鉤端螺旋體病診斷試劑盒的製作方法

2023-07-18 19:50:06

專利名稱：：鉤端螺旋體病診斷試劑盒的製作方法
技術領域：
：本發明涉及一種鉤端螺旋體病(Leptospirosis)的診斷組合物，包括一種來自鉤端螺旋體脂多糖(LPS)的多糖；以及一個包括上述多糖的鉤端螺旋體病的診斷試劑盒；還有一個檢測螺旋體的特定抗體的方法，所述方法包括將所述多糖與生物樣品相互接觸以確認抗原-抗體複合物形成的步驟。現有技術鉤端螺旋體病是由一種螺旋體(^/rac/zefes)即問號鉤端螺旋體(Zepto^/ra/w敏raga;w)引起的傳染病。問號鉤端螺旋體可以感染人和動物。1887年鉤端螺旋體病首先被描述成一種伴隨黃疰和腎臟異常的嚴重發熱病，被命名為威爾氏病(Weil's疾病)。1918年，首次從威爾氏病患者中分離到了該細菌，並命名為黃疸出血性螺旋體(Sp/rac/z泥to/"erak^mon^flg/ae)，然後又淨皮命名為黃疽出血性鉤端螺J走體(Z印tosp/raz'"era/wemwr/wg/ae)。分類學上鉤端螺旋體屬於鉤端螺旋體科。根據致病性，鉤端螺旋體屬被分成問號(丄eptos;/raz'"&mgwra)和雙曲鉤端螺旋體(丄eptospz'/"aZi/ferai)。目前為止，已知致病性的問號鉤端螺旋體被分成19個血清群，包括約180種血清型。已知血清型的分布根據地理區域而變化。威爾氏病(或鉤端螺旋體病)是一種急性發熱病，第一階段其引起的典型症狀如發燒，頭疼，肌肉疼痛和疲勞無力，還可以引起更嚴重的症狀如器官出血，黃疸和腎衰竭。流行病學上，鉤端螺旋體病通過被感染動物(如鼠，牛，馬，豬等)的尿液傳播。當人們受傷的皮膚或黏膜表面如鼻子和嘴接觸到的土壤和水含有這些被感染動物尿液時，就會被感染。因此，主要的危險職業人群包括農民，屠宰場工人和戶外訓練的士兵。特別是水災後，洪水造成了大範圍的汙染，使感染人群的數量增加。已知鉤端螺旋體病會在歐洲，美洲，澳洲，越南，泰國，馬來西亞，臺灣，中國，曰本等國家和地區爆發。在1942年，韓國首先報導了具有血清學證據的鉤端螺旋體病患者，但之後就再沒有關於人鉤端螺旋體病感染的報導。在1984年，首先從咳血患者中分離到了鉤端螺旋體，從而證實了鉤端螺旋體病在韓國的存在。之後，在韓國鉤端螺旋體病和恙蟲病，出血熱腎病綜合症，鼠斑疹傷寒一起被定義為三類傳染病。同時，人們也研究了鉤端螺旋體病的診斷方法。韓國專利申請號1990-0000871公開了一種固相凝集實驗試劑，含有一個多價抗原I，一個多價抗原II和一個診斷鉤端螺旋體病的陽性對照血清。專利號為561687的韓國專利公開了一種包括一個重組蛋白的診斷試劑盒，該蛋白對問號鉤端螺旋體賴型HY10血清型具有特異性，韓國專利234876公開了一種利用免疫雜交的診斷試劑盒，它包括一個問號鉤端螺旋體的抗原。但是到目前為止，鉤端螺旋體病診斷方法研究成功的都是利用對鉤端螺旋體特異的蛋白的方法，其中，該診斷方法中所用的蛋白和顯微凝集試驗(MAT)中所用的抗原有一些差別。顯微凝集試驗是被WHO(世界健康組織)採用的標準的診斷方法。MAT法是利用脂多糖(LPS)組分中暴露在表面的一種多糖的方法，該多糖是鉤端螺旋體血清型特異的表面抗原。本發明的方法與標準方法即MAT法的原理相似，即採用了鉤端螺旋體屬的包含特異抗原的脂多糖中的一種多糖。因此，實現了對鉤端螺旋體病的準確的診斷，同時利用一種抗原就可以診斷鉤端螺旋體病的所有類型。MAT法與其它診斷方法相比的優勢就是診斷更準確，但是也有缺點，即很難保持並控制MAT法中所用的活菌。而且，MAT法需要昂貴的儀器，同時由於其複雜和艱難的過程，MAT法只能被高度熟練的專業人員來操作。因此，在醫院，MAT法幾乎沒有應用。所以本發明人致力於開發了一個簡單易用的鉤端螺旋體病診斷方法，從而完成了本發明。
發明內容技術方案因此，本發明的一個目的是提供一種來自鉤端螺旋體屬脂多糖的多糖作為鉤端螺旋體病診斷的新抗原，以及一種包括所述多糖的診斷鉤端螺旋體病的組合物。本發明的另一個目的是提供一種包括所述多糖的鉤端螺旋體病的診斷試劑盒，以及利用該試劑盒檢測鉤端螺旋體特異抗體的方法。圖1表示分離自雙曲鉤端螺旋體patoc血清型Patoc1菌抹和問號鉤端螺旋體賴型血清型多糖的SDS-PAGE(A)和蛋白質印跡法的結果，這可以解釋被純化的多糖的抗原性。圖2表示使用免疫層析法的鉤端螺旋體病診斷試紙條的結構。圖3表示診斷試劑盒對鉤端螺旋體病檢測的敏感性和特異性的結果。最佳實施方式在一個實施例中，本發明涉及一種鉤端螺旋體病的診斷組合物，包括一種來自鉤端螺旋體脂多糖(LPS)的多糖。本發明中使用的術語"診斷"的含義是對病理狀態和特徵的鑑定。對本發明目的而言，診斷就是對鉤端螺旋體病的鑑定。術語"鉤端螺旋體病"的含義是一種由屬於鉤端螺旋體屬的致病性螺旋體引起的疾病。鉤端螺旋體病的診斷通過直接從患者的血液，腦脊液和尿液中分離細菌或者檢測血清中的抗體來進行。在本發明的一個具體實施例中，鉤端螺旋體病的診斷是通過檢測血清中的抗體來實現的。一種來自鉤端螺旋體屬脂多糖的多糖，被用作檢測血清中抗體的方法中的抗原。本發明人通過western印跡和點雜交的方法證實從鉤端螺旋體屬脂多糖中分離出來的該多糖能夠作為鉤端螺旋體病診斷中的抗原。本發明人利用鉤端螺旋體病患者的血液進行了ELISA檢測，並證實鉤端螺旋體病患者的血清中存在的抗體利用本發明的多糖可以被顯著鑑定。術語"顯著性"指的是具有高度的正確性和可靠性。"高度正確性"指的是診斷的的結果是準確的，而"高度可靠性"指的是在重複的檢測中結果是一致的。當用MAT法診斷過的患者血清再用蛋白抗原的診斷方法檢測時，敏感性和特異性會稍微下降。但是，當MAT法中用本發明中的多糖作為抗原的時候，將比用蛋白抗原的方法得到更準確的診斷結果。為了檢測包括血漿，血清和全血等生物樣品中的鉤端螺旋體的抗體，釆用來自鉤端螺旋體脂多糖的一種多糖作為抗原。鉤端螺旋體的脂多糖(LPS)包括類脂A,核心多糖和0-特異側鏈。類脂A和核心多糖通過2-酮-3-脫氧辛酸(2-keto-3-deoxyoctanicacid，KDO)連接，核心多糖含有葡萄糖，半乳糖和N-乙醯葡萄糖胺。在本發明的一個具體實施例中，所述多糖對鉤端螺旋體屬有特異性，且含有O-特異側鏈和核心多糖，其中不含類脂A。採用上述多糖作為抗原可以增強抗原-抗體反應。在本發明的另一個實施例中，本發明涉及一種鉤端螺旋體病的診斷試劑盒，包括來自鉤端螺旋體脂多糖(LPS)中的所述多糖。這個試劑盒通過4企測生物樣品中的鉤端螺旋體抗體水平來診斷鉤端螺旋體病。這個試劑盒包括來自鉤端螺旋體脂多糖的所述多糖，它作為抗原與鉤端螺旋體抗體進行反應，來確認抗原-抗體複合物的形成。抗原-抗體複合物的形成可以通過免疫技術進行檢測，以western印跡，酶聯免疫檢測(ELISA),放射免疫檢測(RIA),放射免疫擴散法，Ouchterlony免疫雙擴散方法，火箭免疫電泳，免疫組織染色檢測，免疫沉澱法，補體結合檢測，免疫螢光檢測，免疫層析法和螢光激活細胞分檢儀(FACS)為例，但不限於此。本發明的鉤端螺旋體病診斷試劑盒包括與所述抗體特異性結合的上述多糖，和其它免疫分析中常用的工具，試劑或其類似物。這些工具或試劑包括合適的栽體，可以產生檢測信號的標記底物，增溶劑，去汙劑，緩衝試劑和穩定劑，但不限於此。本發明的診斷試劑盒可以是微平板，標尺(dip-stickdevice),免疫層析試紙條，徑向分離免疫測定裝置，流通裝置或其類似物。本發明的診斷試劑盒還包括標準的正對照和負對照。本發明的診斷試劑盒最好是利用免疫層析的試紙條型或裝置類型。採用免疫層析診斷中，生物樣品血清中的抗體與膠體金顆粒上的示蹤抗體反應，接著通過硝酸纖維素膜上微孔的毛細作用進行轉膜。轉膜過程中，抗體與與微孔內表面上的捕捉抗原結合，形成色帶，從而用眼睛確定檢測結果是陽性還是陰性。"示蹤抗體"指的是與有色顆粒結合，且能與鉤端螺旋體抗體反應的抗體。本發明的診斷試劑盒中，抗原-抗體複合物可以通過有色顆粒免疫實驗來檢測，其中有色顆粒可以是膠體金顆粒，有色玻璃珠或塑料(如，聚苯乙烯，聚丙烯，橡膠等)珠，優選膠體金顆粒。在一個具體實施例中，如圖2所示，用於檢測鉤端螺旋體抗體的鉤端螺旋體病診斷試劑盒包括一個吸收樣品的樣品墊；一個膠體金結合墊，其中含有可以與樣品中抗體結合的示蹤抗體；一個實驗膜，包括含有本發明的多糖的檢測線，含有對照蛋白的對照線和一個去除非特異性抗體的預檢測線；以及一個試紙條，該試紙條中含有吸附剩餘樣品的吸收墊。檢測線含有本發明的多糖濃度為0.5-2.5mg/ml,優選l-2mg/ml。對照線含有對照蛋白濃度為0.1-lmg/mI,優選0.1-0.2mg/ml，對照蛋白可以是兔抗羊IgG，和兔抗蛋白A。預檢測線含有如大腸桿菌和假單胞菌這些革蘭氏陰性菌脂多糖，其濃度為0.5-1mg/ml，其中脂多糖與本發明中的鉤端螺旋體的脂多糖結構相似。膠體金結合墊含有金標記的羊抗人IgM，金標記的羊抗人IgG,金標記的蛋白A或其類似物。採用免疫層析法用條帶型診斷試劑盒診斷鉤端螺旋體病的方法如下。首先，將待分析的生物樣品滴加到診斷試劑盒的樣品吸收墊上，樣品吸收墊是吸收樣品的部分。生物樣品通過毛細作用遷移到含有膠體金的墊上。這時，在含有膠體金的樣品墊中，樣品中的抗體與示蹤抗體如金標記的羊抗人IgM，金標記的羊抗人IgG或金標記的蛋白A結合，從而形成膠體。待分析的生物樣品不是固定在含有膠體金的樣品墊中，而是繼續遷移到檢測線，其中本發明的多糖抗原是固定化的。如果是來自感染鉤端螺旋體病患者的樣品，該樣品與多糖抗原反應來誘導抗原-抗體反應。也就是，鉤端螺旋體抗體與含有膠體金的樣品墊中的特定示蹤抗體結合，又與固定在檢測線中的多糖抗原結合，從而形成紫紅色的條帶。因此，所形成的條帶能用肉眼直接觀察。含有膠體金的樣品墊剩下的示蹤抗體沒有與生物樣品中的抗體反應，遷移到對照線以與對照蛋白反應形成紫紅色的條帶，從而確保實驗的一致性。如上所述，本發明的診斷試劑盒利用了抗原-抗體反應的免疫層析法進行。因此，任何設備都不需要，且結果可以直接用肉眼迅速觀察到。進而，診斷試劑盒的預檢測線去除任何可能的鉤端螺旋體抗體引起的誤診，從而提高鉤端螺旋體病診斷的準確性。在另一個實施例中，本發明涉及一個檢測鉤端螺旋體抗體的方法，包括一個檢測所述多糖與生物樣品接觸後形成的抗原-抗體複合物步驟。可以檢測鉤端螺旋體抗體的生物樣品的實例包括血液，血清和血漿，但不限於此。下文中，參考實施例詳細描述本發明。但是這些例子只是為了說明的目的，並且本發明不限於這些例子。具體實施例方式實施例1.鉤端螺旋體抗原的製備1-1.鉤端螺旋體菌林的培養EMJH(鉤端螺旋體培養基，基於EllinghausenMcCulloughHohnsonHarris)0.23g溶解於90ml水中，滅菌備用。加入10ml鉤端螺旋體富集的EMJH於上述培養基中，製備本發明所用的培養基。在上述製得的培養基中接種鉤端螺旋體，3(TC搖瓶培養5天。1-2.鉤端螺旋體抗原的製備鉤端螺旋體細菌在EMJH培養基中培養5天後，4000g離心20分鐘。沉澱用1PBS緩衝液(137mMNaCl，2.7mMKCl，10mMNa2HPO4，和2mMKH2P04)洗滌三次後，10(TC加熱1小時。加入150g/ml蛋白酶K,37。C反應16小時。加入EGTA至終濃度2mM,7(TC反應15分鐘後，180000g,4。C離心2小時。所得沉澱用水懸浮，即得到脂多糖(Westpha和Jann，1965)。純化的LPS抗原用1%醋酸處理後，IO(TC加熱1小時，然後3000g離心20分鐘。去除沉澱下來的類脂A，製得多糖抗原。製得的抗原用標準多糖進行定量檢測，其中所述標準多糖是用與上述相同方法從大腸桿菌(Sigma)的純化的脂多糖中製備的。實施例2:鉤端螺旋體多糖的抗原性分析2-1.Western印跡分析製備lmm或1.5mm厚的12%的SDS-PAGE凝膠，並利用Bio-RadII電泳儀進行SDS-PAGE。用Bio-Rad轉膜盒80V，30min使蛋白質從電泳凝膠轉移到膜上。膜用含有5%脫脂奶，0.1%吐溫-20的lxTBS緩衝液封閉。兔免疫血清(L.interrogansstrainWH-19)作為一抗，辣#過氧化物酶結合的抗兔IgG(Bio-Rad)稀釋10000倍後作為二抗。免疫反應完成後，用ECL試劑盒(AmershamPharmacia生物:忮術公司)進行免疫印跡。結果如圖1所示。如圖1所示，問號鉤端螺旋體賴血清型和雙曲鉤端螺旋體patoc血清型Patoc1菌林多糖的SDS-PAGE凝膠電泳圖非常相似。14KDa或更大位置的多糖出現在賴血清型和patoc血清型中。假定以上述多糖作為抗原。2-2.點雜交分析l嗎(l嗎/pl)抗原滴加到硝酸纖維膜上，37。C乾燥1小時。乾燥後的膜用含有5%脫脂奶的TBST封閉1小時，與作為一抗的患者血清(1:3,000稀釋)反應1小時，辣根過氧化物酶結合的抗人IgG(稀釋10000倍)作為二抗。免疫反應完成後，用ECL試劑盒進行免疫印跡，然後與MAT法的結果進行比較(表1)。結果顯示大多數患者血清都有陽性信號。表l.點雜交與MAT法結果比較tableseeoriginaldocumentpage82-3酶聯免疫檢測(ELISA)檢測在Engvall和Perlmann(1972)介紹的方法的基礎上進行多糖的ELISA檢測。聚-L-賴氨酸(10ng/ml)用0.01MPBS稀釋預處理微孔板，然後在室溫反應24小時。然後微孔板用含有0.05%吐溫-20的PBS緩衝液洗滌二次。所述多糖懸浮在PBS緩衝液中，每孔加入lOO(al處理微孔板。微孔板37。C反應1小時，然後用含有0.05%吐溫-20的PBS緩衝液洗滌三次。微孔板用羊血清在37。C進行封閉。來自20名鉤端螺旋體病患者和20名健康人的血清作為一抗，辣才艮過氧化物酶結合的抗人IgG(Bio-Rad)稀釋10000倍後作為二抗。每個孔都加入底物進行孵育，用酶標儀在490nm檢測每個孔的吸光度。結果顯示鉤端螺旋體鞭毛的重組蛋白有72-88%的靈敏性，88-95%的特異性；而本發明的多糖具有95%的靈敏性和95%的特異性。相應地，作為鉤端螺旋體病早期診斷的候選抗原，所述多糖好於上述蛋白(表2)。表2.ELISA的靈敏性和特異性tableseeoriginaldocumentpage9a:MAT法檢測的患者血清個數20b:正常血清數20實施例3.診斷試劑盒的生產3-1.鉤端螺旋體抗原(多糖)在硝酸纖維素膜上的固定化通過靜電相互作用，在硝酸纖維素(NC)膜(孔徑5nm)上固定特定抗原以捕捉特定抗體。用分布器以l)al/cm的速度，將純化的抗原(多糖)線形加到距硝酸纖維素膜條(5x25mm)底部lcm的地方，硝酸纖維素膜條背面有塑料背板，對照抗體(兔抗羊IgG或兔抗蛋白A)線性加到距硝酸纖維素膜條底部1.4cm的地方。硝酸纖維素膜在37。C乾燥1小時。以不同濃度的純化多糖進行實驗。結果，當抗原濃度為lmg/ml的時候檢測到的信號最強。濃度高於或低於lmg/ml檢測到的信號都減弱。因此，為了獲得最強的信號，需要足夠量的抗原去結合目標抗體。但是反應區域的抗原過量使得抗原-抗體反應需要的必要空間距離難得到。從而使得免疫粘著反應的機會減少。3-2.成線形用的抗原緩沖液吐溫-20影響抗原的非特異性反應。隨著其濃度的增加，信號強度減弱。但是為了去除交叉反應，必需加入吐溫-20溶液。；f企測了0.01,0.05和0.1%吐溫-20的效果。去除交叉反應最有效的濃度是0.05%。因此，吐溫-20的最適濃度為0.05%。3-3.預檢測線中使用的抗原的確定在抗原(多糖)產生非特異性信號的情況下，在抗原線前設置了預檢測線以去除非特異性抗體。然後，本發明中，鉤端螺旋體和其類似細菌(大腸桿菌，銅綠假單胞菌)的脂多糖分別單獨或一起使用。從結果來看，0.6mg/ml的大腸桿菌LPS是非常有效的。3-4.示蹤抗體-金絡合物在玻璃纖維上的沉積(1)玻璃纖維的選擇和預處理條件的確定羊抗人IgM((x-特異)膠體金偶聯溶液，羊抗人IgG(H+L)膠體金偶聯溶液，或用蛋白A標記的膠體金溶液，用50%海藻糖溶液(海藻糖終濃度5%)和蒸溜水稀釋到光密度為3。玻璃纖維膜(Millipore)浸入製備的上述溶液中，然後37。C乾燥2小時。然後將膜切成0.5cm寬的長條。(2)成線型膠體金偶聯體的量和乾燥條件的確定分析體統產生的特定信號強度的增加正比於所使用的膠體金與抗體結合的量。但是，如果膠體金-抗體結合物過量，測試樣品中相對低濃度抗體或非特異性抗體產生的非特異性信號會增加，從而產生假陽性結果。在本發明中，採用膠體金(40nm)標記的羊抗人IgM(n-特異)，膠體金(40nm)標記的羊抗人IgG(，特異)，膠體金(40nm)標記的羊抗人IgG(H+L)或膠體金(40nm)標記的蛋白A作為膠體金偶聯體。根據每種偶聯體的光密度進行比較實驗。IgG在所有的金偶聯體中都檢測的不好(表3)。這是因為LPS通常是一種T細胞非依賴型抗原。認為在免疫應答中，T細胞非依賴型抗原產生IgM，卻不產生IgG。因此，在鉤端螺旋體病檢測中，可以斷定IgM檢測比IgG檢測更重要(表3)。可以看到，對膠體金標記的IgM最適的光密度是3。表3.MAT法和診斷試劑盒結果的比較tableseeoriginaldocumentpage103-5.試紙條的製備設計的系統包括具有塑料背板的硝酸纖維素膜作為主要結構固定抗原，在硝酸纖維素膜較低的位置沉積有金偶聯體的玻璃纖維膜(偶聯體墊)，和位於硝酸纖維素膜兩端，彼此相連，吸附有過量溶液的纖維素膜(樣品墊和吸附墊)。玻璃纖維膜在系統較低的位置，由於其較高的吸附能力它不僅可以很快吸收樣品，而且可以通過延長其向上部遷移的保留時間，誘導待測材料和溶解的膠體金有效的反應。在免疫試紙條的中部，檢測待測材料的抗原(檢測線或捕捉線)和能檢測膠體金的特定抗體(對照線)分別被固定。而且纖維素膜位於免疫試紙條的上部(吸附墊)以快速吸附任何過多的樣品(圖2)。3-6.人血清濃度的確定人血清濃度實驗結果顯示，過量的血清可以引起非特異反應。以100nl血清進行測試，並稀釋到1/1000,1/100，1/50,1/10或lOOpl不稀釋的血清進行測試。結果血清稀釋到1/100可以得到最好的結果。3-7.快速診斷試劑盒的靈敏性和特異性為了確定鉤端螺旋體病診斷試劑盒的靈敏性和特異性，鉤端螺旋體病患者血清和其它發熱病(鼠型斑滲傷寒，出血熱腎病綜合症，恙蟲病)患者的血清作為樣品。6個鉤端螺旋體病患者血清用MAT法進行診斷。5分鐘後，6個血清全為陽性，因此IgM(一特異)的診斷靈敏性是100%(圖3)。用6個健康人的血清，3個鼠型斑滲傷寒患者的血清，4個恙蟲病患者的血清和6個出血熱腎病綜合症患者的血清進行交叉反應實驗，其特異性為95%(圖3)。3-8.在其它研究機構檢測實驗產品的效率的結果為了確定本發明的鉤端螺旋體病診斷試劑盒的靈敏性和特異性，從合作研究機構一翰林大學(HallymUniversity)獲得的鉤端螺旋體病患者血清和其它急性發熱病(鼠型斑滲傷寒，出血熱腎病綜合症，恙蟲病)患者的血清作為測試樣品。用MAT法檢測5個鉤端螺旋體病患者血清，5分鐘後，5個血清全為陽性。因此IgMOi-特異)的診斷靈敏性是100%(表4)。用10個健康人的血清，IO個鼠型斑滲傷寒患者的血清，恙蟲病患者的血清和出血熱腎病綜合症患者的血清進行交叉反應實驗，其特異性為95%(表4)。tableseeoriginaldocumentpage12a:血清稀釋倍數靈敏性5/5=100%在其它急性發熱病(鼠型斑滲傷寒，出血熱腎病綜合症，恙蟲病)中的特異性和健康對照19/20=95%工業實用性如上所述，本發明新抗原的應用可以實現對鉤端螺旋體病的準確，快速，簡便的診權利要求1.用於鉤端螺旋體病的診斷組合物，所述組合物包括來自鉤端螺旋體脂多糖的多糖。2.用於鉤端螺旋體病的診斷試劑盒，所述試劑盒包括權利要求l所述的組合物。3.根據權利要求2所述的診斷試劑盒，其中所述診斷試劑盒是採用免疫層析的試紙型，採用免疫層析的裝置型或微平板型。4.根據權利要求2所述的診斷試劑盒，其中通過有色顆粒免疫測定法檢測抗原-抗體複合物。5.—種檢測鉤端螺旋體抗體的方法，所述方法包括檢測由權利要求l中所述的組合物與生物樣品接觸後所形成的抗原-抗體複合物。6.根據權利要求5所述的方法，其中所迷的方法選自包含下列方法的組蛋白質印跡法，酶聯免疫吸附測定法，放射免疫檢測法，放射免疫擴散法，Ouchterlony免疫雙擴散法，火箭免疫電泳法，免疫組織染色法，免疫沉澱法，補體結合法，免疫螢光法，免疫層析法，和螢光激活細胞分檢儀。全文摘要本發明涉及一種診斷鉤端螺旋體病的組合物，所述組合物包括來自鉤端螺旋體脂多糖(LPS)中的一種多糖作為抗原；以及一個包括所述多糖的鉤端螺旋體病的診斷試劑盒。本發明的診斷試劑盒提供了一種早期，準確且簡便的鉤端螺旋體病診斷方法。文檔編號G01N33/53GK101600965SQ200780050927公開日2009年12月9日申請日期2007年3月30日優先權日2007年3月8日發明者卞容煥,張仁愛,李美貞,禹秀東,趙敏基,金允源,金泳辰,金真淑申請人:疫免美德有限公司