同時結合多種澱粉樣蛋白單體的多肽及其應用的製作方法

2023-07-18 08:02:51 4

專利名稱：同時結合多種澱粉樣蛋白單體的多肽及其應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於含肽的醫藥配製品領域，具體涉及一種同時結合澱粉樣蛋白單體的多 肽及其應用；本發明可應用於識別多種澱粉樣蛋白過渡態單體的抗體製備，澱粉樣蛋白疾 病的診斷、治療和實驗研究。
背景技術：
多年來，澱粉樣蛋白或多肽自身的聚集導致的多種疾病對人類的健康造成了越來 越大的危害。某些蛋白質單體本身無毒性或毒性很小，但它們可聚集成具有毒性作用的寡 聚物(oligomer)或纖維狀物(fibril)而引起一系列疾病，如由Beta-amyloid (A-Beta)引 起的阿茲海默病(俗稱老年性痴呆)(Alzheimer，disease, AD)，由alpha-synuclein引 起的帕金森病(Parkinson，disease, PD)，由朊病毒蛋白(Prion protein (PrP))引起的 包括狂牛症在內的人和動物的至少十餘種腦病，由含有多聚穀氨醯胺(PolyQ)的多肽引起 的包括亨廷頓病(Huntington』 s disease)在內的至少9種遺傳性神經退行性疾病，由胰島 澱粉樣多肽(islet amyloid polypeptide, IAPP，amylin)引起的II型糖尿病等及由長時 間透析導致的溶菌酶(lysozyme)聚集沉積導致的疾病等。其中，對人類健康危害最大的為 AD和PD及II型糖尿病。醫學統計表明，我國和歐美國家中65歲以上老年人中5 6%患 有AD，並且發病率逐年上升。該病已被列為導致死亡的第四大疾病，僅次於心臟病、癌症和 中風。另有約1%的65歲以上老年人患有PD。而患有II型糖尿病的人數可達總人口的5% 以上。這些疾病對人類的健康造成了越來越大的危害，其發病的根本原因(或部分原因) 在於某些蛋白質自身的聚集。研究表明，不同蛋白質的聚集最先始於錯誤摺疊或變性的蛋白質單體，單體多肽 鏈間氫鍵的形成導致了蛋白分子的聚合。首先形成由電子或原子力顯微鏡可觀察到的 大小約為3-10 nm的可溶性球形寡聚物，某些寡聚物進一步可聚集成彎曲柔韌的絲狀物 (protofibril)，進而形成直徑為6-10 nm的表面光滑或呈螺旋狀的纖維。非同源性的蛋白 質最終可形成具有相似結構的蛋白聚合物。由A-Bet^alpha-synucleiruPrP和IAPP等各 種各樣的蛋白聚集形成的纖維都含有「cross-Beta-sheet」結構，其中Beta片層構成的骨 架與纖維縱軸垂直，而骨架中的氫鍵網與縱軸平行。多肽在Beta片層中排列為平行的Beta 鏈，在Beta片層中，胺基酸都有精確的位置。不同來源的寡聚物也具有相似的結構特徵，寡 聚物特異性識別抗體可以與由不同來源的蛋白質單體形成的寡聚物結合，而不與它們的單 體和纖維結合。這表明澱粉樣蛋白多肽骨架可形成獨立於其胺基酸一級序列之外的共同的 寡聚物特有的抗原表位。Glabe實驗室應用連接有A-Beta 40的金膠顆粒模擬A-Beta 40寡 聚物製備出了不僅可與A-Beta 40和A-Beta 42寡聚物結合併且還可與alpha-synuclein、 IAPP、PolyQ、PrP, Insulin, Lysozyme等形成的寡聚物結合的多克隆抗體(All)，該抗體還 能夠有效地抑制所有這些寡聚物的細胞毒性。過去人們一直認為澱粉樣蛋白疾病的發生是由蛋白質聚集成的不溶性的纖維狀 物引起的。近年來大量的研究表明，引起致病的關鍵因素是體積較小的水溶性的寡聚物。由蛋白寡聚物引起的退行性疾病存在著相似的機理，即細胞膜損傷、氧化應激、線粒體功能失 調、細胞死亡、信號傳遞異常等。寡聚物形成的機理及怎樣才能有效地抑制其細胞毒性等都 是人們亟待探討和解決的問題。應用主動和被動的免疫技術治療AD從而抑制A-Beta的聚 集，並加快A-Beta的清除是AD研究領域的熱點之一。2000年前後美國科研人員應用A-Beta製成的疫苗進行了動物試驗和一期臨床試 驗。實驗結果十分令人鼓舞，實驗動物和病人的臨床症狀減輕，記憶力恢復，病理變化也顯 著減退。同時，應用抗A-Beta抗體對實驗動物的被動免疫治療也收到了很好的療效。然而， 不幸的是在二期臨床試驗中，雖然大多數的病人仍表現出良好效果，卻有6%的病人表現出 了腦膜炎的症狀和病理變化，有的病人甚至發生死亡。因此，對A-Beta疫苗和抗體的實驗 研究立即終止。儘管如此，從上述的研究我們可以看出A-Beta疫苗對AD的治療效果是應該 肯定的。研究表明由A-Beta疫苗導致的副作用可能是由該疫苗誘導機體產生的T淋巴細 胞介導的自身免疫反應，並且該副作用的產生是由Thl而不是Th2型免疫反應造成的。為 了克服A-Beta疫苗的副作用，在疫苗設計時應加強誘發B細胞反應和Th2型免疫反應的發 生，並且避開誘發T細胞免疫反應和Thl型免疫反應的發生。所以，在科研和臨床中需要一 種與體內正常澱粉樣蛋白單體之間不產生副作用，並且還不會影響蛋白的正常生理功能的 結合澱粉樣蛋白單體的多肽。

發明內容
本發明的目的在於提供一種同時結合澱粉樣蛋白單體的多肽(簡稱PEMX)，其氨基 酸序列為Cys-Trp-His-Thr-Asp-Thr-Arg-kr-Cys，或由上述的胺基酸序列經過取代、缺 失、或添加一個或幾個胺基酸，且具有抑制澱粉樣蛋白寡聚體形成作用的多肽。本發明可以 有效刺激機體產生與多種澱粉樣澱蛋白過渡態單體結合的特異性抗體，並且該抗體可以抑 制澱粉樣蛋白的聚集和細胞毒性。在本發明的具體實施例中，將本發明所述多肽的N端應用PEG2000修飾(簡稱為 PEG-PEMX)(序列為PEG-Cys-Trp-His-Thr-Asp-Thr-Arg-Ser-Cys)、天冬氨酸置換成丙 氨酸(簡稱為 PEMX-D/A)(序列為Cys-Trp-His-Thr-Ala-Thr-Arg-Ser-Cys)、刪除色氨酸 (簡稱為PEMX-AW)(序列為Cys-His-Thr-Asp-Thr-Arg4er-Cys)或插入甘氨酸(簡稱為 PEMX-G)(序列為Cys-Trp-His-Thr-Asp-Thr-Arg-Gly-Ser-Cys)，經檢測表明 PEMX 多肽 經過某些修飾、某個胺基酸經置換、缺失或在多肽中增加胺基酸後仍能保留有與Aβ 42結 合的能力。體外試驗表明，本發明所述的多肽可與多種澱粉樣蛋白單體結合，並且自身可以 聚集；所述的多肽為一有效的免疫原，可有效刺激機體產生抗體；所述的多肽既是多種澱 粉樣蛋白過渡態上的抗原表位，同時也是聚集時的結合位點；所述的多肽抗體可以明顯抑 制澱粉樣蛋白Ab42、amylin、a-synuclein, Iysozyme聚集；所述的多肽抗體能夠明顯抑制 Ab42、PrP> amylin、a-synuclein、Iysozyme 的細胞毒性。本發明還提供所述多肽應用於澱粉樣蛋白過渡態單體抑制劑。本發明還提供所述多肽應用於製備特異結合澱粉樣蛋白過渡態單體的抗體。
本發明還提供所述多肽應用於製備治療澱粉樣蛋白疾病疫苗。 本發明相比現有技術具有如下有益效果1.本發明可以有效刺激機體產生與多種澱粉樣澱蛋白過渡態單體結合的特異性抗體， 並且該抗體可以抑制澱粉樣蛋白的聚集和細胞毒性。2.基於本發明的疫苗能夠避開過敏反應的發生，還不會誘導機體形成抗A-Beta 等澱粉樣蛋白正常單體的抗體。這一特性可消除疫苗與體內正常澱粉樣蛋白單體之間產生 副作用的可能，並且還不會影響蛋白的正常生理功能。3.本發明可用於治療澱粉樣蛋白疾病疫苗的研製。PEMX具有較好的免疫原性，可 有效刺激機體產生抗體，因而在澱粉樣蛋白疾病的治療或預防用疫苗的研製方面，PEMX可 作為良好的免疫原。4.本發明可直接用於治療澱粉樣蛋白疾病。由於PEMX能夠直接抑制澱粉樣蛋白 的聚集和細胞毒性，因而對該類疾病的直接治療也可能具有潛在的作用。


圖1. PEMX與多種澱粉樣蛋白單體結合的ELISA測定；
圖2.經置換、缺失或插入了胺基酸的PEMX與Ab42單體結合的ELISA測定；
圖3. PEMX自身凝聚成多聚體的Western-blot測定；
圖4. PEMX與多種澱粉樣蛋白單體結合的Western-blot測定；
圖5.經PEMX抗體免疫後小鼠血清中抗體與Ab42的結合；
圖6. PEMX抗體與多種澱粉樣蛋白的單體結合；
圖7. ThT螢光染色測定PEMX抗體抑制澱粉樣蛋白的聚集；
圖8. PEMX抗體抑制澱粉樣蛋白的細胞毒性。
具體實施例方式
實施例1
一種同時結合澱粉樣蛋白單體的多肽(簡稱PEMX)，其胺基酸序列為=Cys-Trp-His-Th r-Asp-Thr-Arg-Ser-Cys，或由上述的胺基酸序列經過取代、缺失、或添加一個或幾個氨基 酸，且具有抑制澱粉樣蛋白寡聚體形成作用的多肽。本發明可以有效刺激機體產生與多種 澱粉樣澱蛋白過渡態單體結合的特異性抗體，並且該抗體可以抑制澱粉樣蛋白的聚集和細 胞毒性。在本發明的具體實施例中，將本發明所述多肽的N端應用PEG2000修飾(簡稱為 PEG-PEMX)(序列為PEG-Cys-Trp-His-Thr-Asp-Thr-Arg-Ser-Cys)、天冬氨酸置換成丙 氨酸(簡稱為 PEMX-D/A)(序列為Cys-Trp-His-Thr-Ala-Thr-Arg-Ser-Cys)、刪除色氨酸 (簡稱為PEMX-AW)(序列為Cys-His-Thr-Asp-Thr-Arg4er-Cys)或插入甘氨酸(簡稱為 PEMX-G)(序列為Cys-Trp-His-Thr-Asp-Thr-Arg-Gly-Ser-Cys)，經檢測表明 PEMX 多肽 經過某些修飾、某個胺基酸經置換、缺失或在多肽中增加胺基酸後仍能保留有與Aβ 42結 合的能力。體外試驗表明，本發明所述的多肽可與多種澱粉樣蛋白單體結合，並且自身可以 聚集；所述的多肽為一有效的免疫原，可有效刺激機體產生抗體；所述的多肽既是多種澱 粉樣蛋白過渡態上的抗原表位，同時也是聚集時的結合位點；所述的多肽抗體可以明顯抑 制澱粉樣蛋白Ab42、amylin、a-synuclein, Iysozyme聚集；所述的多肽抗體能夠明顯抑制 Ab42、PrP> amylin、a-synuclein、Iysozyme 的細胞毒性。所述多肽應用於澱粉樣蛋白過渡態單體抑制劑；所述多肽也可以應用於製備特異結合澱粉樣蛋白過渡態單體抗體；所述多肽也可以應用於製備治療澱粉樣蛋白疾病疫苗。所述多肽可以有效刺激機體產生與多種澱粉樣澱蛋白過渡態單體的特異性抗體， 並且該抗體可以抑制澱粉樣蛋白的聚集和細胞毒性。基於所述多肽的疫苗能夠避開過敏反 應的發生，還不會誘導機體形成抗A-Beta等澱粉樣蛋白正常單體的抗體。這一特性可徹底 消除疫苗與體內正常澱粉樣蛋白單體之間產生副作用的可能，並且還不會影響蛋白的正常 生理功能。在近期的研究中，Frieden等推測澱粉樣蛋白單體聚集時應經過無規則變性結構 的形成、無規則結構的有序變化及有序結構的形成幾個過渡型階段(Frieden C. Protein aggregation processes In search of the mechanism. Protein Sci. , 2007，)。應用 噬菌體顯示技術篩選與Ab42單體結合的多肽時獲得了一條可與各種澱粉樣蛋白的單體結 合的多肽PEMX。由於各澱粉樣蛋白的一級序列無同源性，因而推測PEMX是與各澱粉樣蛋白 單體的過渡態所含有的共同的結合位點結合。進一步的研究表明，PEMX可作為免疫原刺激 機體產生抗體，並且該抗體可以與多種澱粉樣蛋白單體結合，提示PEMX為多種過渡態單體 上共有的抗原表位。同時，PEMX自身可發生聚集。所有這些結果使我們推測出PEMX為澱粉 樣蛋白過渡態單體相互聚集時的結合位點，也是一個具有較好免疫原性的抗原表位。PEMX 多肽抗體可以抑制多種澱粉樣蛋白的聚集及細胞毒性，表明應用該多肽的主動和被動免疫 對澱粉樣蛋白疾病的治療具有潛在的應用價值。同時，PEMX抗體還可能用於實驗室研究及 臨床診斷檢測。以這種肽設計的疫苗可能會避開過敏反應的發生，還不會誘導機體形成抗 A-Beta等澱粉樣蛋白正常單體的抗體。這一特性可消除疫苗與體內正常澱粉樣蛋白單體之 間產生副作用的可能，並且還不會影響蛋白的正常生理功能。因此，基於該類抗原表位研製 的肽疫苗對AD及其它澱粉樣蛋白疾病的治療具有重要的應用價值。PEMX的合成製備的方法為
PEMX為一環形七肽，由上海吉爾生化有限公司按常規方法合成製備(製備方法參見 Weng C C, Peter D W. Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis A Practical Approach. Oxford: University Press, 2000. 1 8 ；Atherton Ε, Sheppard R C. Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach. Oxford: IRL Press, 1989) ；PEMX ^it^ 大於或等於95% ;PEMX保存於-20 ° C，避免反覆凍融。PEMX用於特異抗各種澱粉樣蛋白過渡態單體抗體的製備方法為
將展示PEMX多肽的M13噬菌體免疫紐西蘭大白兔。每2周免疫一次，每次免疫用抗原 為IO12個噬菌粒/兔。共免疫4次。於最後一次免疫15天後，採集兔血清。以連接有PEMX 多肽的瓊脂糖凝膠對兔血清進行親和層析純化抗PEOZ的抗體。該抗體可特異結合澱粉樣 蛋白過渡態單體，可用於澱粉樣蛋白疾病的實驗研究、治療和臨床診斷等。PEMX的所有的實驗數據都是通過至少3次獨立的實驗獲得的，實驗數據表示為平 均數加減標準差。數據的統計分析是應用One-way ANOVA軟體進行。以下結合實施例2-8，進一步闡述PEMX的性質。實施例2 PEMX可與多種澱粉樣蛋白的單體結合
將 100 μ 1 Ab42、PrP> amylin、a-synuclein (American Peptide Conpany, USA)、 insulin、lysozyme (Sigma-Aldrich, USA)單體(1 g/孔)分別包被96孔酶聯免疫微孔 板，BSA為陰性對照，置37° C 2 h，以3% BSA 37° C封閉2 h，200 μ L/孔。以PBS洗板3次，加入帶有組氨酸標籤的PEMX溶液100 μ 1，室溫孵育1 h後，用含有0. 1% Tween-20的 PBS洗滌三次。每孔加入100 μ 1連接有HRP的識別組氨酸標籤的抗體(9Ε10) (1 3000), 室溫孵育1 h後，用含有0. 1% Tween-20的PBS洗滌3次。每孔加入底物溶液TMB 100 μ L， 放置37° C 20 min，然後每孔加入50 μ 1 1 mmol/L硫酸終止反應，於酶聯免疫檢測儀上 測定 OD 值(波長 450 nm)(圖 1)。圖 1 表明 PEMX 可與 Ab42、PrP、amylin、a-synuclein、 lysozyme等多種澱粉樣蛋白的單體結合。由於這些澱粉樣蛋白胺基酸一級序列無任何同源 性，因而，能夠同時結合PEMX多肽的各澱粉樣蛋白應是具有相似結構特徵的單體聚集成寡 聚體前的過渡態。實施例3 經置換、缺失或插入了胺基酸的PEMX仍與A β 42結合
將所述多肽PEMX的N端應用PEG2000修飾(簡稱為PEG-PEMX)(序列為PEG-Cys-Trp-His-Thr-Asp-Thr-Arg-Ser-Cys)、天冬氨酸置換成丙氨酸(簡稱為PEMX-D/A)(序列 為=Cys-Trp-His-Thr-Ala-Thr-Arg-Ser-Cys)、刪除色氨酸(簡稱為PEMX_AW)(序列為 Cys-His-Thr-Asp-Thr-Arg-Ser-Cys)或插入甘氨酸(簡稱為PEMX_G)(序列為Cys-Trp -His-Thr-Asp-Thr-Arg-Gly-Ser-Cys)0為了能夠檢測改造後的多肽與Αβ 42的結合情況， 將這些多肽與帶有標籤的未改造的PEMX競爭地與A β 42結合，然後以ELISA檢測後者與 Aβ 42的結合情況。將1 mg未改造的帶有標籤的PEMX與10 mg改造後的PEMX的混合物 100 ml加入到包被有A β 42單體的96孔ELISA板中，然後用ELISA檢測帶有標籤的PEMX 與Αβ 42的結合，測定OD值，結果見圖2。表明PEMX多肽經過某些修飾、某個胺基酸經置 換、缺失或在多肽中增加胺基酸後仍能與未修飾改造的PEMX有效競爭結合A β 42，致使帶 有標籤的PEMX與Αβ 42的結合明顯降低(與單獨的PEMX陽性對照相比，Ρ<0. 01)。實施例4: Western-blot證明PEMX可與多種澱粉樣蛋白的單體結合，並且自身可 以聚集
將333 μ M帶有組氨酸標籤的PEMX分別與333 μ M Ab42,383 μ M amylin,79 μ M a-synuclein、105 μ M lysozyme (333μΜ帶有組氨酸標籤的PEMX自身作為對照)孵育12 h後取10 μ L，加入等量的樣品緩衝液。混勻後煮沸1分鐘。加入到Tricine凝膠樣品孔 中，濃縮膠60 V，分離膠80 V電泳使溴酚藍至玻璃板下邊緣1 cm處。將含有樣品的凝膠切 下，將樣品以 80 V溼法轉移27 min 至0. 45 μ m NC膜(Millipore, Billerica, MA USA)。 轉移結束後將NC膜稍微衝洗，用8% milk 37° C封閉2 h ;PBST洗膜1遍，加入抗組氨酸 標籤的抗體(1:3000) (Santa Cruz, CA, USA), 37° C 孵育 2 h ； 0. 1% PBST 洗膜 3 遍，每 遍 5min，加入二抗 HRP-羊抗鼠(1:5000) (Santa Cruz, CA, USA)，37° C 孵育 1 h ;0. 1% PBST洗膜3遍，每遍10 min。然後用ECL發光試劑盒(Pierce，IL, USA)檢測發光條帶。 曝光3 min，顯影30 s。PEMX多肽單體分子量為1003 Da，帶有6個組氨酸標籤的多肽分 子量為1934 Da0圖3中可見PEMX自身形成分子量分別約為10和20 kDa的兩條帶，表明 PEMX可聚集形成5聚體和10聚體。圖4顯示除了 PEMX自身聚集形成的兩條帶之外，PEMX(帶標籤分子量為1. 9 kDa) 可與Ab42 (單體分子量為4. 5 kDa)結合形成分子量約為6 kDa和SkDa的兩條帶，表明 一個Ab42單體分子可結合一個或兩個PEMX多肽分子。PEMX可與amylin (單體分子量為 3. 9 kDa)結合形成分子量約為6 kDa和8kDa的兩條帶，表明一個amylin單體分子也可結 合一個或兩個PEMX多肽分子。PEMX可分別與a-synuclein (單體分子量為14. 5 kDa)和lyS0Zyme(單體分子量為14. 3 kDa)結合形成分子量都約為16 kDa的蛋白帶，表明PEMX也 可與a-synuclein和Iysozym單體結合。由於PrP106_U6分子量太小，在SDS電泳中不易 形成集中的蛋白帶，因而以Western-blot方法不易檢測出來(本試驗未加入ft~P)。澱粉樣 蛋白Ab42、amylin、a-synuclein, Iysozyme 一級序列無任何同源性，而PEMX仍然可與它們 明顯結合(圖1和4)，表明各澱粉樣蛋白單體之間存在有共同的結合位點，該位點只能存在 於單體形成寡聚體之前的過渡態單體上。因而，PEMX是與澱粉樣蛋白聚集時的過渡態單體
糹口口。 實施例5 =PEMX可誘發機體產生抗體
應用展示PEMX多肽的M13噬菌體及未有多肽展示的噬菌體(作為對照)免疫小鼠(5隻 /組)，每隻每次免疫噬菌體IOltl個。每2周免疫一次，共免疫4次。第4次免疫後15天採 血，分離血清。應用ELISA檢測血清中抗PEMX抗體的含量。將100 μ 1 Ab (1 mg/孔)包 被96孔酶聯免疫微孔板，置37° C 2 h，以3% BSA 37° C封閉2 h，200 μ L/孔。以PBS 洗板3次，加入2000倍稀釋的血清，室溫孵育1 h後，用含有0. 1% Tween-20的PBS洗滌三 次。每孔加入100 μ 稀釋後的羊抗鼠酶標二抗(1 :3000)，室溫孵育1 h後，用含有0.1% Tween-20的PBS洗滌3次。每孔加入底物溶液TMB 100 μ L，放置37 ° C 20 min，然後每 孔加入50 μ 1 1 mmol/L硫酸終止反應，於酶聯免疫檢測儀上測定OD值(波長450 nm)。圖 5表明PEMX為一有效的免疫原，可有效刺激機體產生抗體。實施例6 =PEMX的免疫抗體的製備及其與各澱粉樣蛋白單體的結合
將展示PEMX多肽的M13噬菌體免疫紐西蘭大白兔。每2周免疫一次，每次免疫用抗原 為IO12個噬菌粒/兔。共免疫4次。於最後一次免疫15天後，採集兔血清。以連接有PEMX 多肽的瓊脂糖凝膠對兔血清進行親和層析純化抗PEOZ的抗體。將 100 μ 1 Ab42、PrP、amylin、a-synuclein、lysozyme 單體(1 mg/孑L)分別包被 96孔酶聯免疫微孔板，BSA為陰性對照。以PEMX抗體作為一抗，以HRP標記的羊抗兔LgG 作為二抗，並按上述ELISA方法進行實驗操作。結果顯示，PEMX抗體可與Ab、PrP、amylin, a-synuclein的單體結合，表明PEMX是多種澱粉樣蛋白單體上所共有的抗原表位(圖6)。 由於各澱粉樣蛋白的單體之間無明顯的同源性，該共同的抗原表位應該位於澱粉樣蛋白的 過渡態單體上。由於PEMX可與澱粉樣蛋白的過渡態單體結合，並且其本身也可聚集。因而 PEMX既是各澱粉樣蛋白過渡態單體上的抗原表位，同時也是聚集時的結合位點。實施例7 =PEMX抗體體外抑制澱粉樣蛋白的聚集
1)將國外購買的Ab42、amylin、a-synuclein以六氟異丙醇(HFIP)溶解至1 mg/ml，室 溫超聲波處理10 min，分裝到印idorf管中，與真空中揮發HFIP，然後於-20 ° C保存。用 前將HFIP處理過的各蛋白在室溫放置20 min，然後加入二甲基亞碸(DMS0)，使各蛋白濃度 為5 mg/ml，然後以0. 02 M pH 7. 4的PBS緩衝液進行稀釋至所需濃度。Iysozyme則 直接用0. 02 M pH 7. 4 PBS製備到所需濃度。2)將PEMX抗體溶解於0. 02 M pH 7. 4的PBS緩衝液中，然後加入到Ab42、PrP, amylin、a-synuclein, Iysozym溶液中(lysozyme為pH 2. 5的醋酸緩衝液，其餘樣品為pH 7. 4的PBS緩衝液)，使各蛋白的終濃度分別為10、200、20、40、200 μ M0各蛋白與PEMX抗體 的摩爾比分別如圖6所示。以不加PEMX抗體的蛋白溶液作為對照。將Ab42、PrP、amylin、 a-synuclein、Iysozym 於 37 ° C (lysozyme 放置於 65 ° C 環境)分別放置 1 天、5 天、5小時、4天和6天。3)將硫黃素(ThT)溶解在pH 6. 5、50 mM的磷酸鹽緩衝液使其濃度為5 mM。將孵 育後的樣品20 ml加入到含有180 ml ThT溶液的黑色酶標板中。混勻後在多功能酶標儀 上以450 nm激發波長和482 nm的發射波長測定ThT的螢光強度。將各樣品的螢光強度減 去ThT本身的背景螢光。圖7所示，加入PEMX抗體後的蛋白螢光強度顯著低於蛋白自身的 對照。由於ThT是與澱粉樣蛋白聚集後的聚集物中的b-片層結合後才可激發出螢光，螢光 越強，表明澱粉樣蛋白聚集越多。因此，PEMX抗體可明顯抑制各澱粉樣蛋白的聚集(圖6A、 B、C、D、E 分別表示 Ab42、amylin、a-synuclein、lysozyme、PrP 在有和無 PEMX 抗體時的熒 光測定結果)(與單獨的澱粉樣蛋白對照相比，O, P<0. 05 ；#，P<0. 01)。實施例8: PEMX抗體抑制澱粉樣蛋白的細胞毒性
用含10%胎牛血清的培養基(MEM)將SH-SY5Y細胞配成單個細胞懸液，以每孔10000 個細胞接種到96孔細胞培養板，每孔體積100 UL0細胞於37 ° C培養M小時，培養箱 C02濃度為5%。每孔加入樣品(各澱粉樣蛋白與PEMX抗體的混合物，澱粉樣蛋白對照及PBS 對照)，Ab42、ft~P、amylin、a-synuclein、lysozyme 蛋白的終濃度分別為 2、200、5、2、20 μ M, PEMX抗體的終濃度為10、60、10、5、200 μ Μ。細胞繼續培養48小時後，每孔加MTT溶液(5 mg/mL) 10 μ L，37° C孵育3小時，終止培養，每孔加100 μ L晶體溶解液(10%SDS和5%異 丁醇溶解在0. 01 M HCL中)，37° C孵育過夜，使結晶物充分溶解。在多功能酶聯免疫檢測 儀上以570nm波長測定各孔光吸收值。以樣品的吸光度除以不加樣品的細胞的吸光度作為 細胞的活性指標，並分析樣品之間的差異顯著情況(與各澱粉樣蛋白對照相比，O, P<0. 05 ； #，Ρ<0· 01)，結果表明，PEMX 抗體能夠明顯抑制 Ab42、PrP、amylin、a-synuclein、lysozyme 的細胞毒性(圖8)。以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對於本技術領域的普通技術人 員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應 視為本發明的保護範圍。
權利要求
1.如下(a)或(b)的多肽，(a)其胺基酸序列為Cys-Trp-His-Thr-Asp-Thr-Argler-Cys，(b)由(a)中的胺基酸序列經過取代、缺失、或添加一個或幾個胺基酸，且具有抑制澱粉 樣蛋白寡聚體形成作用的由(a)衍生的多肽。
2.根據權利要求1所述的多肽，其特徵在於，其為(a)所示的多肽N端用PEG2000修飾。
3.根據權利要求1所述的多肽，其特徵在於，其胺基酸序列為CyS-Trp-HiS-Thr-Ala-Thr-Arg-Ser-Cys0
4.根據權利要求1所述的多肽，其特徵在於，其胺基酸序列為=Cys-His-Thr-Asp-Thr-Arg-Ser-Cys0
5.根據權利要求1所述的多肽，其特徵在於，其胺基酸序列為=Cys-Trp-His-Thr-Asp-Thr-Arg-Gly-Ser-Cys0
6.根據權利要求1-5任一項所述多肽應用於澱粉樣蛋白過渡態單體抑制劑。
7.根據權利要求1-5任一項所述多肽應用於製備特異結合澱粉樣蛋白過渡態單體抗體。
8.根據權利要求1-5任一項所述多肽應用於製備治療澱粉樣蛋白疾病疫苗。
全文摘要
本發明屬於含肽的醫藥配製品領域，具體涉及一種同時結合澱粉樣蛋白單體的多肽及其應用；本發明可應用於識別多種澱粉樣蛋白過渡態單體的抗體製備，澱粉樣蛋白疾病的診斷、治療和實驗研究。本發明提供一種同時結合澱粉樣蛋白單體的多肽(簡稱PEMX)，其胺基酸序列為Cys-Trp-His-Thr-Asp-Thr-Arg-Ser-Cys，或由上述的胺基酸序列經過取代、缺失、或添加一個或幾個胺基酸。本發明可以有效刺激機體產生與多種澱粉樣澱蛋白過渡態單體結合的特異性抗體，並且該抗體可以抑制澱粉樣蛋白的聚集和細胞毒性。
文檔編號C07K16/00GK102060911SQ20101055098
公開日2011年5月18日 申請日期2010年11月19日 優先權日2010年11月19日
發明者劉瑞田, 薛頔 申請人:清華大學