一種用於檸條降解的高活力複合酶製劑的製備方法
2023-07-18 16:46:01 1
專利名稱：一種用於檸條降解的高活力複合酶製劑的製備方法
技術領域：
本發明涉及木本飼料，特別是含有木質素和高含量粗纖維生產飼料，具體地說是一種用於木本飼料檸條降解的高活力複合酶製劑的製備方法。
背景技術：
我國畜牧業發展的主要限制因素之一為飼料的缺乏，特別是我國西部乾旱、半乾旱牧區更為嚴重。木本飼料是一種飼料資源，在畜牧業飼料中佔有重要的地位。與草本飼料相比，木本飼料含有較高的營養成分，特別是高蛋白營養和鈣含量，因此與草本飼料混合使用，可彌補蛋白的不足。另外木本飼料作為畜牧飼料用於冬季和早春缺草季節其發揮的作用更為明顯，可以很好地緩解此期間缺乏飼料的矛盾。
檸條是內蒙鄂爾多斯地區分布較廣的一種木本飼料，是具有潛力的牲畜飼料資源。但因其木質素及粗纖維素含量過高，影響了營養價值和適口性而沒能得到大量的開發和利用。
木質素是一類有機聚合物，廣泛分布與高等植物中，僅次於纖維素含量，木質素結構複雜，將纖維素和半纖維素「膠著」在一起，其包被作用嚴重阻礙纖維素降解，所以木質素降解是有效利用木質纖維原料的關鍵。纖維素的結構也較複雜，不溶於水，酶解時纖維素和酶必須直接接觸，只能依靠接觸過程中酶擴散到複雜的纖維素網結構中才能實現水解。在植物性飼料中，果膠是植物的細胞壁，它在動物消化道中形成凝膠物質，影響牲畜對營養物質的吸收，也是限制營養被利用的問題之一。
參與木質素降解的酶種類很多，其中漆酶是主要酶之一。纖維素酶可將植物體內的纖維素、半纖維素轉化為糖類，同時通過分解植物細胞，使細胞中的可溶性蛋白質、非蛋白氮化物、礦物質等內容物得以釋放。果膠酶可以將果膠質分解，從而消除對牲畜消化吸收營養物質的抑制。
要將檸條開發成鄂爾多斯的主要飼料資源，首先要生產出一種高活力的複合酶製劑。我國複合酶製劑的工業化生產還不成熟，酶製劑產業有待進一步發展，酶製劑產品仍存在酶活性低、成本高、利用率較低等情況，尤其在開發方面力量較為薄弱。
發明內容
為了使檸條飼料得到廣泛利用，解決上述酶製劑所現存問題，本發明的目的在於提供一種酶活性高、成本低的用於檸條降解的複合酶製劑的製備方法。
為實現上述目的，本發明採用的技術方案為採用的微生物為白腐菌，通過雙溫培養法進行固體產酶發酵，經由斜面培養，搖瓶擴大培養及新型固體培養基產酶固體發酵階段，製成高活力降解檸條的複合酶製劑，具體操作步驟如下(1)斜面培養在蔗糖土豆固體斜面培養基試管中接入彩絨革蓋菌，置28～35℃培養箱中，培養8～15天，得斜面孢子懸浮液；(2)搖瓶擴大培養在500毫升三角瓶中裝入100毫升蔗糖土豆培養液，接入孢子懸浮液，接種量為培養液體積的2～5％(V/V)，進行擴大培養，培養條件是在25～35℃，搖床轉速為120～150r/min，培養5～10天，得搖瓶孢子懸浮液；(3)固體發酵將固體培養基，經高壓滅菌後，按以5～10％搖瓶孢子懸浮液的量(V/W，即懸浮液體積/固體培養基重量)接種於固體培養基，而後採用雙溫培養法，將環境溼度控制在20～50％之間，自然通風補氧，即可製得複合酶製劑；其中所述的微生物白腐菌為彩絨革蓋菌(Coriolus versicolor)；斜面培養基上彩絨革蓋菌孢子是用無菌水洗下而製得；所述固體培養基的配方按重量百分比計，由8～15％玉米漿，20～35％麥麩，5～15％(NH4)2SO4及餘量的水分，經均勻混合製得；所述雙溫度培養法是指培養溫度分兩個階段，前一階段50～80小時期間內溫度控制在32～38℃，後一階段350～420小時期間內溫度控制在28～32℃之間，共培養400～500小時；所述雙溫度培養法是指培養溫度分兩個階段，前一階段60～70小時期間內溫度控制在35～37℃為佳，後一階段380～400小時期間內溫度控制在28～30℃之間，共培養440～470小時為佳。
本發明具有如下優點1.產酶活力較高，酶系均衡，對檸條的降解效果好。按本發明配方進行固體發酵生產的複合酶具有很高的漆酶、纖維素酶和果膠酶活性(其漆酶活經實測可達9.58U/g，濾紙酶活實測可達35.9mg葡萄糖/(gDM.h)，果膠酶活性實測可達29.55mg葡萄糖/(gDM.h)，此複合酶劑對木本植物纖維素有較強的降解能力，完全適合檸條類木質素較高的植物及作物秸杆、木材下腳料等飼料的生產。此外，採用雙溫度培養法，前期的高溫培養有利於菌絲體的生長，而後期的適當降溫培養，控制了菌絲體的生長速度，使發酵產酶過程延長，利於促進酶的產生。
2.成本低。本發明以檸條為牲畜飼料，進行開發利用為目標，在複合酶發酵原料的選擇上注重其價格，選擇廉價的麩皮為複合N、C源，以硫酸銨為無機N源，玉米漿為誘導物C源，具有來源廣泛，價格低廉的優點。本發明方法實現了發酵工藝條件優化，發酵生產過程簡單，易於掌握等優點，從而降低了產酶的成本，使檸條飼料的投產具有較強的市場競爭力。
3.對牲畜的生長具有安全性，本發明生產的複合酶製劑所使用的固體發酵物，對牲畜無毒無害，在具有安全性的同時，對營養物質有補充作用。對環境直接或間接都不造成汙染。本發明用於檸條飼料發酵生產(體外酶解)或直接拌和在檸條粉碎飼料中進行飼餵(體內酶解)，效果均良好。
具體實施例方式
下面通過實施例對本發明作進一步詳細說明。
實施例1(1)斜面培養在蔗糖土豆固體培養基(馬鈴薯20％，蔗糖2％，瓊脂2％，餘下為水)的試管中接入彩絨革蓋菌，置28℃培養箱中，培養10天；(2)孢子懸浮液製備將斜面培養基上的彩絨革蓋菌孢子用無菌水洗下，製得孢子懸浮液；(3)搖瓶擴大培養在裝有100毫升蔗糖土豆培養液(馬鈴薯20％，蔗糖2％，酵母膏1％，餘下為水)500毫升三角瓶中接入一斜面試管的孢子懸浮液，進行擴大培養，置28℃，轉速為130r/min搖床，培養8天，得搖瓶孢子懸浮液；(4)產酶固體發酵取上述固體培養基100g，經高壓滅菌後，接種4ml搖瓶孢子懸浮液，而後採用雙溫培養法，發酵440小時，前60小時恆溫在35℃，後380小時恆溫30℃，環境溼度控制在30％，自然通風補氧，即可製得高活力的複合酶製劑。其中固體培養基的配方為玉米漿10.8％麥麩27.7％，(NH4)2SO49.0％，水分52.5％，pH值自然，約6.4。
經上述步驟製得的複合固體酶製劑，其漆酶活經實測可達8.72U/g，濾紙酶活實測可達34.9mg葡萄糖/(gDM.h)，果膠酶活性實測可達25.3mg葡萄糖/(gDM.h)。
實施例2與實施例1不同之處在於在蔗糖土豆固體培養基的試管中接入彩絨革蓋菌，置30℃培養箱中，培養12天；在裝有100毫升蔗糖土豆培養液接入孢子懸浮液，擴大培養，置32℃，轉速為110r/min搖床，培養10天，得搖瓶孢子懸浮液；產酶固體發酵時，取固體培養基50g，接種2ml搖瓶孢子懸浮液，而後採用雙溫培養法，發酵470小時，前70小時恆溫在37℃，後400小時恆溫28℃，環境溼度控制在50％，即可製得高活力的複合酶製劑。其中固體培養基的配方為玉米漿15.0％麥麩23.5％，(NH4)2SO412.0％，水分49.5％，pH值自然，約6.4。
發酵後製得的複合固體酶製劑，其漆酶活經實測可達1.73U/g，濾紙酶活實測可達36.9mg葡萄糖/(gDM.h)，果膠酶活性實測可達33.8mg葡萄糖/(gDM.h)。
權利要求
1.一種用於檸條降解的高活力複合酶製劑的製備方法，其特徵在於將白腐菌的菌懸液接種於固體培養基上，而後採用雙溫培養法，將環境溼度控制在20～50％之間，自然通風補氧，即可製得複合酶製劑；按重量百分比計固體培養基的組成為，8～15％玉米漿，20～35％麥麩，5～15％(NH4)2SO4，餘量為水；雙溫度培養法是指培養溫度分兩個階段，前一階段53～80小時期間內溫度控制在32～38℃，後一階段350～420小時期間內溫度控制在28～32℃之間，共培養400～500小時。
2.按照權利要求1所述的製備方法，其特徵在於所述雙溫度培養法是指培養溫度分兩個階段，前一階段60～70小時期間內溫度控制在35～37℃為佳，後一階段380～400小時期間內溫度控制在28～30℃之間，共培養440～470小時。
3.按照權利要求1所述的製備方法，其特徵在於所述白腐菌的菌懸液是經由斜面培養、搖瓶擴大培養獲得，具體過程如下，(1)斜面培養在蔗糖土豆固體培養基試管中接入白腐菌孢子，置28～35℃培養箱中，培養8～15天，將斜面培養基上的白腐菌孢子用無菌水洗下，製得孢子懸浮液；(2)搖瓶擴大培養在三角瓶中裝入蔗糖土豆培養液，接入孢子懸浮液，接種量為2～5％，進行擴大培養，培養條件是在25～35℃，搖床轉速為120～150r/min，培養5～10天，得搖瓶孢子懸浮液，即白腐菌的菌懸液。
4.按照權利要求1、2或3所述的製備方法，其特徵在於所述白腐菌為彩絨革蓋菌。
全文摘要
本發明涉及木本飼料，特別是含有木質素和高含量粗纖維生產飼料，具體地說是一種用於木本飼料檸條降解的高活力複合酶製劑的製備方法，將白腐菌的菌懸液接種於固體培養基上，而後採用雙溫培養法，在環境溼度20～50％，自然通風補氧條件下，即可製得複合酶製劑；固體培養基組成為，8～15％玉米漿，20～35％麥麩，5～15％(NH
文檔編號A23K1/00GK1724656SQ20041002154
公開日2006年1月25日 申請日期2004年7月23日 優先權日2004年7月23日
發明者李培軍, 許華夏, 張海榮, 靖德兵, 張春桂, 寇振武, 丁建國, 李穎梅 申請人:中國科學院瀋陽應用生態研究所