同實施例一。
實施例四100mL反應瓶中，分別加入外消旋2-(3-氟甲基苯基氨基)丙酸異丙酯(5mmol)，磷酸緩衝液(pH8.0)，假單胞菌脂肪酶(0.2g)，45℃恆溫搖床中開始反應，反應60小時後，用乙醚進行萃取除去未反應的(S)-2-(3-氟甲基苯基氨基)丙酸異丙酯，水層用0.1mol/L HCL酸化到pH5.5，然後用乙醚進行萃取，乙醚層經無水硫酸鈉乾燥後旋轉蒸發，得到(R)-2-(3-氟甲基苯基氨基)丙酸產品，產量0.5g，化學純度99％，旋光純度92％e.e.p。
未反應的(S)-2-(3-氟甲基苯基氨基)丙酸異丙酯(0.5g)加入到含有南極假絲酵母脂肪酶(0.1g)的磷酸緩衝液(pH8.0)中，25℃恆溫搖床中開始反應，反應4小時後，結束反應，用0.1mol/LHCL酸化到pH5.5，然後用乙醚進行萃取，乙醚層經無水硫酸鈉乾燥後旋轉蒸發，得到高化學純和光學純的(S)-2-(3-氟甲基苯基氨基)丙酸產品，產量0.45g，化學純度96％，旋光純度85％e.e.p。
拆分得到的酸的絕對構型的證明、轉化率和對映體過量值的測定同實施例一。
實施例五100mL反應瓶中，分別加入外消旋2-異丙基氨基丙酸苄基酯(5mmol)，磷酸緩衝液(pH8.0)，南極假絲酵母脂肪酶(0.2g)，25℃恆溫搖床中開始反應。反應4小時後結束反應，用乙醚萃取除去未反應的(R)-2-異丙基氨基丙酸苄基酯，水層用0.1mol/L HCL酸化到pH5.5，然後用乙醚萃取，乙醚層經無水硫酸鈉乾燥後旋轉蒸發，得到(S)-2-異丙基氨基丙酸產品，產量0.55g，化學純度99％，旋光純度98％e.e.p。
未反應的(R)-2-異丙基氨基丙酸苄基酯(0.5g)加入假單胞菌脂肪酶(0.2g)，磷酸緩衝液(pH8.0)，45℃恆溫搖床中開始反應。反應60小時後結束反應，用0.1mol/L HCL酸化到pH5.5，然後用乙醚進行萃取，乙醚層經無水硫酸鈉乾燥後旋轉蒸發，得到高化學純和光學純的(R)-2-異丙基氨基丙酸產品，產量0.45g，化學純度99％，旋光純度98％e.e.p。
拆分得到的酸的絕對構型的證明、轉化率和對映體過量值的測定同實施例一。
實施例六100mL反應瓶中，分別加入外消旋2-[(2，6-二甲基)苯基氨基]丁酸甲酯(5mmol)，磷酸緩衝液(pH8.0)，固定化假單胞菌脂肪酶(9.0g，)(假單胞菌脂肪酶以分子篩為載體固定化)，37℃恆溫搖床中開始反應，反應50小時後結束反應，反應混合物濾去酶，用乙醚進行萃取除去未反應的(S)-2-[(2，6-二甲基)苯基氨基]丁酸甲酯，水層用0.1mol/L HCL酸化到pH5.5，然後用乙醚萃取，乙醚層經無水硫酸鈉乾燥後旋轉蒸發，得到高化學純和光學純的(R)-2-[(2，6-二甲基)苯基氨基]丁酸產品，產量0.52g，化學純度91％，旋光純度90％e.e.p。
未反應的(S)-2-[(2，6-二甲基)苯基氨基]丁酸甲酯(0.5g)加入南極假絲酵母脂肪酶(0.1g)，磷酸緩衝液(pH8.0)，25℃恆溫搖床中開始反應，反應4小時後，結束反應，用0.1mol/L HCL酸化到pH5.5，然後用乙醚進行萃取，乙醚層經無水硫酸鈉乾燥旋轉蒸發，得到高化學純和光學純的(S)-2-[(2，6-二甲基)苯基氨基]丁酸產品，產量0.5g，化學純度99％，旋光純度98％e.e.p。
濾出的固定化脂肪酶經處理後，可以重複使用多次。
轉化率和對映體過量值的測定同實施例一。
權利要求
1.一種脂肪酶催化拆分N取代α胺基酸外消旋光學異構體的方法，按如下步驟進行(a)使結構式為 外消旋N取代α胺基酸酯，緩衝液和脂肪酶，在恆溫攪拌或振蕩下反應，達到最高轉化率後，終止反應，反應混合物中含有一種構型N取代α胺基酸和未反應另一種構型N取代α胺基酸酯；(b)該混合物用乙醚萃取除去未反應的另一種構型N取代α胺基酸酯；(c)水層酸化到pH5.5，用乙醚萃取；(d)乙醚層用無水硫酸鈉乾燥後，旋轉蒸發，得到一種構型N取代α胺基酸；(e)含有未反應的另一種構型N取代α胺基酸酯的乙醚層經旋轉蒸發後，進一步酶催化水解，加入緩衝液和另行選擇的脂肪酶，在恆溫攪拌或振蕩下反應，達到最高轉化率後，終止反應；(f)水層酸化到pH5.5，用乙醚萃取；(g)乙醚層用無水硫酸鈉乾燥後，旋轉蒸發可得另一種構型N取代α胺基酸。
2.按照權利要求1的方法，其中N取代α胺基酸酯結構式中R1和R2分別可以分別是直鏈烷烴、支鏈烷烴、烷烴衍生物、芳香烴及芳香烴衍生物，R3可以是直鏈烷烴。
3.按照權利要求1或2的方法，其中R3可以是C1-C5的直鏈烷烴。
4.按照權利要求1的方法，其中脂肪酶可以是動物、微生物等各種來源的脂肪酶。
5.按照權利要求1或4的方法，所用的酶可以是游離酶也可以是固定化酶。
6.按照權利要求1或4的方法，其中所使用的游離脂肪酶與底物的質量比可以是1∶20-1∶1、固定化脂肪酶與底物的質量比可以是3∶1-9∶1。
7.按照權利要求1的方法，其中恆溫溫度可選擇範圍為20-45℃。
8.按照權利要求1的方法，其中酶催化反應時間為4-96小時。
9.按照權利要求1的方法，使用的緩衝液可以是pH7.0-8.5範圍的任何類型緩衝溶液。
10.一種測定N取代α胺基酸轉化率和對映體過量值的方法(a)轉化率的檢測通過高效毛細管電泳，以三乙胺/乙酸緩衝液作為背景電解質溶液，反向電場強度340V/cm，電泳溫度20℃，樣品濃度50mg/L，紫外檢測器200nm；(b)對映體過量值檢測通過高效毛細管電泳，以三乙胺/乙酸緩衝液作為背景電解質溶液，採用環糊精作為手性選擇劑，不需要處理毛細管柱，反向電場強度340V/cm，電泳溫度20℃，樣品濃度50mg/L，紫外檢測器200nm，就可以使N取代α胺基酸對映體得到較好分離。
全文摘要
本發明涉及一種N取代α胺基酸外消旋異構體的酶催化拆分方法。包括如下步驟使N－取代α胺基酸酯在緩衝液中和脂肪酶反應，反應混合物用乙醚萃取，水層酸化，乙醚萃取，乙醚層乾燥，旋轉蒸發，得到一種構型N取代α胺基酸；未反應的另一種構型N取代α胺基酸酯通過酶的第二次拆分可得到另一種構型N－取代α胺基酸。該方法條件溫和，基本沒有副產物；操作簡單，拆分反應效率高，得到的目標化合物具有高化學純度和光學純度。本發明還提供一種測定N取代α胺基酸轉化率和對映體過量值的方法。
文檔編號C12P41/00GK1632129SQ20041001123
公開日2005年6月29日 申請日期2004年11月19日 優先權日2004年11月19日
發明者曹淑桂, 鄭良玉, 張鎖秦, 高貴, 趙麗芳, 楊雪瑩 申請人:吉林大學